![Page 1: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/1.jpg)
Prinsip Bioteknologi
BIO306
![Page 2: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/2.jpg)
KULIAH 6. TEKNIK DASAR KLONING
![Page 3: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/3.jpg)
• Percobaan pertama penggabungan fragmen DNA secara
in vitro dilakukan sekitar 30 tahun yang lalu oleh
Jackson et al. (1972).
• Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa• Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa
dari Escherichia coli dan gen ΦλΦλΦλΦλ ke dalam SV40.
• Pada tahun 1973, Cohen et al. melakukan konstruksi
plasmid untuk pertama kalinya .
![Page 4: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/4.jpg)
![Page 5: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/5.jpg)
• Produksi komersial protein dalam jumlah sangat besar.
• Hormon: insulin, hormon pertumbuhan manusia,
hormon pertumbuhan sapi, dan interferon.
• Vaksin: hepatitis B, diare toksik, dan penyakit mulut
dan kaki pada hewan.
Produk Rekayasa Genetika
dan kaki pada hewan.
• Faktor pembeku darah seperti plasminogen (pencair
beku darah) jaringan.
![Page 6: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/6.jpg)
• Produksi bahan bakar pengganti minyak bumi melalui
transformasi sampah pertanian.
• Organisme pendegradasi untuk pengendalian
pencemaran.
• Enzim seperti urokinase dan rennin. Antibodi
monoklonal.
• Transfer gen pada tanaman untuk resistensi virus dan
herbisida, toleransi garam, dan peningkatan kandungan
asam amino dll.
![Page 7: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/7.jpg)
• Pemain utama dalam pengembangan teknik dan
aplikasi rekayasa genetika,
• Hampir seluruh metode rekayasa genetika
dikembangkan melalui bantuan E. coli K12 yang
berperan sebagai inang plasmid/fage rekombinan,
• Hingga saat ini hampir seluruh tahapan kloning,
E. coli sebagai Inang
• Hingga saat ini hampir seluruh tahapan kloning,
karakterisasi, dan modifikasi fragmen DNA spesifik
dilakukan dengan memanfaatkan sistem E. coli,
• Pengembangan vektor bolak-balik (shuttle vector) yang
diaplikasikan untuk organisme lain dikerjakan di dalam
sistem E. coli,
• E. coli masih memainkan peran utama dalam industri
bioteknologi untuk memproduksi berbagai protein
![Page 8: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/8.jpg)
• Bahan genetik berupa material DNA untuk tujuan
rekombinasi harus memiliki berat molekul tinggi.
• DNA tersebut dipotong dengan cara mekanis atau
dengan cara enzimatik (restriction endonuclease).
Isolasi fragmen DNA
dengan cara enzimatik (restriction endonuclease).
• Pemotongan DNA dengan cara mekanik: pengocokan
atau sonikasi, ukuran fragmen DNA tidak seragam.
![Page 9: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/9.jpg)
Teknik Isolasi DNA
![Page 10: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/10.jpg)
![Page 11: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/11.jpg)
• Strategi umum yang digunakan dalam menghasilkan
fragmen sangat ditentukan oleh tujuan metode
pengklonan.
• Pemotongan DNA dengan enzim tunggal akan• Pemotongan DNA dengan enzim tunggal akan
menghasilkan fragmen dengan ujung identik.
• Kombinasi enzim (2 atau lebih enzim) digunakan untuk
menghasilkan fragmen dengan ujung yang berbeda-
beda.
![Page 12: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/12.jpg)
Sticky end Blunt end
Restriction endonuclease
Sticky end Blunt end
![Page 13: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/13.jpg)
Ujung bangku (sticky end hasil pemotongan restriction endonuclease
![Page 14: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/14.jpg)
• Pembentukan/pembuatan ujung yang komplemen, dan
penyambungan melalui pembentukan ikatan
fosfodiester yang dimediasi dengan menggunakan enzim
penyambung DNA (DNA-ligase mediated phosphodiester
Penyambungan molekul DNA
penyambung DNA (DNA-ligase mediated phosphodiester
bond formation).
![Page 15: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/15.jpg)
Pemotongan DNA dan penyambungan dengan ligase
![Page 16: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/16.jpg)
Pembentukan ujung bangku (sticky-ends) dengan memotong molekul DNA
dengan menggunakan enzim pemotong yang sama.
Pemotongan DNA dengan enzim restriksi berbeda namun menghasilkan ujung
komplemen (kohesif) yang sama.
![Page 17: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/17.jpg)
Pembuatan ujung bangku yang bersesuaian (compatible) dengan mengisi 5’-
ujung menonjol (protruding) secara parsial
![Page 18: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/18.jpg)
• Digunakan untuk mengangkut bahan genetik/fragmen
DNA ke dalam sel hidup.
• Beberapa sistem vektor telah dikembangkan terutama
untuk inang E. coli. Vektor ini dibagi ke dalam 3 jenis,
Sistem Vektor
untuk inang E. coli. Vektor ini dibagi ke dalam 3 jenis,
yaitu: vektor baktetiofaga, plasmid, dan cosmid.
![Page 19: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/19.jpg)
Vektor bakteriofage
• Kemampuan fage menginfeksi dan memindahkan
informasi genetik dari satu inang ke inang lain dalam
spesies yang sama (transduksi).
• Digunakan terutama untuk konstruksi pustaka DNA.
• Efisiensi transfer yang tinggi, dapat diseleksi langsung,
dan efisiensi kloning fragmen DNA yang besar.
Mengepak DNA konkatemer yang mengandung paling• Mengepak DNA konkatemer yang mengandung paling
sedikit 2 situs cos.
• Ukuran DNA yang dapat dipak antara 75-108% ukuran
genom normal fage.
• Contoh vektor untuk E. coli yaitu ΦλΦλΦλΦλ, misalnya
λλλλEMBL3, λλλλGEM-11, λλλλgt10, gt11, dan λλλλZAP11 (Gambar
23).
![Page 20: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/20.jpg)
Transfer bahan genetik dengan vektor faga λλλλ
![Page 21: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/21.jpg)
• Mempunyai sistem replikasi.
• Penanda seleksi (selection marker); gen resisten
antibitik (Ampr, Chlor, Knr/Neor, dan Trr) serta
penanda lainnya seperti gen lac,
• Posisi kloning; ditempatkan di luar sekuen esensial dan
memiliki situs potong enzim pemotong yang dapat
digunakan untuk memasukkan fragmen DNA asing ke
Vektor plasmid
digunakan untuk memasukkan fragmen DNA asing ke
dalam plasmid.
![Page 22: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/22.jpg)
Plasmid pBR322
![Page 23: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/23.jpg)
• Cosmid merupakan vektor hibrida yang merupakan
kombinasi sifat-sifat yang menguntungkan antara
plasmid dan bagian dari faga.
• Relatif kecil namun mampu membawa fragmen DNA
berukuran besar (≈≈≈≈ 50 kb).
Vektor cosmid
![Page 24: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/24.jpg)
Transfer bahan genetik dengan cosmid
![Page 25: Lecture06 TeknikKloning.ppt [Read-Only]ocw.usu.ac.id/course/download/811-prinsip-bioteknologi/mipa_-_pb... · • Melakukan penyisipan bahan genetik operon galaktosa ... • Bahan](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022803/5c824b5809d3f27e788beaa8/html5/thumbnails/25.jpg)