Download - Lerat Du Hepatites Virales
PATHOGENPATHOGENÈÈSE DES LSE DES LÉÉSIONS SIONS HHÉÉPATIQUES DU VHC :PATIQUES DU VHC :
MODMODÉÉLISATION ANIMALELISATION ANIMALE
Hervé LERATHervé LERAT
INSERM U955INSERM U955Département de Virologie Moléculaire et ImmunologieDépartement de Virologie Moléculaire et Immunologie
Physiopathologie et Thérapeutique des Hépatites Virales Chroniques (Pr. Pawlotsky)Physiopathologie et Thérapeutique des Hépatites Virales Chroniques (Pr. Pawlotsky)
Hôpital Henri Mondor, Créteil, France.Hôpital Henri Mondor, Créteil, France.
Nécessité de développement de Nécessité de développement de modèles animauxmodèles animaux
Contexte d’un organe entier Contexte d’un organe entier dans un animal vivant.dans un animal vivant.
Pathologies viro-induites: contribution du virus?
Modèles animaux pour l’étude des Modèles animaux pour l’étude des pathologies induites par le VHCpathologies induites par le VHC
Primates non-humainsPrimates non-humains ChimpanzéChimpanzé OuistitiOuistiti
Modèles d’infectionModèles d’infection
Problème de disponibilité et de coût.Problème de disponibilité et de coût.
Rongeurs (“humanisés”)Rongeurs (“humanisés”) uPA/SCIDuPA/SCID TrimeraTrimera ratrat
Modèles animaux pour l’étude des Modèles animaux pour l’étude des pathologies induites par le VHCpathologies induites par le VHC
Modèles d’infectionModèles d’infection
Kremsdorf et Brezillon, World J Gastroenterol 2007
Modèles d’infection (rongeurs)Modèles d’infection (rongeurs)
Kremsdorf et Brezillon, World J Gastroenterol 2007
Modèles d’infection (rongeurs)Modèles d’infection (rongeurs)
Kremsdorf et Brezillon, World J Gastroenterol 2007
Modèles d’infection (rongeurs)Modèles d’infection (rongeurs)
Modèles d’infection (rongeurs)Modèles d’infection (rongeurs)
Adapted from Kremsdorf et Brezillon, World J Gastroenterol 2007
Techniquement très complexes à mettre en œuvreTechniquement très complexes à mettre en œuvre
uPA/SCID
Trimera mice
Rat
Rodent models HumanizationViremia
Copies/mLDuration of infection
(Months)
Human hepatocyte transplantation
Xenograft of human liver tissues
Immunotolerization and transplantation of
human hepatoma cell line
104 to 8x107
7x104
1-2x104
Up to 9
Around 1
Up to 4
Peak viremia
1 month
18 days
3 months
Transgenèse murine Transgenèse murine Classique Classique Conditionnelle (système Cre/Lox)Conditionnelle (système Cre/Lox)
Modèles animaux pour l’étude des Modèles animaux pour l’étude des pathologies induites par le VHCpathologies induites par le VHC
Modèles d’expression des protéines viralesModèles d’expression des protéines virales
Avantages Avantages :: Facilité d’élevage, technique rodéeFacilité d’élevage, technique rodée Expression chronique à long termeExpression chronique à long terme Pas de réponse immunePas de réponse immune Pas de réplication virale Pas de réplication virale
Protéine(s) virale(s) Article princeps Principales pathologies
Core Core Moriya 1997Moriya 1997StéatoseStéatose,, Inhibition de MTTP et VLDL sécrétion, IRInhibition de MTTP et VLDL sécrétion, IRCHC, stressstress oxydatif, stress REoxydatif, stress REModulation de la voie de l’IFN,Modulation de la voie de l’IFN,
Core Core Honda, 2000 Honda, 2000 Modulation de l’apoptose induite par la voie FAS,Modulation de l’apoptose induite par la voie FAS,IR (IRS-1)IR (IRS-1)
Core Core Ishikawa, 2003Ishikawa, 2003 Lymphome et Lymphome et adénomes hépatocellulairesadénomes hépatocellulaires
CoreCore Kato, 2003Kato, 2003 Co-carcinogèneCo-carcinogène (+CCl4)(+CCl4)
CoreCore Kamegaya, 2005Kamegaya, 2005 Co-carcinogèneCo-carcinogène (+DEN)(+DEN)
Core (mutants)Core (mutants) Wang, 2004Wang, 2004 Dysplasie pour le mutant S99QDysplasie pour le mutant S99Q
Core-E1-E2Core-E1-E2 Honda, 1999Honda, 1999 Modulation de l’apoptose induite par la voie FASModulation de l’apoptose induite par la voie FAS
Core-E1-E2Core-E1-E2 Kamegaya, 2005Kamegaya, 2005 Co-carcinogèneCo-carcinogène (+DEN)(+DEN)Inhibition of Fas-mediated apoptosis Inhibition of Fas-mediated apoptosis
Core-E1-E2Core-E1-E2 Naas, 2005Naas, 2005 SteatoseSteatose, , CHCCHC
Core-E1-E2-p7Core-E1-E2-p7 Lerat, 2002Lerat, 2002 StéatoseStéatose,, CHC, sensibilité au stress oxydatif
Core-E1-E2-p7Core-E1-E2-p7 Korenaga, 2002 Korenaga, 2002 Production ROS augmentée
Core-E1-E2-p7-NS2Core-E1-E2-p7-NS2 Wakita, 1998Wakita, 1998 Lésions hépatiques induites par VHC spécifiques CTLLésions hépatiques induites par VHC spécifiques CTLInhibition voie FASInhibition voie FAS
Modèles transgéniques pour le VHCModèles transgéniques pour le VHC
Protéine(s) virale(s) Article princeps Principales pathologies
E1-E2 E1-E2 Koike, 1997Koike, 1997 Exocrinopathie: Sialadenitis (glandes salivaires) Exocrinopathie: Sialadenitis (glandes salivaires)
NS3-4ANS3-4A Frelin, 2006Frelin, 2006 Modulation de la voie TNFαModulation de la voie TNFα
NS5ANS5A Majumder, 2003Majumder, 2003 Modulation de la voie TNFαModulation de la voie TNFα
Polyprotéine entièrePolyprotéine entière Lerat, 2002Lerat, 2002
StéatoseStéatose, , CHCCHC, sensibilité au stress oxydatif, sensibilité au stress oxydatifinhibition voie FAS et réponse immune intra-hépatiqueinhibition voie FAS et réponse immune intra-hépatiqueInhibition des protéines pro-apoptotiques CIDE-B et BidInhibition des protéines pro-apoptotiques CIDE-B et BidCHCCHC par surcharge en fer, inhibition de l’hepcidinepar surcharge en fer, inhibition de l’hepcidine
Polyprotéine entièrePolyprotéine entière Blindenbacher, 2003Blindenbacher, 2003 StéatoseStéatose, nécrose , nécrose Inhibition de la voie IFN (STAT)Inhibition de la voie IFN (STAT)
Polyprotéine entière + HbXPolyprotéine entière + HbX Keasler, Lerat et al. 2006Keasler, Lerat et al. 2006 Augmentation de l’incidence des Augmentation de l’incidence des CHCCHC et de la et de la StéatoseStéatose
Modèles transgéniques pour le VHCModèles transgéniques pour le VHC (suite)
micro-injectionsC57BL6J x C3H/HeJ
X C57BL6Jsouris F0, ADN VHC + souris F1, ARN VHC +
X C57BL6J jusqu’à F8
FoieFoie
Les modèles transgéniques FL-N/35 et S-N/863 (Lerat et al., Gastroenterology, 2002)
S-N/863SL-139
FL-N/35
S-N SV40 PolyA
FL-NE1 E2core
NS
4a
NS3 NS4b NS5a NS5bNS2p7Promoteur albumine
Promoteur albumine E1 E2 p7
SV40 PolyA
core
Carcinomes hépatocellulaires
1 cm
1 cm
FL-N/35-170
FL-N/35-171A
Lerat et al., Gastroenterology 2002.
CHC viro-induits: CHC viro-induits: mmécanismes moléculaires?écanismes moléculaires?
CHC viro-induits: CHC viro-induits: mmécanismes moléculaires?écanismes moléculaires?Modulation du cycle cellulaireModulation du cycle cellulaire
Incorporation de BrdU
HCV TGNon TG
ARNmCyclin B1 MYC
1
3
5
7
9
mR
NA
(F
old
incr
ease
)HCV TGNon TG HCV TGNon TG
Détection PCNA
HCV TGNon TG
% a
po
pto
tic
hep
ato
cyte
s
0
10
20
30
40
50
non TG
HCV TG
P<0.05
in vivo
P<0.01
ex vivo
HCV TGNon TG
Hoe
chst
+
-
Flu
ore
sc
en
ce
in
ten
sit
y
DownDown--regulation ofregulation of apoptosis apoptosis in HCV-transgenic mice in HCV-transgenic mice
0 1 6 15
Non TG
HCV TG
activated Casp 3 (17kDa)
Hours post FasL injection
BidBid
GAPDHGAPDH
LIVERLIVER KIDNEYKIDNEY
HCV tgHCV tg -- ++ -- ++
BidBid24 kD24 kD
ActivatedActivatedcaspase 8caspase 8
Bid-NBid-N10 kD10 kD
Bid-tBid-t14 kD14 kD
Cytochrome CCytochrome C
++
Apoptosis
Down-regulation of pro-apoptotic proteins in HCV-transgenic miceDown-regulation of pro-apoptotic proteins in HCV-transgenic mice(Disson et al., Gastroenterology, 2004)
WTWT HCV tgHCV tg00
0.40.4
0.20.2
0.60.6
0.80.8
11
1.21.2
Bi
Bi d
pro
tein
le
ve
l (A
U)
d p
rote
in l
ev
el
(AU
)
BidBid
N=13N=13N=10N=10
p<0.01p<0.01
Towards a mechanism for HCVTowards a mechanism for HCV-induced carcinogenesis-induced carcinogenesis??Apoptotic signaling alteration in HCV miceApoptotic signaling alteration in HCV mice
HCV
APOPTOSISAPOPTOSISAPOPTOSISAPOPTOSIS
caspase 3 caspase 9
cytochrome C
caspase 8
Fas
FasL
Bid
Cell membrane
mitochondria
HCVCIDE-B
DNA fragmentation
A step toward A step toward cancercancer
CIDE-B
Annexin V
HCV TG +-
Erdtmann et al., J Biol Chem 2003.
Persistence of adenovirus infection in HCV+ hepatocytes(Disson et al., Gastroenterology, 2004)
Day 3
Day 21
non TG HCV TG
Ad Gal108 pfu/g
D +3 Liver biopsy
D +21(sacrifice)
Liver and spleen removal
-gal histology
+ enzymatic assay
10+ 4
10+ 5
10+ 6
10+ 7
+3 +21 +3 +2110+ 3
10+ 4
10+ 5
10+ 6
ßG
AL
act
ivit
y in
th
e liv
er (
RL
U)
ßG
AL
act
ivit
y in
th
e sp
leen
(R
LU
)
LIVER SPLEEN
p<0.05
N.S.
Ad Gal108 pfu/g
D +3 Liver biopsy
D +21(sacrifice)
Liver and spleen removal
-gal histology
+ enzymatic assay
Persistence of adenovirus infection in HCV+ hepatocytes(Disson et al., Gastroenterology, 2004)
CHC viro-induits: CHC viro-induits: mmécanismes moléculaires?écanismes moléculaires?Lésions mitochondrialesLésions mitochondriales
Surcharge en FER
CHC
inflammation
fibrose
Lésions ADN
Coloration Perls (Fer)
Nishina, Gastroenterology 2008
Chaîne de transport électrons (1)
VHC (capside)
ROS
Glutathion
Ca2+Coloration au dihydroethidium (ROS)
Chronicity of infectionChronicity of infection
Towards mechanismTowards mechanismss for HCV for HCV-induced carcinogenesis-induced carcinogenesis??
LIVER CARCINOMALIVER CARCINOMA
HCV expressionHCV expression
Immune response Inhibition
Immune response Inhibition
Increased cell Increased cell divisiondivision
Increased cell Increased cell divisiondivision
Up-regulation of cyclins and oncogenes
Up-regulation of cyclins and oncogenes
DDNA DamageNA DamageDDNA DamageNA Damage
ROS productionROS production
AApoptosis evasionpoptosis evasionAApoptosis evasionpoptosis evasion
Down-regulation of pro-apoptotic proteinDown-regulation of
pro-apoptotic protein
Stéatose micro-vésiculaire
Non TGNon TG VHC TGVHC TG
VHC TGVHC TG VHC TGVHC TG
Lerat et al., Gastroenterology 2002.
Stéatose micro-vésiculaire
coloration Oil Red O
analyse in silico
HCV TGNON TGM
F
M
0
5
10
15
20
25
12.5 ± 0.4
13 ± 0.8 14.4 ± 0.8
14.1 ± 0.3
n=12
n=12 n=10
n=7
p<0.001
% d
e l’a
ire t
otal
HEPATOCELLULAR STEATOSISHEPATOCELLULAR STEATOSIS
de novo TG synthesis
TG secretion default
Increased TG serum uptake
TG degradation default (oxydation)
ER Stress?
VIRALPROTEINS
? ?
?
?
Stéatose viro-induitStéatose viro-induitee: : mmécanismes moléculaires?écanismes moléculaires?
Défaut d’exportation des triglycérides.La sécrétion des VLDL hépatiques chez la souris à jeun a été mesurée par l’augmentation des triglycérides plasmatiques (A et B) et de l’apolipoprotéine B (C) après inhibition de la lipoprotéine lipase par le triton WR1339 (B et C).
Pla
sm
ati
c T
G (
g/L
)
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
A
WT HCV-tg
14 14n
4
6
8
10
12
14
Pla
sm
ati
c T
G (
g/L
)
B
WT HCV-tg
13 13n
1
2
3
4
5
6
Pla
sm
ati
c A
po
B
(g/L
)
C
WT HCV-tg
13 13n
Inhibition de la « Microsomal Transfer Protein »
WT HCV-tg150
200
250
300
350
400
450
500
pm
ole
s/1
00
µg
/4h
Activité MTP
Stimulation de la lipogenèse
Citrate
Acetyl-CoA
ATP-CL
Malonyl-CoA
Acyl-CoAs
TG
Lipo
genè
se ACC
FAS
SCD1
* p=0.01
** p=0.02
WT
HCV-tg
AR
Nm
(a
ug
me
nta
tion
re
lativ
e)
n 11
FAS SCD1
0
2
4
9
EMACCACL
11 14 11 118 8 16 8 8
*
**
**
** p=0.02
RT-qPCR
* p=0.01
FA
S/G
AP
DH
WT HCV-tg
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
*
4 9n
Western Blot
Stimulation de la lipogenèse
Citrate
Acetyl-CoA
ATP-CL
Malonyl-CoA
Acyl-CoAs
TG
Lipo
genè
se ACC
FAS
SCD1
Régulation de la lipogenèse
SREBP1cDomaine de transactivation
(Noyau)
SREBP1c Précurseur
(RE puis Golgi)
Citrate
Acetyl-CoA
ATP-CL
Malonyl-CoA
Acyl-CoAs
TG
Lipo
genè
se ACC
FAS
SCD1
SREBP1cDomaine de transactivation
(Noyau)
SREBP1c Précurseur
(RE puis Golgi)
Citrate
Acetyl-CoA
ATP-CL
Malonyl-CoA
Acyl-CoAs
TG
Lipo
genè
se ACC
FAS
SCD1
Régulation de la lipogenèse
SREBP1c (clivé)
SREBP1c (précurseur)
Lamine A/C
Actine
noyau
microsomes
WT HCV-tg
Western Blot
AR
Nm
(a
ug
me
nta
tion
re
lativ
e)
n 14 16
0
1
2
3
4
WT HCV-tg
RT-qPCR
SREBP1cDomaine de transactivation
(Noyau)
SREBP1c Précurseur
(RE puis Golgi)
Citrate
Acetyl-CoA
ATP-CL
Malonyl-CoA
Acyl-CoAs
TG
Lipo
genè
se ACC
FAS
SCD1
Régulation de la lipogenèse
Lipogenèse induite par le stress du RE?
PERK ATF6IRE-1
Stress RERE
Epissage ARNm XBP1P-eiF2α
Arrêt traduction Dégradation protéique
SREBP1cDomaine de transactivation
(Noyau)
SREBP1c Précurseur
(RE puis Golgi)
Citrate
Acetyl-CoA
ATP-CL
Malonyl-CoA
Acyl-CoAs
TG
Lipo
genè
se ACC
FAS
SCD1
Lipogenèse induite par le stress du RE?
PERK ATF6IRE-1
Stress RERE
Epissage ARNm XBP1P-eiF2α
Arrêt traduction Dégradation protéique
SREBP1cDomaine de transactivation
(Noyau)
SREBP1c Précurseur
(RE puis Golgi)
Citrate
Acetyl-CoA
ATP-CL
Malonyl-CoA
Acyl-CoAs
TG
Lipo
genè
se ACC
FAS
SCD1
eIF
2-P
/eIF
2
0
1
2
3
4
WT HCV-tg
Western blot
Non-épisséEpissé
Non-Tg HCV Tg +
ARNm XBP1
RT-PCR
Lipogenèse induite par le stress du RE?
EDEM
7 4
PDI
11 8
WT
HCV-tg
CHOP TRB3
15 187 4n
GRP78
16 15
AR
Nm
(a
ug
me
na
tion
re
lativ
e)
0
2
4
6
12
RT-QPCR
1
2
3
0
4 9
Phospho-Perk
Ph
osp
ho
-Pe
rk /
PE
RK
Western Blot
PERK ATF6IRE-1
Stress RERE
Epissage ARNm XBP1P-eiF2α
Arrêt traduction Dégradation protéique
RésuméRésumé
SREBP1cDomaine de transactivation
(Noyau)
SREBP1c Précurseur
(RE puis Golgi)
Citrate
Acetyl-CoA
ATP-CL
Malonyl-CoA
Acyl-CoAs
TG
Lipo
genè
se ACC
FAS
SCD1
VLDLMTPExportation TG
ApoB
Accumulation TG intracellulairesSTEATOSE HEPATIQUE
=
=
NO
YESYES
de novo TG synthesis
TG secretion default
Increased TG serum uptake
HEPATOCELLULAR STEATOSISHEPATOCELLULAR STEATOSIS
TG degradation default (oxydation)
ER StressVIRAL
PROTEINS
?
?
Towards mechanismTowards mechanismss for HCV for HCV-induced steatosis-induced steatosis??
Modèles reproduisant les pathologies humainesModèles reproduisant les pathologies humaines Modèles permettant de décrypter les mécanismes Modèles permettant de décrypter les mécanismes
moléculaires moléculaires Démonstration d’effets cytopathiques directs des protéines Démonstration d’effets cytopathiques directs des protéines
virales, en l’absence de réponse immunitaire (pas virales, en l’absence de réponse immunitaire (pas d’inflammation, pas de cirrhose), même dans les modèles d’inflammation, pas de cirrhose), même dans les modèles exprimant très faiblement le transgène (FL-N/35).exprimant très faiblement le transgène (FL-N/35).
Pas de propriétés oncogéniques claires, mais des Pas de propriétés oncogéniques claires, mais des données sur la modulation de l’apoptose, du cycle données sur la modulation de l’apoptose, du cycle cellulaire et des lésions mitochondriales. cellulaire et des lésions mitochondriales.
Données solides sur la stéatose viro-induite Données solides sur la stéatose viro-induite Inhibition de la réponse immunitaire innée.Inhibition de la réponse immunitaire innée.
ConclusionsConclusions
Problèmes inhérents aux modèlesProblèmes inhérents aux modèlesde transgenèse développés pour le VHCde transgenèse développés pour le VHC
Difficultés à comparer les données de différents modèles dues Difficultés à comparer les données de différents modèles dues à l’hétérogénéité des séquences virales, du fond génétique de à l’hétérogénéité des séquences virales, du fond génétique de la souris, des promoteurs et des méthodes d’analyse la souris, des promoteurs et des méthodes d’analyse phénotypique.phénotypique.
La carcinogenèse est hautement dépendante du fond génétique de la souris.
Sur-expression d’une ou plusieurs protéines du VHC. Pas de manipulation génétique du transgène. Voies métaboliques différentes de l’homme.
PerspectivesPerspectives
Nouveaux modèles:Nouveaux modèles: Transgenèse Transgenèse utilisant des séquences pertinentes de utilisant des séquences pertinentes de
certaines pathologies (génotype 3/stéatose)certaines pathologies (génotype 3/stéatose)
Modèles de foie de souris transduitModèles de foie de souris transduit::o Vecteur d’expression adénoviral permettant l’expression Vecteur d’expression adénoviral permettant l’expression
hépatique des protéines du VHC: adénovirus “helper hépatique des protéines du VHC: adénovirus “helper dependent”dependent”
Avantages : réponse immune, expression à long terme, Avantages : réponse immune, expression à long terme, manipulation des séquences virales.manipulation des séquences virales.