LAPORAN PRAKTIKUM BIOINFORMATIKA
DESIGN PICK PRIMER MENGGUNAKAN PRIMER3PLUS, PRIMERQUEST DAN
PERLPRIMER
Nama : Baital Izzatul Badriyah
NIM : 0910910001
Tanggal Praktikum : 29 Maret 2012
LABORATORIUM BIOLOGI KOMPUTASI
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2012
BAB III
METODE PRAKTIKUM
3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum Bioinformatika yang berjudul Design Pick Primer Menggunakan Primer3Plus,
PrimerQuest dan PerlPrimer ini dilaksanakan hari Kamis, 29 Maret 2012, pukul 15.10-17.00
WIB dan bertempat di Laboratorium Biologi Komputasi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang.
3.2 Cara Kerja
3.2.1 Design Pick Primer Menggunakan Primer 3 Plus
- Langkah-langkah membut design pick primer menggunakan Primer3Plus, yaitu
diketikan keyword primer3plus pada jendela browsing Google>search, atau
dapat pula diakses melalui www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus.cgi.
Selanjutnya akan muncul kotak dialog seperti pada kotak dialog berikut.
-
- Untuk memulai mendesain primer dengan Primer3Plus ini, dapat dilakukan dengan cara
mengcopy format FASTA sekuens nukleotida dari spesies yang diinginkan (dalam hal
ini digunakan sekuens nukleotida S. purpuratus late histone H1-
beta gene, complete cds) ke dalam paste source sequence below, seperti yang
terlihat pada kotak dialog berikut.
- Sekuens dalam format FASTA yang telah dicopy dari genebank NCBI, kemudian
dipaste pada kolom yang telah tersedia pada Primer3Plus. Selanjutnya, ditentukan
beberapa parameter yang dibutuhkan terutama daerah target yang ingin diamplifikasi,
dimana primer (forward maupun reverse) harus mengapit daerah ini; excluded region
yang merupakan daerah dimana primer tidak boleh menempel; serta included region
yagmana kedua primer harus berada di dalam daerah ini. Langkah-langkah ini dapat
dilihat pada kotak dialog berikut.
Ditentukan target
yang diinginkan
Dicopy
Dipaste sekuens
FASTA dari NCBI
Pengaturan daerah
penempelan primer
Dapat juga mengupload
sekuens menggunakan ini
- Agar diperoleh primer yang memenuhi kriteria yang baik dan benar dan dapat
digunakan dalam PCR, maka perlu dilakukan pengaturan terhadap primer yag ingin
dihasilkan yaitu dengan mengklik General Setting, selanjutnya dilakukan pengaturan
yang meliputi ukuran primer, Tm, %GC, dll, seperti yang tampak pada kotak dialog
berikut.
3.2.2 Design Pick Primer Menggunakan PrimerQuest
- Design primer untuk PCR juga dapat dilakukan menggunakan PrimerQuest. Langkah-
langkah membut design pick primer menggunakan PrimerQuest, yaitu diketikan
keyword primerquest pada jendela browsing Google>search, atau dapat pula diakses
melalui eu.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest/default.aspx, maka selanjutnya
akan muncul kotak dialog seperti berikut. Pada halama tersebut dimasukkan kode pada
NCBI ID dari sekuens yang ingin didesign primernya, selanjutnya diklik Get Sequence.
- Setelah sekuens nukleotid dimasukkan ke dalam kolom yang sudah disediakan pada
PrimerQuest, maka selanjutnya ditentukan design primer sesuai dengan kebutuhan
pada Design for dan Use Parameter Set > diklik calculate, seperti yang terihat pada
kotak dialog berikut.
- Hasil yang muncul setelah dilakukan beberapa langkah dalam prosedur yang telah
dijelaskan diatas, maka pada jendela PrimerQuest akan muncul hasil dari design primer
dari sekuens yang ingin dibuat design primernya (dalam hal ini digunakan sekuens
nukleotida dari S. purpuratus late histone H1-beta gene, complete cds. Pada
pasangan-pasangan primer yang telah diperoleh dari pengaturan awal yang dilakukan,
selanjutnya diklik Set Detail untuk mengetahui letak forward primer maupun reverse
primer pada sekuens nukleotida spesies yang digunakan. Selain dapat diketahui secara
detail mengenai letak forward maupun reverse primer, dapat pula diketahui terjadinya
hairpin pada pasangan primer tersebut dengan cara diklik Hairpin, baik pada forward
primer maupun reverse primer. Langkah-langkah dalam melaksanakan prosedur ini
dapat dilihat pada kotak dialog berikut.
Dipilih sesuai
dengan dengan
design yang
diinginkan
Pasangan
primer 1
Pasangan
primer 2
Pasangan
primer 3
Pasangan
primer 4
Melalui PrimerQuest dalam membuat design primer, dapat pula dilihat BLAST dari
sekuens referensi yag dipilih (dalam hal ini S. purpuratus late histone H1-
beta gene, complete cds.). Secara otomatis, PrimerQuest dapat tesambung dengan genebank
NCBI untuk menampilkan BLAST dari sekuens referensi tersebut.
3.2.3 Design Pick Primer Menggunakan Perl Primer
- Design primer untuk PCR juga dapat dilakukan menggunakan PerlPrimer. Langkah-
langkah membut design pick primer menggunakan Perl Primer, yaitu dibuka software
PerlPrimer, maka selanjutnya akan muncul kotak dialog seperti berikut. Pada halaman
Pasangan
primer 5
tersebut dimasukkan format FASTA dari sekuens referensi dalam hal ini digunakan (S.
purpuratus late histone H1-beta gene, complete cds).
- Selanjutnya, dilakukan pengaturan primer yang ingin dibuat, meliputi Primer Tm, Primer
Lenght, dst., seperti yang terlihat pada kotak dialog berikut.
Sekuens referensi
yang ingin dibuat
primernya
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Design Pick Primer Menggunakan Primer3Plus
Berdasarkan design pick primer menggunakan Primer3Plus, dengan memasukkan
sekuens referensi suatu spesies yang diambil dari NCBI, maka diperoleh beberapa design
primer (dalam hal ini diperoleh 5 pasang design primer) yang dapat dilihat pada kotak dialog
berikut.
Pasangan primer 1
Reverse
primer
Forward
primer
Amplikon
Forward primer
Reverse primer
Berdasarkan pada pasangan primer 1 yang ditampilkan dalam kotak dialog pada halaman
sebelumnya dapat diketahui bahwa, forward primer dari pasangan primer 1 memiliki panjang
nukleotida sebanyak 21 bp, suhu melting Tm 58.70C, %GC 42.9%, ANY 4.0, serta self
complementarity 2.0. Forward primer ini kurang memenuhi kriteria sebagai primer yang baik
dan benar untuk digunakan dalam PCR, hal ini dapat dilihat dari panjang nukleotida yang
berada diantara 18-22 bp, namun memiliki Tm di bawah 60-650C, serta %GC di bawah 45-60%.
Reverse primer dari pasangan primer 1 ini memilki panjag nukleotida sebanyak 20bp, Tm
61.40C, %GC 50.0%, ANY 7.0, serta self complementarity 3.0. Reverse primer ini telah
memenuhi kriteria sebagai primer yang baik dan benar untuk digunakan dalam PCR, hal ini
dapat dilihat dari panjang nukleotida yang berada diantara 18-22 bp, Tm diantara 60-650C,
serta %GC diantara 45-60%. Selain informasi mengenai pasangan primer 1 yang dijelaskan
secara detail, dapat diketahui pula informasi mengenai pasangan primer lain yang dihasilkan
dari design primer yang diperoleh dari sekuens nukleotida yang diinginkan untuk dibuat
primernya. Informasi secara rinci dari pasangan-pasangan primer dapat dilihat pada kotak-
kotak dialog berikut.
Pasangan primer 2
Pasangan primer 3
Pasangan primer 4
3.2.1 Design Pick Primer Menggunakan Perl Primer
Primer3Plus memiliki beberapa kelebihan, diantaranya memiliki tampilan yang sangat
sederhana, namun kemampuannya sudah teruji dan digunakan oleh banyak peneliti di seluruh
dunia (Science Biotech, 2012). Primer3Plus juga memberikan beberapa alternatif pasangan
primer yang dapat dipilih (Rybicky, 2001)
4.2 Design Pick Primer Menggunakan PrimerQuest
Design primer dengan menggunakan PrimerQuest juga tidak jauh berbeda dengan design
primer yang diperoleh menggunakan Primer3Plus, namun pada PrimerQuest informasi yang
disajikan lebih lengkap dibandingkan pada Primer3Plus. PrimerQuest menyajikan informasi
mengenai terjadinya Hairpin pada pasangan primer yang diperoleh dari hasil design primer
yang telah dilakukan.
Kotak dialog di atas menunjukkan informasi umum mengenai pasangan primer yang
dihasilkan. Berdasarkan informasi yang ditampilkan, dapat dilihat kode sekuens pada
Sequence Name, yaitu ACC M20314.1; tanggal dilakukan design primer; serta panjang
nukleotida dari sekuens yang dijadikan referensi (dalam hal ini digunakan S.
Pasangan primer 5
purpuratus late histone H1-beta gene, complete cds.), yaitu sebanyak 1698 bp yang dapat
dilihat pula pada grafik yang ditampilkan dibawahnya (ditunjukkan oleh garis tebal berwarna
hijau, yang artinya garis hijau tersebut termasuk dalam Included Region).
Berdasarkan hasil design primer menggunakan PrimerQuest yang ditampilkan pada kotak
dialog di atas dapat diketahui bahwa, forward primer pasangan primer 1 memiliki panjang
sekuens 24 bp, start kodon terletak pada basa ke-700, Tm sebesar 59.90C, %GC 50.0%, dst.
Berdasarkan syarat primer yang baik dan benar untuk digunakan dalam PCR, dapat dilihat
bahwa forward primer pasangan primer 1 tersebut kurang memenuhi syarat primer yang benar
karena memiliki panjang primer yang lebih dari panjang primer yang baik, yaitu antara 18-22 bp.
Selain itu, forward primer tersebut juga memiliki Tm dibawah batas primer yang baik, yaitu
antara 60-650C, namun primer tersebut memiliki %GC yang memenuhi syarat pembuatan
primer yang baik, yaitu berada diantara 45-60%. Informasi lain yang dapat diperoleh yaitu
mengenai reverse primer pasangan primer 1 yang menunjukkan primer ini dimulai dari basa ke-
1367, memilki panjang primer sebanyak 24 bp, Tm (Melting Temperature) 59.80C, %GC 50.0%,
dst. Berdasarkan syarat primer yang baik dan benar untuk digunakan dalam PCR, dapat dilihat
bahwa reverse primer pasangan primer 1 tersebut juga kurang memenuhi syarat primer yang
benar karena memiliki panjang primer yang lebih dari panjang primer yang baik, yaitu antara
18-22 bp, memiliki Tm dibawah batas primer yang baik, yaitu antara 60-650C, namun primer
tersebut memiliki %GC yang memenuhi syarat pembuatan primer yang baik, yaitu berada
diantara 45-60%.
Selain informasi yang telah dijelaskan di atas dapat diketahui pula informasi mengenai
produk hasil PCR yang diperoleh jika menggunkan pasangan primer yang telah diperoleh dari
hasil desain, seperti yang terlihat pada kotak dialog di atasmengenai pasangan primer 1 yang
menghasilkan produk sebanyak 668 bp. Informasi secara detail dari pasangan-pasangan primer
lain yang diperoleh dari penggunaan PrimerQuest dalam mendesain primer dapat dilihat pada
kotak-kotak dialog yang ditampilkan berikut.
Pasangan
primer 1
Letak forward dan
reverse primer pada
sekuens
Pasangan
primer 2
Pasangan
primer 3
Letak forward dan
reverse primer pada
sekuens
Letak forward dan
reverse primer pada
sekuens
Setelah diklik pada Set Detail pada pasangan primer yang ingin diketahui informasi lebih
terperinci baik forward maupun reverse primer, maka akan diperoleh informasi letak baik
forward maupun reverse primer pada sekuens referensi yang dirujuk untuk dibuat primernya,
hal ini dapat dilihat pada kotak dialog berikut.
Pasangan
primer 4
Pasangan
primer 5
Letak forward dan
reverse primer pada
sekuens
Letak forward dan
reverse primer pada
sekuens
Selain informasi lebih detail mengenai letak forward maupun reverse primer dari
pasangan primer 1 seperti yang telah ditampilakan pada kotak dialog di atas, dapat pula
diketahui terjadinya hairpin pada primer yang dihasilkan dari design menggunakan
PrimerQuest, hal ini dapat dilihat pada kotak dialog berikut.
Forward primer
pasangan primer 1
Reverse primer
pasangan primer 1
Amplicon
Berdasarkan kotak dialog di atas dapat diketahui bahwa, forward primer pasangan primer
1 memiliki dua struktur hairpin yang dapat terjadi pada primer tersebut. Hal ini dapat
disebabkan karena primer ini tidak sepenuhnya memenuhi syarat pembuatan design primer
yang baik dan benar, sehingga saat menempel pada sekuens template akan mengalami 2
bentuk haipin, seperti yang terlihat pada kotak-kotak dialog di bawah ini.
Struktur hairpin II
forward primer 1
Struktur hairpin I
forward primer 1
Menurut Clark (2005) hairpins terbentuk akibat interaksi intramolekuler primer sehingga
membentuk semacam lipatan. Biasanya hairpin ujung 3′ dengan ΔG-2 kcal/mol dan hairpin
internal dengan ΔG -3 kcal/mol masih dapat ditoleransi.ΔG atau energi bebas Gibbs adalah
ukuran jumlah kerja yang dapat diekstrak dari sebuah proses yang terjadi pada tekanan tetap.
Ini merupakan ukuran kespontanan reaksi. Stabilitas hairpin biasanya direpresentasikan oleh
nilai ΔG-nya, yaitu energi yang diperlukan untuk mengurai struktur sekunder. Semakin negatif
nilai ΔG maka semakin stabil ia, tentu tidak kita inginkan. Adanya hairpin pada ujung 3′ sangat
mempengaruhi reaksi.
4.3 Design Pick Primer Menggunakan Perl Primer
Design primer dengan menggunakan Perl Primer juga tidak jauh berbeda dengan design
primer yang diperoleh menggunakan Primer3Plus dan PrimerQuest. Perl Primer menyajikan
informasi yang lebih detail dibandingkan pada Primer3Plus, namun PerlPrimer ini masih lebih
sulit dalam pengaturan pembuatan design primer yang diinginkan. Pasangan primer yang
diperoleh dari design primer menggunakan PerlPrimer ini dapat dilihat pada kotak dialog
berikut.
Struktur hairpin
reverse primer 1
Berdasarkan kotak dialog yang disajikan di atas dapat diketahui primer-primer yang
diperoleh dari hasil design primer menggunakan perlprimer. Selain itu, jumlah primer yang
diperoleh juga dapat dilihat pada bagian bawah kotak dialog di atas yang ditunjuk oleh tanda
panah merah, yaitu sebanyak 208 pasangan primer.
Berdasarkan hasil design primer menggunakan PerlPrimer yang ditunjukkan pada kotak
dialog sebelumnya dapat dilihat informasi mengenai primer yang diperoleh, baik forward primer
Forward primer
Reverse primer
Dimer pasangan
primer 1
Jumlah primer yang dihasilkan
Primer yang diperoleh dari sekuens
referensi
maupun reverse. Pasangan primer yang baik ditunjukkan oleh munculnya tanda None saat
diklik dua kali pada pasangan primer. Jika pada kolom Dimer ditunjukkan pasangan primer
yang mengalami dimer.
PerlPrimer memiliki beberapa kelebihan, yaitu merupakan software yang dapat diguanakn
untuk mendesain secara mudah dan otomatis primer untuk standard PCR, bisulphite PCR,
real-time PCR (QPCR) dan sekuensing, software yang yang dikembangkan dengan bahasa
Perl dan Perl/TK untuk tampilannya sehingga bisa dijalankan di MacOSX, Linux dan Windows,
saat ini versi terakhir dari PerlPrimer adalah 1.1.17. Proses insatalasi PerlPrimer ini tergantung
sistem operasi yang digunakan, PerlPrimer menyediakan paket instalasi untuk sistem operasi
Mac, Linux dan Windows dengan proses intalasi yang tidak rumit, paket instalasi bisa di unduh
disini (Science Biotech, 2012).
Kelebihan lain yang dimiliki oleh PerlPrimer, yaitu dapat menghitung kemungkinan primer
dimmers yang terbentuk, dapat mendownload langsung sekuen genom atau cDNA dari
Ensembl, dapat langsung melakukan BLAST ke server NCBI atau server lokal (Mullis, 1993).
Hasil dari desain perimer dapat di simpan, atau di eksport ke format tab-delimited sehingga bisa
dibuka oleh aplikasi spreadsheet standar (OpenOffice, Microsoft Office) (David, 2005).
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Setelah dilakukan praktikum ini dapat disimpulkan bahwa, ketiga jenis media atau
software yang digunakan untuk mendesain primer, yaitu Primer3Plus, PrimerQuest maupun
perlPrimer memiliki kelebihan dan kelemahan masing-masing. Diantara ketiga jenis software
yang digunakan, PrimerQuest merupakan media online yang memiliki kelebihan yang lebih
banyak dalam membuat design primer. PrimerQuest menyediakan fitur yang dapat
menunjukkan informasi yang lebih banyak mengenai primer yang diperoleh dari hasil design
primer (misalnya struktur haipins) dibandingkan dengan kedua software lainnya, yaitu
Primer3plus dan PerlPrimer.
5.2 Saran
Praktikum telah berjalan dengan lancar, namun sebaiknya saat dilakukan tentoring
kelompok, semua anggota kelompok diberi kesempatan untuk melakukan tentoring. Sehingga,
semua anggota kelompok memiliki pengalaman yang sama dalam menjelaskan suatu program
di depan kelas praktikum.
DAFTAR PUSTAKA
Clark, D. P. 2005. Molecular Biology : Understanding the Genetic Evolution. California: Elsevier
Inc.
David, N. G. 2005. Molecular Technique Lecture Note 2005. http://www.biotech ubc.ca. Diakses
tanggal 1 April 2012
Mullis. 1993. DNA & PCR. http:// www. science-projects.com /onionDNA.htm. Diakses tanggal
27 Maret 2012
Rybicky, E. 2001. PCR Primer Design and Reaction Optimalization.http://www.
meb.vct.ac.2a/ed.htm. Diakses tanggal 1 April 2012
Science Biotech. 2012. Yuk Mendesain Primer Dengan PerlPrimer. http://sciencebiotech.net/
yuk-mendesain-primer-dengan-perlprimer/. Diakses tanggal 1 April 2012
Science Biotech. 2012. Yuk Mendesain Primer Dengan Primer3Plus. http://sciencebiotech.net/
yuk-mendesain-primer-dengan-primer3plus/. Diakses tanggal 1 April 2012