LEZIONE 10Ingegneria animale I
CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO
AA 208-09Adriana Maggi
ANIMALE TRANSGENICO:
• animale nel cui genoma e’ stato introdotto un frammento di DNA esogeno
TRANSGENE • frammento di DNA esogeno integrato stabilmente nel patrimonio genetico di cellule animali o vegetali
METODI DI INGEGNERIA ANIMALE
1 Iniezione di DNA esogeno nella cellula uovo (TRANSGENESI STANDARD)
2 Ingegneria di cellule staminali in coltura e loro iniezione in blastocisti (GENE TARGETING)
3 Enucleazione della cellula uovo e inserzione di un nucleo di una cellula somatica (CLONAZIONE)
TRANSGENESI STANDARD
GENE TARGETING
Microiniezionedel DNA clonato
zigote
Embrionestadio 2 cellule
Impianto nellafemmina
pseudogravida
10-20% dei nascituricontiene il transgene
Trasfezione del DNA clonato
in cellule ES
Iniezione delle cellule staminali nella blastocisti
Impianto della blastocisti in femmina
pseudogravida
Topo chimerico
Ibrido F1
25-75% della progenieportano il transgene
CLONAZIONE
Pecore con muso nero
Cellula somatica con nucleo
Pecore con muso giallo
Oocita enucleato
Trasferimento del nucleo nell’oocita
Impianto nella pecora
Nascita della pecora dal muso giallo
METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Transgenesi standard
SCOPO -GUADAGNO DI FUNZIONE-
esprimere un gene esogeno (transgene) in uno o piu’ tessuti dell’animale.
(Eccezionalmente si puo’ avereperdita di funzione dovuta allaintegrazione del transgenein una sequenza codificante.)
Preparazione oociti fecondati
Preparazione ‘pseudo pregnant’
Screening della progenie
Preparazione costrutti
microiniezione
Transgenesi standard METODO nel dettaglio
Preparazione oociti fecondati
Cocktail ormonale
Incrocio
Recupero uova fecondate
Preparazione del costrutto
Purificazione del transgene
propagazione del transgene
transgene Vettore di clonaggio
Impianto degli oociti microiniettati
Preparazione delle ‘pseudo pregnant’
FemminaMaschio
vasectomizzato
Incrocio
Prelievo delle uova fecondate
MicroiniezioneTrasferimento delle uova fecondate microiniettate con il gene di interesse nell’utero di femmina pseudogravida
Microiniezione e reimpiantodegli oociti microiniettati
Screening della progenie
Analisi del DNA estratto dalle code della progenie per :
Southern blot
PCR
Tecniche utilizzate per la verifica del genotipo
Southern Blot
Ciclo di base Amplificazione
Tecniche utilizzate per la verifica del genotipo
Polymerase chain reaction
Incroci per l’omozigosi
F2Omozigoti 1:4Eterozigoti 1:2Wild type 1:4
Founder/wild type
F1/F1
Transgenesi standard - riepilogo procedura -
• microiniezione del transgene negli oociti fecondati
• impianto nella femmina pseudogravida
• gravidanza e nascita dei ‘Founder’
• Screening dei ‘founder’
• incroci successivi per ottenere l’animale omozigote
METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Transgenesi standard
Destino del DNA dopo la microiniezione
• integrazione stabile nel genoma della linea germinale dell’animale • integrazione in singola copia o con maggior frequenza in copie multiple distribuite secondo un tipico arrangiamento ‘in tandem’
• integrazione nel genoma in posizione casuale tramite
RICOMBINAZIONE NON OMOLOGA
METODI DI INGEGNERIA ANIMALE
Gene targeting
SCOPO -PERDITA DI FUNZIONE-
ablare un gene endogeno attraverso l’inserzione mirata di un transgene
GENE TARGETING
Trasfezione del DNA clonato
in cellule ES
Iniezione delle cellule staminali nella blastocisti
Iniezione delle cellule staminali nella blastocisti
Topo chimerico
Ibrido F1
25-75% della progenieportano il transgene
GENE TARGETING - procedura -
• generazione di cellule staminali (Embryonic Stem cells o cellule ES)
• preparazione del vettore
• trasfezione delle cellule ES con il vettore
• iniezione delle cellule trasfettate nella blastocisti
• generazione di topi mosaico
• incroci successivi per ottenere l’animale con il transgene nella linea germinale
Generazione di cellule staminali ES
Femmine dopo 3-4 giornidal concepimento
Blastocisti
Espianto e messa in coltura
Crescita in terreno selettivo per le ES
Disaggregazione
1 passaggio
Linea pura
Trasfezione del vettore (elettroporazione)
Cellule ES
Selezione dellecellule knock out
Trasfezione delle ES
Strategia di selezione delle ES knock out
Destino del DNA
Integrazione randomIntegrazione sito specifica
Frequenza: Omologa/non omologa = 1/1000
Ricombinazione omologaEs. di gene targeting
Verifica del genotipo
Southern blot
PCR
Iniezione delle cellule ES nella blastocisti
- generazione di animali mosaico -
Incroci per l’omozigosi
F2Omozigoti 1:4Eterozigoti 1:2Wild type 1:4
Founder/wild type
F1/F1
METODI DI INGEGNERIA ANIMALE
Gene targeting
Destino del DNA dopo la microiniezione
• integrazione stabile nel genoma della linea germinale dell’animale • integrazione in singola copia
• integrazione nel genoma in un sito specifico tramite
RICOMBINAZIONE OMOLOGA
METODI DI INGEGNERIA ANIMALE
Clonazione - procedura -
Il nucleo di cellule somatiche (ghiandola mammaria) arrestate nella fase G0 del ciclo cellulare e’ impiantato in un oocita enucleato nella metafase II della meiosi
CLONAZIONE
Pecore con muso nero
Cellula somatica con nucleo
Pecore con muso giallo
Oocita enucleato
Trasferimento del nucleo nell’oocita
Impianto nella pecora
Nascita della pecora dal muso giallo
METODI DI INGEGNERIA ANIMALE
Clonazione
SCOPI
• ottenimento di “gemelli” di un fenotipo di interesse
• nuovo metodo di transgenesi possibilita’ di ingegnerizzare le cellule somatiche da cui si preleva il nucleo per il reimpianto
METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Riepilogo
• transgenesi standard - guadagno di funzione
• gene targeting - perdita di funzione
• clonazione- generazione clonale di individui
GENERAZIONE DI MUTANTI CONDIZIONALI
Il sistema cre-loxP
Gene bersaglio LoxP
LoxP
CRE RICOMBINASI
GENERATION OF THE LID/ERE-Luc MOUSE
Luciferase
ERE sequences
Luciferase
LID (liver-specific IGF-I gene-deficient)
ERE-Luciferase
Albumin promoter
Esone 4
LoxP
CreX
X Ex 4
80% plasma IGF-I
CRE
LID/ERE-Luc
APPLICAZIONI FARMACOLOGICHEDELL’INGEGNERIA ANIMALE
• Studio di funzione genica (ricerca di base)
• Modelli di patologia umana
• Produzione di biofarmaci
• Modelli per lo screening di farmaci
Studi di funzione genica(ricerca di base)
Es. Knock-out dei recettori per le lipoproteine a bassa densita’ e implicazione nei meccanismi patogenetici di insorgenza dell’aterosclerosi
Transgenici per i ligandi dei recettori sopracitati (ApoE e ApoB) e implicazione neimeccanismi patogenetici di insorgenza dell’aterosclerosi
Modelli di patologia umana
Utilizzi in farmacologia
• studio dei meccanismi patogenetici e identificazione di nuovi bersagli farmacologici
• test dell’attivita’ farmacologica di composti
Modelli di patologia umana
• Malattie virali
• Malattie ereditarie
• Malattie neoplastiche
Per approfondimenti Bedell et al. Genes & Development (1997) 11: p. 11-43
Modelli di malattie virali
virus umani spesso non infettano altri mammiferi
Si generano modelli transgenici
Es. Papovavirus JC responsabile della leucoencefalopatia multifocale sviluppo di una patologia simile nel topo transgenico per il virus
Modelli di malattie ereditarie monogeniche
• Es. Knock out per il cluster genicodella beta-globina provoca beta-talassemianel topo
Ciavatta, D. J.; Ryan, T. M.; Farmer, S. C.; Townes, T. M. : Mouse model of human beta-0-thalassemia: targeted deletion of the mouse beta(maj)- and beta(min)-globin genes in embryonic stem cells. Proc. Nat. Acad. Sci. 92: 9259-9263, 1995. PubMed ID : 7568113
Goldberg, Y. et al., Absence of disease phenotype and intergenerational stability of the CAG repeat in transgenic mice expressing the human Huntington disease transcript. Hum. Molec. Genet. 5: 177-185, 1996. PubMed ID : 8824873
• Es. Transgeenico per l’huntightina mutataprovoca la malattia di Huntighton nel topo
Modelli di malattie neoplastiche
Es. Mutazioni nel gene che codifica per APC (ADENOMATOUS POLYPOSIS OF THE COLON)
predispongono ai tumori del colon.La mutazione introdotta per gene targeting anche nel topo provocainsorgenza di tumori intestinali.
Produzione di biofarmaci
Utilizzo di vettori tessuto specifici per esprimere proteine terapeutiche nel latte
o nel siero di animali transgenici
Modelli per lo screening di farmaci
• Topo Transgenico ERE-Luciferasi Modello per lo screening di farmaci attivisul recettore degli estrogeni.
ER cDNACMV
ER
trascrizione
traduzione
SERMS
ER ER
Co-Fact. RNA pol
Luciferasi
trascrizione
traduzione
ER
Attivazionedi ER
SCREENING OF COMPOUNDS MODULATING ERs ACTIVITY
ER
RNA pol
NO trascrizione
prom.ERE LUCIFERASI prom.ERE LUCIFERASI
Strategia per la generazione del topo reporter ER-luc
INTERESSE FARMACOLOGICO DEGLI ESTROGENI
• Terapia endocrina dei tumori
• (Malattie neurodegeneragive)
• (Rischi cardiovascolari)
• Controllo della ferilita’ Disfunzioni endocrine
• Prevenzione dell’osteoporosi
fold
in
du
ctio
n
E2 0 0.5 5 50 250
(g/Kg)
20
10
0
30
300
150
0fold
in
du
ctio
n
E2 0 0.5 5 50 250
(g/Kg)
TIME
20
10
0fold
in
du
ctio
n
E2 0h 3h 6h 16h
30
fold
in
du
ctio
n
E2 0h 3h 6h 16h
10
0
20
250
200
fold
in
du
ctio
n
25
0
250
50
200
E2C
T + E
2T
ICI +
E2
*°
°
fold
in
du
ctio
n
20
10
0
30
E2C
T + E
2T
ICI +
E2
°°
*
DOSE ANTAGONISTS
LIVER
BONE
LUCIFERASE EXPRESSION IN LIVER AND BONE
IMAGING OF ESTROGENIC ACTIVITY
6 h
24h pharmacologicaltreatmentwith E2
6h3h
0h
CYCLING FEMALES
Est
rad
iol
(pg
/ml)
0
25
50DIEST.-1 DIEST-2 PROEST. ESTRUS
13 13 13 13
0
200
400LIVER
0
200
100
E D-1 D-2 P
OVARIES
0
40
80
120BONE
100
200
300
E D-1 D-2 P
BRAIN
PROES. ESTR. DIEST.
P E D