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Il sistema eritrocitario AB0
Il sistema eritrocitario AB0
• Biochimica
• Genetica
• Espressione
• Gruppi principali e loro varianti: nomenclatura
• Anticorpi diretti verso gli antigeni AB0
• Metodiche
• Significato clinico
• Biochimica
La storia: Karl Landsteiner
• 1901: Mescolando sangue e siero di pazienti diverso identificò i gruppi AB0.
http://www.nobelpreis.org/castellano/medizin/images/landsteiner.jpg
Daniels 2002
- gli antigeni ABH e Lewis sono composti da carboidrati
- l’espressione e la distinzione degli antigeni H, A, B e Lewis dipende dalla natura del monosaccaride terminale immunodominante
- La presenza di uno specifico zucchero è determinata dall’azione di uno specifico enzima (transferasi) codificato a livello genico
- le catene di oligosaccaridi possono legarsi a polipeptidi per formare glicoproteine, a ceramidi per formare glicosfingolipidi e a lipidi per formare glicolipidi
- i complessi oligosaccaridici sono parte integrante della membrana eritrocitaria, delle cellule epiteliali ed endoteliali e possono essere riscontrati in vari tipi di secrezioni umane
La molecola di base su cui vengono “costruiti” gli antigeni A, B e H è detta “Precursore”
Galattosio
N-acetilglucosammina
Glucosio
Galattosio Sostanza
Precursore
Globulo Rosso
Precursore = catena oligosaccaridica legata sia a glicosfingolipidi (GR) o a glicoproteine (secrezioni).
Mediante l’aggiunta di uno zucchero alla sostanza precursore viene ottenuto l’antigene H.
Questa è la base su cui si costruiscono gli antigeni A e B.
I geni A e B codificano per enzimi che aggiungono uno zucchero immunodominante all’antigene H.
Formazione dell’antigene H
Glucosio
Galattosio
N-acetilglucosammina
Galattosio
Antigene H
Globulo Rosso
Fucosio
Il gene H codifica per un enzima che aggiunge uno zucchero (Fucosio) allo zucchero terminale della sostanza precursore. La struttura biochimica costituisce l’ Antigene H. (l’allele h è amorfo.)
Formazione dell’antigene A
Fucosio
Glucosio
Galattosio
N-acetilglucosammina
Galattosio
Globulo Rosso
N-acetylgalattosammina
Il gene A codifica per un enzima che aggiunge GalNAc (N-Acetil-D galattosammina) allo zucchero terminale dell’ Antigene H
Formazione dell’antigene B
Glucosio
Galattosio
N-acetiglucosammina
Galattosio
Globulo Rosso
FucosioGalattosio
Il gene B codifica per un enzima che
aggiunge D-Galattoso
allo zucchero terminale dell’ Antigene H.
L’ antigene H si trova solo sui GR in presenza del genotipo HH e Hh ma NON nel genotipo hh (rarissimo).
L’ antigene A si trova nei GR in presenza dei genotipi Hh, HH, e A/A, A/0 o A/B.
L’ antigene B si trova nei GR in presenza dei genotipi Hh, HH, e B/B, B/0 o A/B.
Tratto da: F. Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news 2006
Tratto da: AABB Technical Manual. 15th Edition 2005
• Genetica
Tratto da: AABB Technical Manual. 15th Edition 2005
Localizzazione cromosomica dei gruppi sanguigni
Genetica degli antigeni ABO
1. H gene – H e h alleli (h è amorfo). Si trova sul cromosoma 19.
2. AB0 geni – alleli A, B e 0. Si trovano sul cromosoma 9.
1. Se gene – Se e se alleli (se è amorfo); l’allele Se è presente nell’80 % della popolazione. Si trova sul cromosoma 19.
Stato di secretore
• Il gene Se codifica per la presenza dell’antigene H nelle secrezioni biologiche, quindi la eventuale presenza dell’antigene A e/o B nelle secrezioni oltre alla presenza dei rispettivi geni (A e B), dipende dalla presenza del gene Se e dell’antigene H
Gene Se (SeSe o Sese)
Antigene H nelle secrezioni
antigene A
antigene B
Gene se (sese) Nessun antigene A, B o H presente nelle secrezioni
e/o
Tratto da: F. Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news 2006
Tratto da: F. Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news 2006
Genotipo Fenotipo
00 0
A0
AA
A
B0
BB
B
AB AB
Generazione parentale: omozigoti
1° Generazione: eterozigoti
Accoppiamento con eterozigoti A0 / B0
2° Generazione: eterozigoti
Tratto da: AABB Technical Manual. 15th Edition 2005
P1: Padre fenotipo A Madre Fenotipo A
Esempio 1
F1: Figlio 1 fenotipo 0 Figlio 2 Fenotipo A
Genotipi?
P1: Padre fenotipo A Madre fenotipo A
genotipo A0 genotipo A0
Esempio 1
F1: Figlio 1 fenotipo 0 Figlio 2 fenotipo A
genotipo 00 genotipo AA o A0
Genotipi?
P1: Padre fenotipo AB Madre fenotipo A
Esempio 2
F1: Figlio 1 fenotipo 0 Figlio 2 fenotipo A
Genotipi?
• Espressione
Gruppo O Gruppo A
Molti Antigeni H Pochi Antigeni H A
A A
AA
La grande maggioranza (ma non tutti) degli antigeni H nel gruppo A e B vengono trasformati in antigeni A o B
Maggiori quantità di H
Minoriquantità di H
O > A2 > B > A2B > A1 > A1B
Fenotipo Bombay (Oh)
• Dipende da un genotipo hh– I globuli rossi sono privi di antigeni H e quindi
anche degli antigeni A e B… c’è solo la sostanza precursore
– Descritto per la prima volta a Bombay, India– I GR NON sono agglutinati da anti-A, Anti-B o Anti-H
(Ulex europaeus - lectina)– Il Siero ha attività anti-A, anti-B e anti-H; agglutina
quindi tutti i gruppi ABO.
• Che gruppo ABO usereste per trasfondere questi pazienti ?
Antigeni A e B :Una funzione ?
• Sconosciuta !
• Soggetti AB più resistenti al colera
• Lo stato di secretore conferisce ulteriore protezione
• Soggetti 0 più resistenti alla malaria
• Forse rimasti per pressione selettiva positiva
Espressione antigeni AB0
• Membrana eritrocitaria• Tessuti
– endotelio vasi sanguigni– epitelio degli organi di secrezione ed
escrezione• Secrezioni (quando presente Se)
– saliva– succhi gastrici– liquido seminale– fluidi di cisti ovariche– Latte– Urine
• Gruppi principali e loro varianti
Tratto da: F. Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news 2006
Sottogruppi ABO
• I sottogruppi ABO differiscono nella quantità di
antigene presente sulla membrana dei GR:
hanno meno antigene
• Sono il risultato della presenza di trasferasi
meno efficienti nell’aggiungere gli zuccheri
immunodominanti alla sostanza H
• I sottogruppi di A sono più frequenti di quelli di B
Sottogruppi di A: A1 e A2
• I due principali sottogruppi di A sono: A1 e A2
– Entrambi reagiscono “fortemente” con anti-A
– Per distinguere A1 da A2 si può utilizzare la lectina Dolichos
biflorus (anti-A1)
– La Lectina anti-H reagisce fortemente con le emazie A2
(meno antigeni A sul GR)– 80% degli individui di gruppo A o AB sono di suttogruppo
A1, 20% are A2 and A2B
– Circa 1/10 dei soggetti A2 hanno anticorpi anti A1 che
generano una discrepanza nella prova indiretta con A1
– Risoluzione: La prova indiretta con emazie A2 è negativa, la
reazione con la lectina anti- A1 è negativa.
N. siti antigenici sulla superficie degli eritrociti
Gruppo A1
8 - 12 x 105
Gruppo A1B 5 - 9 x 105
Gruppo A2B 1 x 105
Gruppo A2 1 - 4 x 105
Gestione trasfusionale dei soggetti A2
• Gli anticorpi anti A1 prodotti da un soggetto A2 sono nella stragrande maggioranza dei casi NON clinicamente significativi (anticorpi freddi)
• Ad un soggetto A2 si possono quindi trasfondere emazie A1
Altri sottogruppi A
• Vi sono altri sottogruppi anche se molto più rari:– Aint (intermediate), A3, Ax, Am, Aend, Ael, Abantu
• Le emazie A3 danno una reazione a campi misti quando cimentati con anti-A policlonali, possono contenere anti-A1
• I gruppi Ax, Am, Ael danno una reazione diretta perfettamente negativa, la presenza dell’antigene è sospettata dalla completa assenza di reazione sierica con le emazie A. – Non è noto come queste emazie vengano tollerate in
caso di trasfusione a soggetto 0.
Sottogruppi B
• I sottogruppi B sono ancora più rari degli A
• Si differenziano per il tipo di reazione con i rispettivi sieri anti-B, anti-A,B, anti-H
• Quelli noti sono: B3, Bx, Bm, and Bel
Tratto da: AABB Technical Manual. 15th Edition 2005
Tratto da: F. Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news 2006
Qualche problema con la nomenclatura…
AB0 e Lewis: uno stretto legame
• Sistema Lewsi: Ag Lea e Leb
• Risultano dalla azione di una glicosiltrasferasi codificata da un allele Le che aggiunge uno zucchero ad una catena precursore
• Lea è prodotto quando Le è ereditato con alleli sese (soggetti non secretori)
• Leb quando Le è ereditato con almeno un allele Se (secretori)
• Se si eredita l’allele amorfo le, non si produrrà alcun antigene Lewis Le(a-b-)
• Lea e Leb non sono antigeni antitetici ma risultano dalla interazione di alleli ereditati indipendentemente
• Gli antigeni Lewis non sono intrinseci alla membrana dei globuli rossi ma sono espressisu glicosfingolipidi adsorbiti dal plasma sulla membrana
Tratto da: AABB Technical Manual. 15th Edition 2005
• Anticorpi diretti verso gli antigeni AB0
Gli Anticorpi “Regolari”: la regola di Landsteiner
• Soggetti normali e sani possiedono NATURALMENTE
gli anticorpi anti-A o anti-B diretti contro gli antigeni A o
B che è assente sui loro Globuli Rossi
• In altre parole NON richiedono una esposizione
(trasfusione o gravidanza) ad emazie estranee
• NON sono presenti alla nascità, e perciò si pensa
siano stimolati da antigeni ambientali (probabilmente
batterici) a cui siamo tutti esposti
Anticorpi anti-A / anti-B• Le IgM sono predominanti negli individui di Gruppo
A e di gruppo B– Anti-A– Anti-B
• IgG (con una minoranza di IgM) è l’anticorpo predominante negli individui di gruppo 0– Anti-A,B ( con alcuni anti-A e anti-B)
• Reagiscono a Temperatura Ambiente• Attivano facilmente il complemento ( sopratutto le
IgM)• Sono ad alto titolo (grado di reazione 4+)
Anticorpi AB0: evoluzione con l’età
• Di solito compaiono dopo 3-6 mesi di vita
– Ma i neonati possono acquisire passivamente le IgG materne: NON SI DEVE FARE la PROVA INDIRETTA (sierica) nel sangue dei neonati
• Titolo stabile a 5-6 anni
• Declinano nell’anziano
Anti-A1
• Individui di gruppo O e B presentano anti-A nel loro siero• Tuttavia gli anti-A possono essere divisi in due categorie
distinte: anti-A e anti-A1
• Infatti l’antigene A è presente in due forme A1 e A2 • Anti-A1 agglutina solo l’antigene A1 non l’ A2 • L’anti-A agglutina entrambi; non esiste un anti-A2. • Una piccola parte dei soggetti A2 può sviluppare
anti-A1
• In questo caso si è di fronte ad una “discrepanza” alla tipizzazione
• Gli Anti-A1 sviluppati dagli A2 non danno pressochè mai luogo a conseguenze cliniche in caso di trasfusione con sangue A1
Anti-A,B
• Presenti nel siero dei soggetti di gruppo 0
• Reagisce con emazie A, B, ed AB
• Sono prevalentemente IgG (con una piccola quota di IgM)
• Anti-A,B è un singolo anticorpo, non una miscela di anti-A and anti-B
• Metodiche
La determinazione del gruppo AB0 deve necessariamente includere:
•una prova diretta sugli eritrociti con utilizzo di antisieri specifici con anticorpi monoclonali anti-A, anti-B , anti-A,B
•un indagine indiretta sul siero/plasma dello stesso soggetto utilizzando emazie di gruppo noto (A1, A2 e B)
Ciascuna delle due indagini rappresenta il controllo dell’altro.
Basta un campione anticoagulato con EDTA
Tipizzazione AB0
Tipizzazione AB0 risultati attesi
anti-A anti-B Emazie
A1 e A2
Emazie
BgruppoAB0
% Caucasici
% Africani.
1 0 0 + + 0 45 49
2 + 0 0 + A 40 27
3 0 + + 0 B 11 20
4 + + 0 0 AB 4 4
Rezione delle emazie da tipizzare
con:
Reazione del siero del sangue da tipizzare con:
Anti-B Anti-A Anti A,B
GR-A1 GR-A2 GR-B
Discrepanze AB0:Una discrepanza si ha quando la prova diretta
(globulare) non è confermata da una prova indiretta (sierica)
PazientePaziente Anti-AAnti-A Anti-BAnti-B GR AGR A11 GR B GR B
11 4+4+ 1+1+ 00 4+4+
22 00 4+4+ 1+1+ 00
33 4+4+ 4+4+ 1+1+ 00
44 00 3+3+ 00 00
Discrepanze AB0: dovute a 2 situazioni:
• Problemi con i Globuli Rossi– Antigeni con debole/assente reattività – Extra antigeni– Reazioni a campo misto– Trasfusioni recenti con GR non-omogruppo
• Problemi con il Siero– Anticorpi con debole/assente reattività – Extra anticorpi
Che fare?
• Identificare la causa• Escludere innanzitutto un problema
tecnico– Provetta sbagliata/ mal etichettata– Reagente non dispensato
• Primi passi: ripetere il test sullo stesso camione ; richiedere un ulteriore campione; lavare le emazie
• In alcuni casi ci sono delle vere discrepanze legate a fattori globulari (GR) o sierici
Cosa fare con una discrepanza irrisolta e/o in emergenza?
• Escludere un fenotipo Bombay
• Escludere la presenza di un allo-anticorpo freddo potenzialmente significativo (cross match negativo)
• In urgenza trasfondere gruppo 0
Saprò farlo funzionare?
Possono causare tutte reazioni positive (panagglutinazione)
Possibili cause dellediscrepanze di gruppo ABO
Discrepanze nella tipizzazione ABO diretta: risoluzione problemi
FALSI NEGATIVI FALSI POSITIVI
Aggiunti i reattivi ?? Eccessiva centrifugazione
L’emolisi è una reazione positiva !! (Ac freddi anti A-B-H-Lea)
Reagenti/campioni contaminati da batteri
Errato rapporto antisiero/cellule
Sbagliata interpretazione o registrazione
Insufficiente centrifugazione
Incubazione a T > 20-24 °C
Discrepanze nella prova indiretta ABO: risoluzione problemi
• Coaguli di fibrina• Conc. Anomala di proteine, HMW plasma
expanders: formano rouleaux visibili al microscopio; diluire il siero con salina
• Agglutinine a freddo nell’antisiero: reazioni più deboli; preriscaldare l’antisiero
• Immunodeficit (età, patologia, terapia): verificare la diagnosi o l’età
• Nel 1986 è stato clonato il gene del sistema MN
(gene GYPA)
• Le basi molecolari di 28 su 29 sistemi di gruppo
sanguigno sono state definite
• Partendo da tests su DNA genomico, è possibile
predire con un buon grado di accuratezza i fenotipi
dei principali gruppi sanguigni
Biologia molecolare e immunoematologia
Genotipo=AelB1
Fenotipo=AelB
• Significato clinico
Perché il sistema AB0 è importante?• In assenza dell’antigene, sono attesi gli anticorpi corrispondenti• Gli anticorpi sono spesso presenti ad elevato titolo ed avidità,
anche se il soggetto non è stato stimolato immunologicamente• Gli anticorpi sono reattivi a basse temperature ma a differenza
di molti altri anticorpi freddi sono in grado di legarsi al corrispondente Ag anche a 37°C
• Gli antigeni A e B sono presenti in grandi quantità sui globuli rossi
• Sia che siano IgG o IgM , gli anticorpi ABO attivano con efficienza il complemento – Questo significa che la trasfusione di emazie AB0
incompatibili è in grado di causare reazioni emolitiche acute catastrofiche
• La compatibilità AB0 è quindi il fondamento dei test pretrasfusionali
Schema di compatibilità ABO per la trasfusione di emazie “concentrate”
Schema di compatibilità ABO per la trasfusione di plasma
E le piastrine?• Trasfondere preferenzialmente omogruppo• Le piastrine esprimono gli Antigeni A e B e
questo può associarsi ad una ridotta sopravvivenza in caso di trasfusione “incompatibile”
• I concentrati piastrinici sono un prodotto con una quantità variabile di plasma (molto in caso di aferesi poco in caso di assemblati da buffy risospesi in soluzione conservant)
• il rischio di emolisi da incompatibilità da plasma 0 pericoloso non va sottovalutato
Gli Zero Pericolosi……• Alcuni rari soggetti di gruppo 0 presentano degli anticorpi
(in genere anti-A) ad alte concentrazioni • La trasfusione anche di pochi millilitri di sangue di questi
soggetto sono capaci di causare una emolisi massiva delle emazie del ricevente
• Questo rischio non è “negligible” in caso di trasfusione di piastrine sospese in plasma O
• Per questo per un utilizzo universale è consigliabile“screenare” la presenza ed il titolo delle emolisine in donatori 0 di piastrine in aferesi: le piastrine di donatori con presenza di anticorpi anti-A o B ad alto titolo e/o con spiccata azione emolitica sono riservate a pazienti di gruppo 0
Sistema AB0 e trapianti
• Anticorpi del sistema AB0 possono:
– essere causa di rigetto di organi solidi (rene, cuore, fegato)
– influenzare negativamente l’attecchimento del midollo osseo trapiantato
Conclusioni• Il sistema AB0 è una base
fondamentale della immunoematologia e della medicina trasfusionale
• Ha una rilevanza anche nel trapianto di organi solidi
• “In immunoematologia poche regole e molte eccezioni…a cominciare dall’ABO”
• Fortunatamente l’utilizzo di antisieri monoclonali e di metodi automatizzati e standardizzati hanno ridotto discrepanze AB0 dovute a fattori interferenti ed alla aspecificità dei sieri policlonali umani usati in passato
Per saperne di più
- Fernanda Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news n. 22 2006
- M. Murphy, D. Pamphilon eds. Practical Transfusion Medicine. Blackwell 2001.
- G. L. Daniels. Human Blood Groups. Blackwell 2002.
- AABB Technical Manual. 15th edition 2005.
- Massimo La Raja. http://immunoematologia.blogspot.com/2009/03/processo-trasfusionale-prova.html