Download - Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
1/25
LAPORAN
PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI
Acara II
(Teknik Aseptik)
Oleh
Winda !i Ast"ti
NIM# $$%&$%$'%$'
Pr*ra+ ,t"di Pendidikan Bil*i
LABORATORIUM KULTUR -ARINGAN TUMBU.AN
-URU,AN BUIA/A PERTANIAN
0AKULTA, PERTANIAN
UNI1ER,ITA, -EMBER
&%$2
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
2/25
BAB $# PENA.ULUAN
$#$ Latar Belakan*
Pada dasarnya bahwa banyak kita ketahui bahwa dalam setiap
laboratorium terdapat banyak sekali kontaminasi yang terjadi. Hal ini
dikarenakan mikroorganisme ada dimana-mana. Namun kita tidak pernah
menyadari keberadaannya. Bakteri dapat ditemukan pada tangan kita yang tidak
tampak jika dilihat dengan mata telanjang. Jamur yang berasal dari saluran udara
AC dengan pintu yang terbuka. Ineksi dari kedua nya dapat menyerang media
atau serum yang steril. !arena itu laboratorium yang sangat sering digunakan
untuk berbagai penelitian dan praktikum yang diantaranya praktikum kultur
jaringan perlu adanya upaya untuk men"apai keberhasilan.
#alam keberhasilan praktikum kultur in $itro membutuhkan tidak adanya
kontaminasi mikroba yang terjadi dengan adanya upaya untuk selalu steril selama
pelaksanaanya. %paya untuk steril tidak hanya diperuntukkan hanya mediumnya
yang steril namun juga ruang kerja& eksplan yang digunakan dan juga
praktikan. 'leh karena itu& untuk menjamin semuanya steril sebelum memulai
suatu praktikum maka dilakukan suatu teknik aseptik. Prosedur kontrol
pada teknik ini adalah kualitas yang akan memastikan bahwa dalam praktikum
tersebut memang dilakukan dengan aseptik& teknik yang mengutamakan tidak
adanya kontaminasi.
(ehingga sebagian besar praktikum kultur jaringan selalu dilakukan
dengan menggunakan alat sterilisasi dengan bantuan Auto"la$e untuk
mensterilkan alat dan bahan serta medium yang telah dibuat beserta )aminar Air
*low +)A*, yang selalu digunakan untuk menjaga kesterilan ruang kerja dalam
proses menanam. Praktikum kultur jaringan yang bera"arakan teknik asepti" ini
dilaksanakan yang salah satunya guna mengetahui beberapa proses sterilisasi yaitu
sterilisasi ruang kerja dengan prinsip kerja )aminar Air *low +)A*,& sterilisasi
alat dan media dengan prinsip kerja Auto"la$e yang sering dipergunakan dalam
setiap praktikum dan sterilisasi bahan tanam yang akan digunakan sebagai eksplan
sebelum ditanam pada medium. 'leh karena itu dilakukan pengamatan dengan
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
3/25
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
4/25
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
5/25
Namun biasanya masalah lain atau kendala teknis yang sering mun"ul
adalah tanaman hasil kultur jaringan sering berbeda dengan tanaman induknya
atau mengalami mutasi. utasi dapat disebabkan metode perbanyakan& jenis dan
konsentrasi 4at pengatur tumbuh yang digunakan& penggunaan kumpulan sel
somatik yang memang berbeda se"ara genetis pada tanaman induknya& rekuensi
pemindahan biakan pada media baru& dan tipe jaringan yang digunakan +ayta&
/112,. Hal ini dapat terjadi karena penggunaan metode perbanyakan yang sering
tidak sesuai& seperti rekuensi subkultur yang terlalu tinggi& perbanyakan melalui
organogenesis yang tidak langsung +melalui ase kalus, atau konsentrasi 4at
pengatur tumbuh yang digunakan terlalu tinggi. (elain itu aklimatisasi yang
berupa adaptasi tanaman hasil kultur jaringan pada lingkungan yang baru diluar
botol se"ara in vivo sering mengalami kegagalan. (terilisasi bahan tanam yang
digunakan dan kontaminasi yang terjadi pada biakan karena lingkungan yang
kurang memadai +ariska et al.& 22/ dalam buku yang dikarang oleh #eden&
/110,.
!arena se"ara umum& produksi bibit melalui metode kultur jaringan
memerlukan beberapa tahap& yaitu penyediaan bahan tanaman +eksplan, dari
induk terpilih& proses sterilisasi eksplan yang akan ditanam pada media yang akan
d inisiasi& penanaman pada media untuk penggandaan atau multiplikasi tunas&
penanaman pada media untuk perakaran atau pembentukan planlet& dan
aklimatisasi +urashige& 2567 8eorge dan (herrington& 296 dalam :a4id&
/11,. Pada salah satu metode perbanyakan tanaman yang umumnya tidak
dilakukan tahap multiplikasi tunas dan perakaran tetapi diganti menjadi tahap
induksi tunas dan elongasi& sedangkan tahap perakaran dilakukan pada saataklimatisasi. etode ini "ukup sederhana dan mirip dengan "ara perbanyakan
dengan stek se"ara kon$ensional. 'leh karena itu& metode perbanyakan ini sering
disebut se"ara stek mikro. !euntungan penggunaan metode ini adalah tanaman
yang dihasilkan stabil se"ara geneti" +Nur Ajijah& /11,.
Persiapan Bahan 3anaman menjadi salah satu kun"i keberhasilan untuk
mendapatkan bahan tanaman yang responsi dan dapat diperbanyak se"ara kultur
in vitro adalah bahan tanaman yang masih muda. %ntuk tanaman kehutanan atau
tanaman tahunan lainnya daya tumbuh bahan yang akan ditanam sangat
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
6/25
diperhatikan +ariska dan Purnamaningsih& /11 dalam #eden& /110,. #aya
tumbuh tunas muda akan hilang se"ara isik apabila jarak antara ujung tunas dan
akar semakin jauh karena pertumbuhan +8eorge dan (herrington& 296 dalam
Nugraha& /10,.
Pada tanaman tahunan dewasa& tunas muda yang memiliki daya tumbuh
tinggi +ju$enil, sering mun"ul pada bagian tanaman yang dekat dengan tanah atau
sering disebut tunas air. 3unas ju$enil dari tanaman berkayu tahunan dewasa yang
akan digunakan sebagai bahan tanaman untuk kultur jaringan& juga dapat
diperoleh dengan "ara melakukan pemangkasan berat. 3unas yang mun"ul setelah
pemangkasan dapat digunakan sebagai bahan tanaman. (elain itu& ase ju$enil
kadang-kadang dapat juga diinduksi dengan "ara melakukan penyemprotan
tanaman dewasa dengan 8A0 atau "ampuran antara auksin dan 8A0 +8eorge dan
(herrington& 296 dalam #eden& /110,.
%ntuk memudahkan proses sterilisasi bahan tanaman& sangat dianjurkan
bahwa tanaman induk berada atau ditanam di kamar ka"a. !eberadaan tanaman
induk di kamar ka"a memudahkan perlakuan penyemprotan dengan ungisida dan
bakterisida se"ara periodik sehingga dapat mengurangi tingkat kontaminasi bahan
tanaman yang akan disterilisasi. (terilisasi bahan tanaman dan inisiasi kultur
dilakukan se"ara aseptik. (terilisasi bahan tanaman +eksplan, merupakan langkah
awal yang "ukup penting dan dapat menentukan keberhasilan penanaman se"ara
in vitro. ;ksplan yang akan ditanam pada media tumbuh harus bebas dari
mikroorganisme kontaminan. 3ahap sterilisasi sering menjadi kendala utama
keberhasilan perbanyakan tanaman se"ara in vitro. 3erlebih iklim tropis seperti
Indonesia yang memungkinkan kontaminan seperti "endawan dan bakteri terus
tumbuh sepanjang tahun. %ntuk tanaman tertentu& sterilisasi sulit dilakukan
karena kontaminan berada pada bagian internal dari jaringan tanaman +Patoni&
/1/,.
(terilisasi eksplan biasanya dilakukan dengan merendam bahan tanaman
dalam larutan kimia sistemik pada konsentrasi dan waktu perendaman tertentu&
baik dengan menggunakan satu ma"am maupun dengan ma"am-ma"am sterilan.
Bahan-bahan yang biasanya digunakan untuk sterilisasi antara lain alkohol&
natrium hipoklorit +Na'Cl,& kalsium hipoklorit atau kaporit +Ca'Cl,& sublimat
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
7/25
+HgCl/,& dan hidrogen peroksida +H/'/, +ariska& /110,. Jenis bahan&
konsentrasi& dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi bahan tanaman yang
disajikan pada tabel .
+(umber< ariska& /110,
Cara lain yang digunakan dalam sterilisasi eksplan atau bahan tanam yang
pertama eksplan di"u"i dengan deterjen atau bahan pen"u"i lain& selanjutnya
direndam dalam bahan-bahan sterilan baik yang bersiat sistemik atau desinektan.
Bahan-bahan yang biasa digunakan untuk sterilisasi antara lain "loro=& kaporit
atau sublimat. 3unas yang akan digunakan sebagai eksplan di"u"i dengan deterjen
sampai benar-benar bersih. (etelah itu& tunas diambil dari rimpang dan direndam
berturut-turut dalam benlate +1&>?, selama > menit& alkohol +51?, selama >
menit& "loro= +/1?, selama /1 menit& dan HgCl/ +1&/?, selama > menit.
Akhirnya eksplan dibilas dengan a@uades steril +0-> kali, sampai larutan bahan
kimia hilang. #engan perlakuan tersebut& 91-21? eksplan yang disterilkan tidak
terkontaminasi setelah dikulturkan +ariska& /110,.
Apabila kontaminan tetap ada maka konsentrasi dan lamanya perendaman
sterilan dapat ditingkatkan. Bahan yang digunakan serta metode sterilisasi biasanya berbeda untuk setiap bahan tanaman& sehingga bahan dan "ara tersebut
belum tentu berhasil apabila diaplikasikan pada bahan yang berbeda serta waktu
yang berlainan. (ehingga bahan tanam tertentu memiliki "ara yang berbeda antara
satu sama lain +ayta& /112,.
'leh karena itu baik media maupun eksplan yang akan digunakan harus
selalu dalam keadaan steril. (ehingga pada tahap persiapan& sebelum digunakan
semua peralatan yang akan digunakan di"u"i dengan menggunakan deterjen dan
larutan pemutih atau Bay"lin& membilasnya sampai bersih dan kemudian
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
8/25
disterilisasi menggunakan o$en atau auto"la$e. Bahan atau alat yang lain adalah
tutup botol plastik& peralatan gelas& peralatan diseksi& pipet& air murni& dan media
kultur untuk mendapatkan perlakuan sesuai dengan jenis alatnya. (emua peralatan
diseksi dibungkus dengan menggunakan kertas "oklat atau kertas merang dan juga
!oran sebelum diautokla$. Aluminium oil tidak direkomendasikan untuk
membungkusnya dikarena uapnya tidak dapat menembus pembungkus.
(ebelumnya kondisi autokla$ diatur pada temperatur yang digunakan untuk
sterilisasi dengan autokla dengan suhu /oC serta tekanan >-5&> psi selama
>/1 menit. Peralatan yang terbuat dari logam& wadah-wadah gelas& dan lain-
lain& disterilsasi dengan pemanasan dalam o$en pada suhu 0151 oC selama /6
jam +3uhuteru& /1/,.
(etelah dio$en& alat-alat ini bisa langsung digunakan atau disimpan dalam
lemari. )aminar Air *low adalah alat yang ditemukan pada tahun 2>1 yang
dikolaborasikan struktur yang dilengkapi dengan ruangan udara dengan udara
yang steril. Ada dua ma"am dari jenis ini yaitu hori4ontal dan $erti"al )aminar Air
*low steril system yang terkadang membutuhkan biaya yang sangat mahal dalam
proses perawatannya. Pengembangan alat ini diharapkan memanipulasi dan
mempertahankan suatu ruangan dalam keadaan yang selalu steril. Alat ini telah
disempurnakan dengan adanya aliran udara steril melalui sebuah prefilter dan alat
yang dialirkan melalui sebuah ilter H;PA + High Efficiency Particulate Air , untuk
menggerakkan aliran udara yang steril di dalam ruang kerja di laboratorium.
)aminar dilengkapi dengan adanya lampu % +Ultra Violet , yang digunakan
untuk memastikan bahwa tidak adanya kontaminan di setiap sisi ruangan +(tignor&
/112,. Hal ini sangat diperuntukan untuk kegiatan praktikum dan pembuatan stok
biologi yang harus dalam kondisi yang steril. Cara kerja laminar air low sebagai
HACD + Heating, Ventilation, Air-Conditioning, and Refrigeration, sebelum
digunakan terlebih dahulu disterilkan dengan menyemprotkan alkohol 51 ? pada
dinding dan alasnya serta meratakannya menggunakan tissue atau kertas yang
steril. !emudian mendiamkannya selama kurang lebih 01 menit. )ampu
ultra$iolet yang berada di dalam laminar air low dinyalakan selama 1&>- jam
untuk membunuh kontaminan yang berada di dalamnya +(tignor& /112,.
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
9/25
*aktor utama yang menjadi kendala dalam kultur jaringan adalah
kontaminasi yang dapat menyebabkan media perlakuan rusak dan planlet mati.
!ontaminasi yang terjadi disebabkan oleh "endawan atau ungi +jamur, dan
bakteri. #ari kedua aktor penyebab kontaminasi& jamur atau "endawan yang
menjadi penyebab paling dominan karena media yang telah terkontaminasi
"endawan sangat sulit untuk dibersihkan atau disterilkan kembali. !ontaminasi
pada media perlakuan sebelum proses penanaman tidak dapat digunakan untuk
menanam. (ehingga sebelumnya harus diganti dengan pembuatan media yang
baru untuk selanjutnya dapat dilakukan proses penanaman +3uhuteru& /1/,.
edia tanam dapat digunakan setelah diinkubasi selama 6-5 hari dan
memastikan bahwa media yang digunakan terbebas dari kontaminasi& namun
kontaminasi pada planlet mulai terlihat pada umur satu (P dengan rekuensi E
-> botol planlet. !ontaminasi yang disebabkan se"ara langsung oleh "endawan
dapat terlihat pada awalnya terletak di permukaan atau tepi media yang berkontak
langsung dengan dinding botol. Apabila dibiarkan maka "endawan tersebut akan
menutupi seluruh permukaan media. Hal ini berbeda dengan kontaminasi yang
disebabkan oleh bakteri yang terjadi langsung pada eksplan yang ditandai dengan
mun"ulnya lendir berwarna putih keruh disekeliling planlet. Hal ini dapat
disebabkan dari kurang bersihnya botol& peralatan pada saat pembuatan media&
suhu ruang kultur yang sering berganti atau tidak tetap pada saat botol disimpan di
rak kultur dan adanya bakteri yang terbawa dari sumber tanam atau bahan tanam
+3uhuteru& /1/,.
'leh karena itu hal yang perlu mendapatkan diperhatian dalam teknik
asepti" se"ara in $itro yaitu dalam beberapa tahapan antara lain pemilihan
eksplan& proses sterilisasi bahan tanam atau eksplan yang telah dipilih& keadaan
selama proses kultur yang terdiri dari suhu atau temperatur& kelembaban relati$e
serta waktu yang diperlukan untuk proses pertumbuhan dan perkembangannya
selama proses kultur in $itro. !ondisi pertama yang membawa keberhasilan
dalam proses kultur adalah aseptik. 3eknik untuk mempertahankan asepti" disebut
teknik asepti" yang berarti bebas dari semua jenis mikroorganisme atau kondisi
yang steril dan layak untuk melakukan proses kultur in $itro. %ntuk menjaga
lingkungan yang aseptik maka harus semua komponen kultur baik alat dan bahan
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
10/25
serta media dan juga eksplan yang akan digunakan harus dalam keadaan yang
steril sehingga harus dilakukan proses sterilisasi untuk semua komponen dalam
kultur jaringan. Hal penting yang lain yaitu menjaga udara& permukaan lantai
bebas dan bersih dari debu. (ehingga semua pengerjaan dari praktikum kultur
harus dilakukan dalam )aminar Air *low Cabinet yang steril +Chawla dalam
Anoop& /112,.
%ntuk itu pada dasarnya teknik aseptik yang dilakukan dalam kultur
jaringan sangat perlu digunakan untuk dapat mendukung kondisi yang dibutukan
eksplan yang ditanam dalam media mengalami proses pertumbuhan dan
perkembangan. 3eknik asepti" dapat terlaksana dengan baik apabila juga disertai
dilakukannya proses sterilisasi terutama pada eksplan yang harus bebas dari
kontaminan sebelum dilakukan proses penkulturan. Berbagai proses sterilisasi
yang disertai dengan agen sterilisasi digunakan untuk men"egah adanya
kontaminasi pada jaringan dalam eksplan. Agen sterilisasi "ontohnya yaitu Cloro=
atau bay"lin ditujukan karena bay"lin memiliki kandungan yang dapat
membersihkan eksplan dari berbagai ma"am kontaminan baik berupa jamur& $irus&
bakteri& maupun kontaminan yang lain +Hariyadi& /11,. Hal ini dikarenakan
kedua bahan tersebut merupakan ra"un untuk tanaman oleh karena itu dalam
penggunaanya diperlukan dosis atau ukuran yang sesuai agar tidak melukai
ataupun mematikan jaringan dalam eksplan.
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
11/25
BAB # METOE PRAKTIKUM
#$ Wakt" dan Te+pat
Praktikum !ultur Jaringan 3umbuhan dengan a"ara 3eknik Aseptik
dilaksanakan pada hari inggu& ei /16 pukul /.11 sFd selesai bertempat di
)aboratorium !ultur Jaringan 3umbuhan Jurusan Budidaya Pertanian& *akultas
Pertanian& %ni$ersitas Jember.
#& Alat dan Bahan
0./. Alat
. )aminar Air *low +)A*,
/. Botol semprot0. Pinset
6. Pisau
>. (eal +segel,
G. !ertas label
5. Alat tulis
9. Bunsen
2. Petri dish
0././ Bahan
. edium padat kultur jaringan yang telah dibuat pada praktikum
sebelumnya
/. PestisidaF *ungisida
0. A@uades
6. Alkohol 51?
# Prsed"r Ker3a
,terilisasi Peralatan
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
12/25
. en"u"i dengan detergen dan membilasnya sampai bersih dengan
menggunakan a@uades& kemudian meniriskannya hingga kering
/. ensterilkan dengan auto"la$e dan menyimpannya dalam o$en untuk
menjaga peralatan agar tidak kontaminasi
0. (etelah proses sterilisasi& dapat menggunakan semua peralatan dengan
menekan kontaminasi
,terilisasi Media
. enggunakan media tanam yang steril
/. ensterilkan menggunakan auto"la$e untuk menghindari kontaminasi
0. emasukkan media yang telah jadi ke dalam botol kultur dan menutupnya
dengan aluminium oil
6. elakukan sterilisasi pada temperature /oC dengan tekanan 5&> Psi
selama /1-01 menit
,terilisasi Bahan Tana+ (Men4es"aikan den*an praktik"+ k"lt"r r*an)
. en"u"i bersih bahan tanam dengan menggunakan air mengalir
/. engojog bahan tanam dengan menggunakan pestisida atau ungisida
0. erendam bahan tanam dengan bahan kimia tertentu atau antisepti" di
)aminar Air *low +)A*,
6. embilas bahan tanam dengan menggunakan air steril dan kemudian
menanamnya
#2 Para+eter Pen*a+atan
engamati kontaminasi media pada hari ke-5 dan ke-6 berdasarkan parameter<
. Jenis mikroorganisme dan "iri-"iri yang menyebabkan kontaminasi
/. Prosentase keberhasilan dari teknik aeptik yang di lakukan
3abel . Jumlah kultur yang terkontaminasi dan jenis kontaminan
at Pengatur
3umbuh
Bahan 3anam 3embakau
Hari ke-5 Hari ke-6
! !
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
13/25
( 1 1 - j
NAA 1&/> ppm dan BAP
ppm
NAA ppm
dan BAP 1&/>
ppm
BAP 1&> ppm
/&6 # 1&> ppm dst dst
!eterangan <
Jumlah kontaminasi
! Jenis kontaminasi
J&B Jamur& Bakteri
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
14/25
BAB 2# .A,IL AN PEMBA.A,AN
2#$ .asil Pen*a+atan
Ta5el $# -"+lah k"lt"r 4an* terknta+inasi dan 3enis knta+inan
pada hari ke67 dan ke6$2
8at Pen*at"r
T"+5"h
Bahan Tana+ Te+5aka"
.ari ke67 .ari ke6$2
9 K 9 K
M, : % % 6
NAA %;&'
pp+ dan
BAP $ pp+
% 6
NAA $ pp+
dan BAP %;&'
pp+
% 6
BAP %;' pp+ % 6
&;2 %;' pp+ % 6
Keteran*an <
9 : -"+lah knta+inasi
K : -enis knta+inasi
-; B : -a+"r; Bakteri
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
15/25
2#& Pe+5ahasan
Pada praktikum kultur jaringan dengan a"ara teknik aseptik yang bertujuan
untuk mengetahui pelaksanaan teknik septik yang baik dan benar dalam kultur
jaringan serta mengetahui alat yang serig digunakan dalam setiap teknik asepti".
3ujuan yang terakhir yaitu mengetahui jenis kontaminan yang terjadi karena
beberapa a"tor. (ebelum memulai praktikum ini maka praktikan harus
mempersiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan. Alat yang digunakan dalam
praktikum ini yaitu& )aminar Air *low +)A*,& Botol semprot yang berisi alkohol
51?& Pinset& Pisau& (eal wrap +segel,& !ertas label& Alat tulis& Bunsen dan Petri
dish. (edangkan bahan yang harus disediakan yaitu medium padat kultur jaringan
yang telah dibuat pada praktikum sebelumnya& PestisidaF *ungisida& A@uades serta
Alkohol 51?.
(etelah alat dan bahan sudah lengkap tersedia& maka praktikan dapat
memulai praktikum a"ara teknik aseptik dengan prosedur yang sudah terdapat
dalam modul. Prosedur kerja dalam praktikum ini dibagi menjadi 0 prosedur yaitu
prosedur kerja dalam sterilisasi peralatan& prosedur kerja dalam sterilisasi media&
dan yang terakhir prosedur kerja sterilisasi bahan tanam yanga akan digunakan.
Prosedur kerja yang pertama yaitu proses sterilisasi peralatan yang dimulai
dengan men"u"i dengan detergen dan membilasnya sampai bersih dengan
menggunakan a@uades& kemudian meniriskannya hingga kering. ensterilkan
dengan auto"la$e dan menyimpannya dalam o$en untuk menjaga peralatan agar
tidak kontaminasi. (etelah proses sterilisasi& dapat menggunakan semua peralatan
dengan menekan kontaminasi.
Prosedur kerja kedua yaitu proses sterilisasi media yang diawali dengan
menggunakan media tanam yang steril. ensterilkan menggunakan auto"la$e
untuk menghindari kontaminasi. emasukkan media yang telah jadi ke dalam
botol kultur dan menutupnya dengan aluminium oil. (etelah selesai semuanya
lalu melakukan sterilisasi pada temperature /oC dengan tekanan 5&> Psi selama
/1-01 menit. Prosedur kerja yang terakhir yaitu proses sterilisasi bahan tanam atau
eksplan yang akan digunakan dengan men"u"i bersih bahan tanam dengan
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
16/25
menggunakan air mengalir. Hal yang perlu diperhatikan adalah pada saat
pembilasan air yang digunakan harus dengan air yang mengalir agar semua
kontaminan dapat di singkirkan dan agar eksplan tidak mudah terkontaminasi
dengan air bekas bilasan yang telah digunakan apabila menggunakan air yang
tidak mengalir. engojog bahan tanam dengan menggunakan pestisida atau
ungisida. erendam bahan tanam dengan bahan kimia tertentu atau antisepti" di
)aminar Air *low +)A*, dan yang terakhir membilas bahan tanam dengan
menggunakan air steril dan kemudian menanamnya.
(etelah praktikum selesai dilakukan maka dilakukanlah pengamatan pada
hari ke-5 dan hari ke-6. Namun yang dapat diperoleh hanya pada hari ke-5.
Parameter yang digunakan untuk mengamatinya adalah mengetahui jumlah dan
jenis kontaminan yang terjadi pada media dan berapa prosentase keberhasilan
teknik aseptik yang telah dilakukan. Berdasarkan tabel hasil pengamatan dapat
diperoleh bahwasanya pada hari ke-5 dengan bahan tanam tembakau& media yang
telah ditanami dengan perlakuan (1 menunjukkan bahwa tidak ada
kontaminan yang terjadi dalam media tanamnya. Pada perlakuan ( dengan P3
NAA 1&/>ppm dan BAP ppm diperoleh hasil bahwa tidak ada akti$itas
kontaminasi yang terjadi& sehingga tidak adanya kontaminan dalam media
tanamnya. Pada perlakuan selanjutnya dengan menggunakan media ( yang di
tambahi dengan P3 NAA ppm dan BAP 1&/>ppm menunjukkan hal yang sama
bahwa tidak adanya akti$itas kontaminan yang dibuktikan dengan tidak adanya
kontaminasi yang terjadi.
Pada perlakuan ke-6 dengan media ( menggunakan P3 BAP 1&>ppm
menunjukkan tidak adanya kontaminasi baik dari jamur ataupun bakteri.
Perlakuan yang terakhir dengan media ( yang ditambahi dengan /&6 # 1&> ppm
tidak terjadi adanya kontaminan yang disebabkan oleh akti$itas jamur ataupun
bakteri. (ehingga dapat disimpulkan berdasarkan hasil pengamatan hari ke-5
dapat diketahui prosentase keberhasilan teknik asepti" yang telah dilakukan
men"apai 11?. Hal ini dibuktikan dengan tidak adanya kontaminan baik yang
berasal dari jamur ataupun bakteri.
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
17/25
*aktor utama yang menjadi kendala dalam kultur jaringan adalah
kontaminasi yang dapat menyebabkan media perlakuan rusak dan planlet mati.
!ontaminasi yang terjadi disebabkan oleh "endawan atau ungi +jamur, dan
bakteri. #ari kedua aktor penyebab kontaminasi& jamur atau "endawan yang
menjadi penyebab paling dominan karena media yang telah terkontaminasi
"endawan sangat sulit untuk dibersihkan atau disterilkan kembali. !ontaminasi
pada media perlakuan sebelum proses penanaman tidak dapat digunakan untuk
menanam. (ehingga sebelumnya harus diganti dengan pembuatan media yang
baru untuk selanjutnya dapat dilakukan proses penanaman +3uhuteru& /1/,.
edia tanam dapat digunakan setelah diinkubasi selama 6-5 hari dan
memastikan bahwa media yang digunakan terbebas dari kontaminasi& namun
kontaminasi pada planlet mulai terlihat pada umur satu (P dengan rekuensi E
-> botol planlet. !ontaminasi yang disebabkan se"ara langsung oleh "endawan
dapat terlihat pada awalnya terletak di permukaan atau tepi media yang berkontak
langsung dengan dinding botol. Apabila dibiarkan maka "endawan tersebut akan
menutupi seluruh permukaan media. Hal ini berbeda dengan kontaminasi yang
disebabkan oleh bakteri yang terjadi langsung pada eksplan yang ditandai dengan
mun"ulnya lendir berwarna putih keruh disekeliling planlet +3uhuteru& /1/,.
*aktor penyebab kontaminasi yang terjadi berasal dari kurang bersihnya
botol& peralatan pada saat pembuatan media& suhu ruang kultur yang sering
berganti atau tidak tetap pada saat botol disimpan di rak kultur dan adanya bakteri
yang terbawa dari sumber tanam atau bahan tanam oleh karena itu harus
dilakukan proses sterilisasi bahan tanam sebelum dilakukan proses penanaman
dan juga kontaminasi sangat ditentukan oleh sterilitas ruangan yang sebab itu
sangat perlu dilakukannya proses sterilisasi ruangan sebelum digunakan untuk
menanam eksplan dalam medium. Proses sterilisasi ruangan yang termasuk dalam
teknik aseptik menggunakan )aminar Air *low +)A*, untuk menjaga sterilitas
ruangan.
Prinsip kerja alat ini dapat dikolaborasikan dengan struktur yang
dilengkapi dengan ruangan udara dengan udara yang steril. Ada dua ma"am dari
jenis ini yaitu hori4ontal dan $erti"al )aminar Air *low steril system yang
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
18/25
terkadang membutuhkan biaya yang sangat mahal dalam proses perawatannya.
Pengembangan alat ini diharapkan memanipulasi dan mempertahankan suatu
ruangan dalam keadaan yang selalu steril. Alat ini telah disempurnakan dengan
adanya aliran udara steril melalui sebuah prefilter dan alat yang dialirkan melalui
sebuah ilter H;PA + High Efficiency Particulate Air , untuk menggerakkan aliran
udara yang steril di dalam ruang kerja di laboratorium. )aminar dilengkapi
dengan adanya lampu % +Ultra Violet , yang digunakan untuk memastikan
bahwa tidak adanya kontaminan di setiap sisi ruangan +(tignor& /112,.
Hal ini sangat diperuntukan untuk kegiatan praktikum dan pembuatan stok
biologi yang harus dalam kondisi yang steril. Cara kerja laminar air low sebagai
HACD + Heating, Ventilation, Air-Conditioning, and Refrigeration, sebelum
digunakan terlebih dahulu disterilkan dengan menyemprotkan alkohol 51 ? pada
dinding dan alasnya serta meratakannya menggunakan tissue atau kertas yang
steril. !emudian mendiamkannya selama kurang lebih 01 menit. )ampu
ultra$iolet yang berada di dalam laminar air low dinyalakan selama 1&>- jam
untuk membunuh kontaminan yang berada di dalamnya +(tignor& /112,.
Proses sterilisasi media dan peralatan dengan menggunakan alat sterilisasi
auto"la$e yang mempunyai prinsip sebelum digunakan atau dinyalakan bahan
atau alat yang lain adalah tutup botol plastik& peralatan gelas& peralatan diseksi&
pipet& air murni& dan media kultur mendapatkan perlakuan sesuai dengan jenis
alatnya. (emua peralatan diseksi dibungkus dengan menggunakan kertas "oklat
atau kertas merang dan juga !oran sebelum diautokla$. Aluminium oil tidak
direkomendasikan untuk membungkusnya dikarena uapnya tidak dapat menembus
pembungkus. Cara kerja yang harus dipatuhi dalam menggunakan auto"la$e
mengkondisikan autokla$ diatur pada temperatur yang digunakan untuk sterilisasi
dengan autokla dengan suhu /oC serta tekanan >-5&> psi selama >/1
menit. Peralatan yang terbuat dari logam& wadah-wadah gelas& dan lain-lain&
disterilsasi dengan pemanasan dalam o$en pada suhu 0151oC selama /6 jam.
'leh karena itu hal yang perlu mendapatkan diperhatian dalam teknik
asepti" se"ara in vitro yaitu dalam beberapa tahapan antara lain pemilihan eksplan&
proses sterilisasi bahan tanam atau eksplan yang telah dipilih& keadaan selama
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
19/25
proses kultur yang terdiri dari suhu atau temperatur& kelembaban relati$e serta
waktu yang diperlukan untuk proses pertumbuhan dan perkembangannya selama
proses kultur in vitro. !ondisi pertama yang membawa keberhasilan dalam proses
kultur adalah aseptik. 3eknik untuk mempertahankan asepti" disebut teknik
asepti" yang berarti bebas dari semua jenis mikroorganisme atau kondisi yang
steril dan layak untuk melakukan proses kultur in vitro. %ntuk menjaga
lingkungan yang aseptik maka harus semua komponen kultur baik alat dan bahan
serta media dan juga eksplan yang akan digunakan harus dalam keadaan yang
steril sehingga harus dilakukan proses sterilisasi untuk semua komponen dalam
kultur jaringan. Hal penting yang lain yaitu menjaga udara& permukaan lantai
bebas dan bersih dari debu. (ehingga semua pengerjaan dari praktikum kultur
harus dilakukan dalam )aminar Air *low Cabinet yang steril +Chawla dalam
Anoop& /112,.
%ntuk itu pada dasarnya teknik aseptik yang dilakukan dalam kultur
jaringan sangat perlu digunakan untuk dapat mendukung kondisi yang dibutukan
eksplan yang ditanam dalam media mengalami proses pertumbuhan dan
perkembangan. 3eknik asepti" dapat terlaksana dengan baik apabila juga disertai
dilakukannya proses sterilisasi terutama pada eksplan yang harus bebas dari
kontaminan sebelum dilakukan proses penkulturan. Berbagai proses sterilisasi
yang disertai dengan bahan sterilisasi digunakan untuk men"egah adanya
kontaminasi pada jaringan dalam eksplan. Bahan sterilisasi "ontohnya yaitu
Cloro= atau bay"lin ditujukan karena bay"lin memiliki kandungan yang dapat
membersihkan eksplan dari berbagai ma"am kontaminan baik berupa jamur& $irus&
bakteri& maupun kontaminan yang lain +Hariyadi& /11,. Hal ini dikarenakan
kedua bahan tersebut merupakan ra"un untuk tanaman oleh karena itu dalam
penggunaanya diperlukan dosis atau ukuran yang sesuai agar tidak melukai
ataupun mematikan jaringan dalam eksplan +:a4id& /11,.
Pentingnya teknik aseptik dalam kultur jaringan tepatnya pada saat
penanaman eksplan harus selalu dalam keadaan yang steril& maka harus dilakukan
sterilisasi. (etiap bahan yang akan kita gunakan harus dalam kondisi yang steril.
3ermasuk juga praktikan yang hendak menanam eksplan pada media tanam harus
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
20/25
steril dimulai dari penggunaan jas lab& sarung tangan dan masker. (elain itu
sebelum praktikan memulai melakukan penanaman eksplan di dalam )aminar air
*low Cabinet& harus menyemprotkan al"ohol ke tangan walaupun sudah memakai
sarung tangan lateks. Begitu juga dengan peralatan yang akan digunakan sebelum
memasuki )aminar Air *low Cabinet seperti pinset dan s"alpel& harus direndam
dengan al"ohol yang disediakan dalam beaker glass ke"il apabila alat tersebut
tidak digunakan. Namun apabila akan digunakan kembali harus di panaskan
terlebih dahulu di atas nyala api Bunsen.
Proses sterilisasi yang merupakan langkah penting dalam teknik aseptik
dilakukan dengan tujuan agar semua proses penanaman yang dilakukan dengan
alat dan bahan yang steril karena penanaman eksplan ini sangat mudah terjadi
kontaminan yang dapat mempengaruhi keberhasilam penanaman eksplan. 'leh
karena itu teknik aseptik sangat penting untuk dilakukan untuk memperoleh
keberhasilan pada proses penanaman dalam kultur jaringan.
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
21/25
BAB '# KE,IMPULAN AN ,ARAN
'#$ Kesi+p"lan
. 3eknik aseptik dalam kultur jaringan dilakukan pada saat sebelum& pada
waktu penanaman eksplan dan sesusadah penanaman harus selalu dalam
keadaan yang steril& maka harus selalu dilakukan sterilisasi. (etiap bahan
yang akan kita gunakan harus dalam kondisi yang steril. 3ermasuk juga
praktikan yang hendak menanam eksplan pada media tanam harus steril
dimulai dari penggunaan jas lab& sarung tangan dan masker. (elain itu
sebelum praktikan memulai melakukan penanaman eksplan di dalam
)aminar air *low Cabinet& harus menyemprotkan al"ohol ke tangan
walaupun sudah memakai sarung tangan lateks. Begitu juga dengan
peralatan yang akan digunakan sebelum memasuki )aminar Air *low
Cabinet seperti pinset dan s"alpel& harus direndam dengan al"ohol yang
disediakan dalam beaker glass ke"il apabila alat tersebut tidak digunakan.
Namun apabila akan digunakan kembali harus di panaskan terlebih dahulu
di atas nyala api Bunsen. (terilisasi setelah penanaman dengan
membersihkansemua alat dan bahan yang digunakan untuk tidak berada
dalam )A* pada saat setelah proses penanaman.
/. Proses sterilisasi yang merupakan langkah penting dalam teknik aseptik
dilakukan dengan tujuan agar semua aspek yang terdiri dari peralatan dan
bahan serta media& praktikan dan eksplan atau bahan tanama yang akan
digunakan dan juga lingkungan kerja pada saat proses kultur jaringan
mempunyai alat tertentu yang digunakan untuk melakukan proses
sterilisasi pada semua aspek. Proses sterilisasi peralatan& dan media
dilakukan dengan menggunakan auto"la$e dengan suhu /oC dan tekanan
5&> Psi. Proses sterilisasi lingkungan kerja beserta praktikan dengan
selalu berada dalam )aminar Air *low Cabinet dengan dilengkapi lampu
% untuk mempertahankan sterilitas ruangan selama proses penanaman.
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
22/25
Proses sterilisasi bahan tanam dngan menggunakan bahan sterilisasi
seperti Cloro= atau bay"lin ditujukan karena bay"lin memiliki kandungan
yang dapat membersihkan eksplan dari berbagai ma"am kontaminan baik
berupa jamur& $irus& bakteri
0. *aktor utama yang menjadi kendala dalam kultur jaringan adalah
kontaminasi yang dapat menyebabkan media perlakuan rusak dan planlet
mati. !ontaminasi yang terjadi disebabkan oleh "endawan atau ungi
+jamur, dan bakteri. #ari kedua aktor penyebab kontaminasi& jamur atau
"endawan yang menjadi penyebab paling dominan karena media yang
telah terkontaminasi "endawan sangat sulit untuk dibersihkan atau
disterilkan kembali. !ontaminasi yang disebabkan se"ara langsung oleh
"endawan dapat terlihat pada awalnya terletak di permukaan atau tepi
media yang berkontak langsung dengan dinding botol. Apabila dibiarkan
maka "endawan tersebut akan menutupi seluruh permukaan media. Hal ini
berbeda dengan kontaminasi yang disebabkan oleh bakteri yang terjadi
langsung pada eksplan yang ditandai dengan mun"ulnya lendir berwarna
putih keruh disekeliling planlet. *aktor penyebab kontaminasi yang terjadi
berasal dari kurang bersihnya botol& peralatan pada saat pembuatan media&
suhu ruang kultur yang sering berganti atau tidak tetap pada saat botol
disimpan di rak kultur dan adanya bakteri yang terbawa dari sumber tanam
atau bahan tanam yang digunakan.
'#& ,aran
#alam hal menaikkan keberhasilan pada praktikum ini& adapun beberapa
saran yang pastinya perlu untuk diperhatikan& yaitu
. (angat memperhatikan kesterilan alat dan bahan dan memastikan semuanya
dalam keadaan steril.
/. (elalu memakai jas praktikum saat praktikum maupun pada saat
pengamatan baik pada praktikan maupun asisten laboratorium untuk
menghindari adanya kontaminasi.
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
23/25
A0TAR PU,TAKA
Anoop& Badoni and J. (. Chauhan. /112. In itro (terili4ation Proto"ol or
i"ropropagation o (olanum tuberosum. Academia Arena& /1127
+>,-9K. I((N >>0-22/L.
#eden& (ukmadjaja dan ariska& Ika. /110. Perbanyaan !ibit "ati melalui
#ultur "aringan I(BN 252-2>G/5-9-0. Bogor< Balai Penelitian
Bioteknologi dan (umberdaya 8enetik Pertanian.
Hariyadi& Purwiyatno. /11. $terili%a%i UH& dan Pengema%an A%epti .
Jakarta< Ikatan #okter Indonesia
)ili Herawati (iregar& )uthi A. (iregar& )ollie A. P. Putri. /10.
P;N8AD%H M- B;NI) AIN' P%DINA #AN M- A(A A(;3A3
NA*3A);NA 3;DHA#AP P;D3%B%HAN A!AD !oe%enbergia
flava (;CADA IN-I3D'. "urnal 'nline Agroeotenologi ol.&
No.0& Juni /10
ariska& Ika. /112.Perkembangan Penelitian !ultur In itro pada 3anaman
Industri& Pangan& dan Hortikultura. !uletin Agro!io ()*+(-( ') >&
N'. /
ariska& Ika dan #eden (. /110. Perbanyaan !ibit Abaa melalui #ultur
"aringan I(BN 252-2>G/5-2-. Bogor< Balai Penelitian Bioteknologi
dan (umberdaya 8enetik Pertanian.
ayta No$ali4a Isda dan Iran (ulianyah. /112. IN#%!(I !A)%( Centella
a%iatica ;)A)%I AP)I!A(I A%!(IN #AN (I3'!ININ +3he Doleo Au=in and Cytikinin in Callus Indu"tion o Indian Pennywort
+Centella a%iatica,. "erami olume / No. 0& (eptember - #esember
/112 I((N 252-1//9
. :a4id& Aris Bastianudin. /11. P;N8AD%H (3I%)AN A(A
A(;3A3 3;DHA#AP ;*I(I;N(I P;N8I!A3AN %DANI%
#A)A BI'D;;#IA(I )IN8!%N8AN ;N88%NA!AN
!acillu% sp. dan P%eudomona% sp. Pro%iding PP/ - P0/P&1 *2
Pu%te A%elerator dan Pro%e% !ahan 3 !A&A1 I((N 1/G 0/9.
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
24/25
Nur Ajijah& Ireng #arwati& :udiwanti& #an Doostika. /11. P;N8AD%H
(%H% IN!%BA(I 3;DHA#AP P;D3%B%HAN #AN
P;D!;BAN8AN ;BDI' ('A3I! P%D'C;N8 + Pimpinella
pruat4an olk.,. "urnal 5ittri G+/,& Juni /11 Hlm. >G G0 I((N
19>0-9//.
Nugraha Pratama #hanal& )ahmuddin )ubis& )isnawita. /10. I(')A(I
JA%D 'ncoba%idium theobromae P.H.B 3A)B'3 !;AN;
P;N:;BAB P;N:A!I3 A(C%)AD (3D;A! #I;BAC! PA#A
3ANAAN !A!A' #I )AB'DA3'DI%. "urnal 'nline
Agroeotenologi I((N No. /005- G>25 ol./& No.< /99-/20#esember /10.
Patoni A. 8aar dan (usi Heryani. /1/. P;N8;BAN8AN PD'(;(
P;N8')AHAN IN%AN NIDA AD;N #;N8AN 3;!NI!
%)3DA*I)3DA(I #AN #;'#'DI(A(I +3he #e$elopment o Aren
(ap #rink Pro"essing 3e"hnology by %sing %ltrailtration and
#eodori4ation 3e"hni@ues,. "UR1A5 HA$/5 PE1E5/&/A1 /10U$&R/
olume />& No. & April /1/.
(tignor& Caroline Haglund. /112. 5aminar-flo6 5i7uid-to-air Heat
E8changer%-Energy-effeciency 0i%play Cabinet Application%. (weden<
)und %ni$ersity.
3uhuteru& . ). Hehanussa& (.H.3. Daharjo. /1/. P;D3%B%HAN #AN
P;D!;BAN8AN AN88D;! 0endrobium ano%mum PA#A
;#IA !%)3%D IN I3D' #;N8AN B;B;DAPA
!'N(;N3DA(I AID !;)APA. Agrologia& ol. & No. & April /1/&
Hal. -/. I((N /01-5/95.
-
8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan
25/25