Download - LP 7 Explorarea Metabolismului Proteic
Explorarea în laborator a
metabolismului proteic
Lucrarea practică nr. 7
Laborator Biochimie Clinica
Clasele de proteine plasmatice
Plasma - amestec coloidal
Clasele de proteine plasmatice:
albuminele
globulinele
Indexul de disproteinemie:
raportul de concentraţie
A/G = 0,8 - 1,2.
Proteinemia concentraţia proteinelor totale din plasmă
Metode:
În ser sau plasmă:
Metodă fotometrică: reacţia biuretului: în mediu alcalin
legăturile peptidice reacţionează cu ionii de Cu(II) cu formarea unui
compus colorat violet, a cărei întensitate se determină la 546 nm;
metoda Kjeldahl: -se bazează pe determinarea conţinutului în azot
- metoda de referință în estimarea conținutului
în proteine
În urină sau LCR:
Metoda Coomassie: utilizarea colorantului Coomassie Brillant
Blue (prag de detecţie: 100-1000 ng proteine) - macrometoda
pyrogallol red ( prag de detecţie: 1μg proteină/ml) - micrometoda
Material biologic : ser, plasmă (heparinată), urină, LCR, lichide
de puncţie – r.Rivalta (acid acetic glacial)
Proteinemia
Reacția biuretului
Proteinemia
Valori normale:
ser sau plasmă:
60 - 80 g/l (adult)
45-75 g/l (nou-născuţi şi sugari)
urină: < 150 mg/zi
LCR: 0,15- 0,45 g/l
Proteinemia
Disproteinemie – modificarea calitativă/cantitativă a
conţinutului în proteine a plasmei;
Valori scăzute (hipoproteinemie):
insuficienţă hepatică, sindrom nefrotic, arsuri, enteropatii,
malnutriţie / malabsorbţie, insuficienţă panceatică;
pseudohipoproteimemie: prin diluţie (recoltare de pe branulă)
Valori crescute (hiperproteinemie):
hiperproteinemii absolute: hiperimunoglobulinemie: cronice,
gamopatii monoclonale;
hiperproteinemii relative: hemoconcentraţie, diabet insipid, diaree.
Albumine forma globulară, dimensiune și greutate moleculară mică (60000-69000Da)
factori stabilizanți ai echilibrului coloidal al plasmei – solubilitate bună
Dozare ser: metode fotometrice (verde de bromcrezol)
procentaj relativ din proteinogramă sau cantitate absolută calculată din valoarea proteinemiei
imunodifuziune radială
nefelometrie imună
imunturbidimetrie
Dozare urină şi LCR: nefelometrie, turbidimetrie;
Valori normale: ser: 55-65% din totalul proteinelor plasmatice; 34 - 48 g/l.
Urină: sub 20 mg/l;
LCR: 110-350 mg/l;
Valori scăzute: insuficienţă hepatică, sindrom nefrotic, arsuri, inflamaţii acute şi cronice, enteropatii, tumori maligne.
Probe biologice: ser, urină, LCR;
Microalbuminuria
Apare în anumite stări patologice: DZ, obezitate, hiperlipidemie, hipertensiune arterială, rezistenţă la insulină, consum de alcool.
Valoare normală: prima urină de dimineaţă < 20 mg/l
urină pe 24 ore: <30 mg/zi
Creşteri uşoare ale microalbuminuriei caracterizează faza reversibilă a nefropatiei diabetice, care răspunde favorabil la terapie.
Metode de dozare:
- imunotirbidimetrie,
- inmunonefelometrie
Proteinuria Bence-Jones
lanţurile uşoare de tip sau kappa sau lambda
apare în - plasmocitoame
- macroglobulinemia Waldenström.
Metode de evidenţiere:
imunofixare (prag de sensibilitate: 20-30 mg/l)
electroforeza urinară (prag de sensibilitate: aprox. 100 mg/l).
Electroforeza proteinelor
metodă analitică de separare a particulelor sau
ansamblurilor de particule încărcate electric, sub
acţiunea unui câmp electric extern
o particulă încărcată electric se va deplasa cu o
viteză constantă determinată de acţiunea
următoarelor forţe:
forţa de atracţie electroforetică F1 :
F1= Q · E
forţa de frecare Stokes F2:
F2 = 6π ·η· r · v
Electroforeza proteinelor
viteza electroforetică v:
v = Q· E / 6 π· η· r
mobilitatea
electroforetică μ :
μ= v / E,
μ = Q / 6π · η ·r
particulele pentru care
raportul Q/r este identic
vor avea mobilităţi
electroforetice identice
Electroforeza proteinelor
Mediu de migrare: agaroză,
pH: 8.6 (tampon TRIS
barbital),
Colorant: amido black
Electroforeza proteinelor
Se aplică 5 µl de ser pe gelul de agaroză
Se aşteaptă 10 min. (penetrarea serului în gel)
Se introduce gelul înaparatul de electroforeză
Se aplică tamponul TRIS barbital
Se alege programul de migrare
După migrare şi uscare se transferă gelul în unitatea de colorare
Electroforeza proteinelor
După colorare se
interpretează
Inspecţie
Interpretare
densitometrică
Fracţiunile electroforeticeFracţiunile proteinelor serice:
albumina
α1- globuline:
α1- lipoproteină (HDL),
α1-glicoproteina acidă,
α1-antitripsină,
α 1-antichimotripsină,
α2-globuline:
haptoglobină,
ceruloplasmină,,
α2-macroglobulină,
β1 şi β2 globuline:
β-lipoproteine,
hemopexina,
factorul C3,
transferina,
PCR,
fibrinogen.
fracţiunea γ-globulinelor:
IgM, IgA şi IgG.
Proteinograma Valori normale (procentual
calculate din densitograme):
albumină: 45-60%
α1-globuline: 2.5-7.0 %
α2-globuline: 7.0-14.0 %
β-globuline: 9.0-17.0 %
γ-globuline: 16.0-24.8%
Trasee electroforetice
Ciroză hepatică cu pod
beta-gamma
Ciroză hepatică cu ascită;
Proteine totale: 71 g/l
Albumină: 49 g/l
Hipoalbuminemie;
Pod beta-gamma;
Trasee electroforetice
Sindrom nefrotic Proteinurie 9,5g/24 ore;
Proteine totale: 35 g/l;
Albumină: 18 g/l;
↓ albuminemie;
↑ Alfa1- globulinemie;
↑ alfa2-globulinemie;
↑ beta-globulinemie;
Trasee electroforetice
Sindrom inflamator
cronic (sindrom Crohn)
Proteine totale: 61 g/l;
Albumină: 26 g/l;
↓ albuminemie;
↑alfa2- şi alfa2 glubuline;
↑ gammaglobulinemie
policlonală;
Trasee electrofretice
Inflamaţie acută
(otită medie, mastiodită)
Băiat de 2 ani;
Proteine totale: 57 g/l;
Albumină: 36 g/l;
↓ albuminemie;
↑ alfa1- şi alfa2
globulinemie;
↑ gammaglobulinemie;
Trasee electroforetice
Anemie feriprivă Proteine totale: 73 g/l;
Albumină: 43 g/l;
↑ beta-globulinemie
(transferina!);
Trasee electroforetice
Hipogamaglobulinemie
(leucemie mieloidă acută)
Proteine totale: 61 g/l;
Albumină: 44 g/l;
↓ albuminemie;
↑ alfa1- alfa2 globulinemie;
↑ betaglobulinemie;
↓gammaglobulinemie;
Trasee electroforetice
Hipogamaglobulinemie
(leucemie limfatică
cronică)
Proteine totale: 55 g/l;
Albumină: 49 g/l;
↓ albuminemie;
↓ gammaglobulinemie;
Trasee electroforetice
Mielom multiplu Proteine totale: 109 g/l;
Albumină: 36 g/l;
↓ albuminemie;
Gradient M în gamma1
Proteinuria:
Clasificare: proteinurii renale:
proteinurie glomerulară: trecerea în urină a proteinelor cu greutate moleculară mare; proteinurie selectivă: apare doar albumina şi transferina;
proteinurie neselectivă: pe lângă albumină şi transferină apar proteine cu greutate moleculară mare (de ex. Imunoglobuline);
proteinurii tubulare: apariţia proteinelor cu greutate moleculară mică datorită reabsorbţiei tubulare deficitare;
forme mixte: în special în cazurile de afecţiuni renale avansate apare proteinurie glomerulară şi tubulară;
Proteinurii postrenale: infecţii şi hemoragii urogenitale;
Proteinurii prerenale: hiperproteinemii (gamopatie monoclonală);
Electroforeză urinară
Indici de selectivitate a
proteinuriilor:
IgG/ albumină
• Proteinurie renală < 0,2
• Proteinurie glomerulară selectivă < 0,03
• Proteinurie glomerulară neselectivă > 0,03
• Proteinurie postrenală > 0,2
Electroforeză urinară
Electroforeza LCR
Valori normale:
Prealbumina: 2-7%
Albumina: 56-76%
α1-globuline: 2-7%
α1-globuline: 3,5-12%
β1 şi β2 globuline: 8-18%
γ globuline: 7-12%
Utilitate clinică:
- Scleroza multiplă – apar fracțiuni oligoclonale de proteine
- Infecții ale SNC
Electroforeza LCR
Metode de dozare - turbidimetrie
Turbidimetria măsoară scaderea
intensitatii unei radiatii
luminoase ,care nu isi modifica
drumul optic, la trecerea prin
proba de analizat, datorita reflectiei,
absorbtiei sau imprastierii.
Turbiditatea intr-un lichid –
cauzata de prezenta particulelor
suspendate, care sunt fin divizate.
Daca o raza trece printr-o proba
turbida, intensitatea este redusa de
imprastiere, iar cantitatea luminii
imprastiate este dependenta de
concentratia si marimea particulelor.
Metode de dozare - nefelometria Măsurarea intensităţii unei radiaţii
luminoase reflectate sub un anumit unghi;
Nefelometria măsoară intensitatea luminii
împrăștiate sub un anumit unghi, la trecerea unei radiații prin proba de analizat.
Turbidimetria - masoara intensitatea
luminii transmise prin proba
- utilizata in cuantificarea proteinelor serice
- IgG, IgA, IgM si IgE
- C3, C4, C1 inhibitor
- haptoglobina, PCR, transferina, albumina, alfa1-antitripsina, alfa2-macroglobulina, fibrinogenul, ceruloplasmina, factorulreumatoid