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Engenharia Enzimática
Luis P. FonsecaMestrado em Engenharia Biológica
3º Ano – 2º Semestre – 2007/2008
Centro de Engenharia Biológica e Química,
Torre de Química, 8º piso, ext. 3065/3139
Lição de Biocatálise
Bibliografia geral
• - Cabral JMS, Aires-Barros MR, Gama M (eds.) “Engenharia Enzimática” Lidel-Edições Técnicas, Lda, Lisboa (Portugal) 2003.
• - H. W. Blanch and D. S. Clark “Biochemical Engineering”Marcel Dekker, NY, USA, Cap 6, 1997.
• - Buchholz K, Kasche V, Bornscheuer UT “Biocatalysts and Enzyme Tecnhology” Wiley-VCH, Darmstad (Germany) 2005.
• - D. Demirjian, P. Shah e F. Moris-Varas “ Screening for Novel Enzymes” em “Biocatalysis – From Discovery to Application” W.- D. Fessner (Ed.) Springer, Heidelberg, Germany, 2000.
• Tramper, “Multiphase Bioreactor Design”, Taylor and Francis Books, London, 2001.
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Lição de Biocatálise
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Engenharia enzimática
1. Introdução
2. Produção de Enzimas
3. Isolamento e Purificação de Enzimas
4. Actividade e Estabilização de Enzimas
5. Métodos de Estabilização de Enzimas
6. Cinética de Biocatalisadores Imobilizados
7. Reactores Enzimáticos
8. Biocatálise em Solventes Orgânicos
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Engenharia enzimática1 Introdução
Lição de Biocatálise
As primeiras aplicações de enzimas podem ser descritas como uma ARTE.
Estas aplicações têm origens na China antiga e no Japão, na manufactura de alimentos e bebidas alcoólicas em que eram usadas amilases e proteases de origem vegetal e microbiana.
Por exemplo, a produção de queijo era conseguida através da agitação de leite com um ramo de figueira, que liberta uma protease, a ficina, que promove a coagulação do leite.
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A biocatálise aplicada, COM UMA BASE CIENTIFICA, remonta ao final do século XIX, com a introdução de preparações padronizadas de renilasesno fabrico industrial do queijo. Contudo, a implementação de novas aplicações industriais de enzimas foi muito lenta, só surgindo de forma intensa nos últimos 30 anos.
Por exemplo, a aplicação de proteases, nomeadamente tripsina, na indústria de detergentes, assim como, as pectinases na indústria dos sumos demorou mais de 50 anos a ser comercializada a nível industrial e só em 1955 se concretiza a utilização industrial da glucoamilase na produção de dextrosea partir do amido.
Mais recentemente a utilização de tecnologias de ADN recombinado, que permitem a obtenção em larga escala de enzimas com elevada produtividade e o "design" mais adequado do enzima, são as principais razões para a importância actual dos enzimas a nível industrial.
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Actualmente a nível mundial há:
- 12 produtores principais de enzimas e cerca de 60 companhias mais pequenas que operam com produtos mais especializados.
- ~ 60% da capacidade instalada de produção de enzimas está concentrada na Europa.
- ~ 75% dos enzimas com aplicações industriais são hidrolases, que
actuam despolimerizando substâncias naturais (ex: amido, proteínas, …).
- As proteases representam o grupo principal, porque são utilizadas em
grandes quantidades nas indústrias dos lacticínios (coagulantes) e dos
detergentes, representando cerca de 40% das vendas totais.
- O segundo grupo mais importante corresponde às glicanases, utilizadas nas
indústrias da panificação, cerveja, amido e têxteis.
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O mercado mundial de enzimas passou de cerca de 400 milhões de dólares americanos, em 1983, para 1 bilião, em 1995. Estima-se que esse valor deverá duplicar até 2005.
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Engenharia enzimática1 Introdução
Mercado de enzimas em 1994 (à esquerda); previsão para 2005 (à direita).
A rubrica “outros” inclui actualmente pelo menos 12 sectores:álcool, alimentação animal e rações, panificação, biotransformações
enzimáticas, diagnósticos, óleos e gorduras, aromatizantes, vinho e sumos,curtumes, papel e tratamentos de resíduos.
Qual uso dos enzimas e biocatalisadores pelo homem?
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INDÚSTRIA DE DETERGENTES
- Hoje em dia, cerca de metade de todos os detergentes existentes no mercado contêm enzimas, em particular proteases, amilases, celulases e lipases.
- Os enzimas, além de aumentarem a eficiência de lavagem, permitem
trabalhar a temperaturas mais baixas e reduzir os períodos de lavagem e,
consequentemente, os gastos energéticos associados com a agitação.
- As 4 categorias de enzimas usados na indústria de detergentes são:
- proteases para remoção de resíduos proteicos,
- amilases para degradação do amido,
- lipases para a hidrólise de gorduras e
- celulases para melhoria da maciez da roupa e realce do brilho das cores.
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Para um enzima ser usado num detergente deve satisfazer alguns requisitos:
- Actividade e estabilidade adequadas para valores de pH alcalinos e manter-
se activo e estável numa gama de temperaturas bastante alargada (entre 10 a 60°C).
- Na formulação de detergentes para uso doméstico, o objectivo é desenvolver enzimas eficientes a baixas temperaturas.
- Adicionalmente, um enzima deve ser resistente à hidrólise e oxidação por
outras substâncias existentes nos detergentes, nomeadamente, proteases.
- A utilização de técnicas de engenharia genética veio permitir o “design” e
desenvolvimento de enzimas com as características desejadas em termos de
actividade e estabilidade.
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INDÚSTRIA FARMACÊUTICA
- O desenvolvimento e utilização de enzimas em aplicações médicas é cada
vez maior, reflectindo o potencial destes catalisadores biológicos para
aplicações in vivo.
- Nas aplicações biomédicas de enzimas pode-se destacar a utilização, desde o século XIX, de uma mistura impura de enzimas do pâncreas de porco,
chamada pancreatina. Este enzima é administrado oralmente como ajudante
da digestão de pessoas deficientes nessas enzimas devido a desordens
genéticas, remoções cirúrgicas do pâncreas ou envelhecimento precoce.
- Outro exemplo é o da lipase de Rhizopus arrhizus, que mantém a sua
actividade no ambiente ácido do estômago.
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Muitos outros enzimas tem sido usados como agentes terapêuticos.
Tabela -1 — Enzimas como agentes terapêuticos.
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APLICAÇÕES ANALÍTICAS E DIAGNÓSTICO
- O maior mercado dos enzimas analíticos reside actualmente nos diagnósticos clínicos in vitro.
- Cerca de 50 enzimas são hoje em dia testados e utilizados neste domínio. Este
mercado representava cerca de 100 milhões de dólares americanos em 1997, com especial destaque para a fosfatase alcalina e peroxidase do rábano.
- A fosfatase alcalina era extraída da mucosa intestinal de bovinos mas passou, a ser produzida por fermentação com microrganismos geneticamente manipulados.
- Os enzimas para fins de diagnóstico, devem possuir elevado grau de pureza, implicando a utilização de processos de purificação complexos e dispendiosos.
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Engenharia enzimática1 Introdução
- Os biossensores têm sido muito utilizados principalmente em análises
clínicas à urina e ao sangue. Neste último caso, com aplicações in vivo ou in vitro como sejam a medição do pH, oxigénio, ião sódio, glucose, ureia, drogas, etc.
- Na área das análises clínicas, uma aplicação importante de enzimas em
diagnóstico clínico relaciona-se com o controlo da glucose em pacientes
com diabetes e, mais recentemente, do colesterol.
Tabela 1 — Áreas de aplicação de biossensores.
Aplicações industriais de enzimas
Enzimas como produtos finaisAplicações analíticasDetergentesLimpeza e higieneFarmacêuticaAlimentação animal e rações
Enzimas como aditivos do processoTêxtilPeles e curtumesPapel e pasta de papelAçúcarCafé
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Aplicações industriais de enzimas
Enzimas na produção de alimentos e bebidasLacticíniosCervejaVinícola e sumosÁlcoolProteínaCarnePanificaçãoÓleos e gorduras
Enzimas em processos de Biocatálise/BiotransformaçãoProcessamento do amidoAntibióticosQuímica fina
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Biocatalisadores Industriais
• O termo biocatalisador é usado para enzimas puros, misturas de enzimas, formulações de enzimas, enzimas impuros, fragmentos celulares e células na forma livre ou imobilizada.
• Hoje em dia, são poucos os casos em que se usam plantas e animais para isolar enzimas, a maior parte dos enzimas industriais são produzidos por microorganismos em cultura submersa, nos fermentadores.
• O preço de um dado enzima depende do tamanho do mercado, competitividade e do desempenho do enzima (produtividade). Além disso, dependendo do tipo de aplicação pois em alguns casos não é necessário usar enzimas muito puros.
• Os enzimas analíticos e farmacêuticos têm o mercado mais pequeno em peso, varia de 1 kg a 1 tonelada, no entanto, financeiramente o mercado é considerável. Por exemplo, o Factor VIII, um enzima trombolítico tem um mercado mundial de 1 kg mas que corresponde a 1 milhão de dólares.
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Biocatalisadores Industriais
• Os enzimas analíticos e farmacêuticos têm o mercado mais pequeno em peso, varia de 1 kg a 1 tonelada, no entanto, financeiramente o mercado éconsiderável. Por exemplo, o Factor VIII, um enzima trombolítico tem um mercado mundial de 1 kg mas que corresponde a 1 milhão de dólares.
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Engenharia enzimática1 Introdução
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Engenharia enzimática1 Introdução
Bulk enzyme
Analytical
PharmaceuticalSpeciality
Biocatalisadores na área dos xaropes de glucose e fructose (HFCS)
• Os xaropes de glucose HFCS (contendo 55% fructose) são largamente utilizados na indústria alimentar principalmente pela Coca- e Pepsi-Cola e outros refrigerantes.
• A fructose é mais adoçante do que a glucose e não acarreta os graves problemas associado á diabetes como os verificados com a glucose.
• Como não é possível a isomerização química destes açúcares e, por outro lado, não há outras fontes de fructose ainda economicamente disponíveis como seja a hidrólise da inulina, a descoberta de um processo enzimático de isomerizaçãodestes açúcares teve enorme impacto industrial na década de 60.
• Este processo baseia-se na utilização de células com elevada actividade (teor) ou de enzima imobilizado, a glucose isomerase e mais quando se verificou que este enzima não precisava de nenhum co-factor para realizar a isomerização.
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Biocatalisadores na área dos adoçantes como o aspartame
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• O aspartame tem cerca de 200 vezes mais poder adoçante do que a sacarose muito usado em refrigerantes e outras bebidas.
• O aspartame tem um mercado de ~$1 B US do qual 75% do mercado é controlado pela Nutrasweet devido a protecção da patente de síntese por via química.
• Recentemente foram estabelecidos métodos de síntese por via biocatalitica e hoje em dia já produz e representa cerca de ~ 25% do mercado.
• O enzima que sintetisa o aspartame (asp-phe-methyl ester) é um processo enantio-selectivo que só reage entre o L-phe-oMe e não o D-phe-oMe o que permite a utilização de percursores (substratos) mais baratos pois o processo químico tem forçosamente de utilizar o L-phenylalanine-o-me previamente purificado por resolução racémica.
• Este enzima é regioselectivo e não reage com o grupo β-carbóxico do ácido aspártico e também não apresenta actividade de esterase e, por isso, não hidrolisa o éster pelo grupo metil o qual é essencial para o poder adoçante no grupo phe-o-me.
• Por outro lado, o este enzima não é facilmente desactivado pelo solvente orgânico ou termicamente o que permite que a reacção ocorra em solvente orgânico onde estes reagentes e produtos são mais solúveis.
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• O penicilina G foi descoberta por Fleming em 1932 e foi o primeiro antibiótico a ser usado de forma generalizada e já com grande importância terapêutica na 2ª Guerra Mundial.
Biocatalisadores na área dos antibióticos penicilânicos semi-sintéticos
“Graças à Penicilina... Voltaremos a Casa!”
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• Contudo, as penicilinas G e V produzidas com elevados rendimentos em cultura submersa, em fermentadores industriais de 50 – 100m3, começaram a mostrar uma ineficiência crescente para muitos microorganismos devido a resistência natural (β- lactamase) ou adquiriram tolerância por mutação genética.
• Por outro lado, a penicilina G e V só podiam ser administrados por via intravenosa devido à sua nula ou baixa estabilidade à acidez do estômago quando administrados por via oral.
Biocatalisadores na área dos antibióticos penicilânicos semi-sintéticos
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• Contudo verificou-se que estas desvantagens eram parcial minimizadas com novos antibióticos quando os grupos fenilacetil ou fenóxiacetil foram removidos e substituídos por outros grupos funcionais, por exemplo, a fenilglicina ou a p-hidróxifenilglicina do qual resultou a ampicilina ou a amoxicilina.
• Estes novos antibióticos semi-sintécticos foram originalmente produzidos por via química e introduzidos no mercado pela Bayer em 1961.
Biocatalisadores na área dos antibióticos penicilânicos semi-sintéticos
Biocatalisadores na produção do 6-APA
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• O núcleo 6-APA (ácido 6-aminopenicilânico) obtidos da hidrólise da penicilina G ou V passou a ter uma grande procura e importância na área dos antibióticos β-lactâmicos.
• Inicialmente a hidrólise da penicilina era por via química usando condições de temperatura muito -20ºC, agentes químicos muito tóxicos para proteger os grupos funcionais e solventes orgânicos para realizar estas reacções.
• No final da década de 60 e início de 70 começou a explorar com enorme um enzima entretanto descoberto, a penicilina acilase (PGA), para levar a cabo esta hidrólise.
Monitorização da glucose no sangue
Tabela : Crescimento global dos Diabetes
1.121.161.18Racio Mulher/Homem
17.123.825.2% nos países desenvolvidos
300154135População com Diabetes(milhões)
2025 2000 1995Estatisticas
Source: World Health Organisation
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Composto I(Fe4+=O, Porp•+)
Composto II(Fe4+=O, Porp)
Peroxidase
(Fe3+)
H2O
H2O2�AH +
H2O
GlucoseO2
Ácido glucónico
FAD
FADH2
Glucose Oxidase
AnAnáálise do lise do PerPeróóxidoxido de hidrogde hidrogéénionio
ReacReacçção de oxidaão de oxidaçção ão
da da glucoseglucoseAH2
�AH
AH2
Reacções catalíticas multi-enzimáticas
Análise directa do H2O2 e indirecta da glucose
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Fenol
Fenol
4 H2O++2 H2O2
NN
CH3
OCH3
NH2
OHHRP
+
O
NN
CH3
OCH3
N
Peróxido Fenol 4-AAP Quinoneimina (red dye)
Reacção de condensação 4-AAP/Fenol ou Reacção de Trinder
Reacção colorimétrica de redução do
H2O2 com a HRPDEQB
Lição de Biocatálise
Conceito e aplicações de Tiras Teste “Test strip”
Tiras teste
Passo 1. Aplicação da amostra de sangue
Passo 2. Separação eritrócitos e filtração do soro
Passo 3. Reacção enzimática e formação do corante
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Composto I(Fe4+=O, Porp•+)
Composto II(Fe4+=O, Porp)
Peroxidase
(Fe3+)
H2O
H2O2 H2O
2H+
Glucose
O2
Ácidoglucónico
FAD
FADH2
Glucose Oxidase
Transferência directa de
electrões
Elé
ctro
do
Sensor de Sensor de PerPeróóxidoxido
Glucose SensorGlucose Sensor
e-
e-
Eap
pl<
0.6
V(v
ersu
sS
CE
)
Biossensores amperométricos de 3ª geração
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H2O
H2O2
Glucose
O2
Ácidoglucónico
FAD
FADH2
Glucose Oxidase
Glucose SensorGlucose Sensor
Elé
ctro
do
e-
Eap
pl<
0.6
V(v
ersu
sS
CE
)
Biossensores amperométricos de 2ª geração
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Lição de Biocatálise
Compostos redox no
transporte dos
electrões
Figura : YSI 23A Enzyme electrode for glucose
Monitorização da glucose no sangue – case study
Figura : Productos originais da MediSense
Lição de Biocatálise
Figura: FreeStyle Meter - três passos para a monitorização do sangue.
Inserção Tira Teste PicadaSaturação com gota de
sangue da membrana sobreo detector
Monitorização da glucose no sangue – case study
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Figura: Accu-Chek analisador de glucose no dedo.
Monitorização da glucose no sangue – case study
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Figure : Precision Xtraanalisador de Glucose e cetonas devido ao risco cada vez maior dos doentes com diabetes novas doenças resultantes de acumulação de cetonas no sangue que podem provocar coma ou morte (“diabetic ketoacidosis” - DKA).
Monitorização da glucose no sangue – case study
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Tabela : Alguns acontecimentos na história do desenvolvimento commercial de Biossensor de Glucose no sangue
DATA ACONTECIMENTO 1916 Publicação da primeira imobilização de proteínas: adsorção da
invertase em carvão activado 1922 Primeiro eléctrodo de pH de vidro 1956 Invenção do eléctrodo de oxigénio 1962 Primeira descrição de um biosensor: um eléctrodo enzimático
amperométrico de glucose 1973-75 Primeiro biosensor commercial:
Yellow Springs Instruments biosensor de glucose 1976 Primeiro pancreas artificial (Miles) 1982 Primeira fibra óptica-utilizada num biosensor de glucose 1984 Primeiro biosensor amperométrico de glucose com mediadores:
ferroceno com glucose oxidase imobilizada para detecção de glucose 1987 Lançamento do biossensor de glucose no sangue: MediSense ExacTech 1992 Lançamento do analizador portátil de sangue: i-STAT 1996 Lançamento do Glucocard 1996 Abbott adquire a MediSense por 867 milhões USD 1998 Lançamento do biosensor de glucose no sangue: LifeScan FastTake 1998 Fusaõ da Roche e Boehringer Mannheim para formar Roche
Diagnostics 2001 LifeScan adquire o negócio de testes de glucose da Inverness Medical
por 1.3 bilhões de USD 2003 i-STAT é adquired pela Abbott por 392 milhões USD 2004 Abbott adquire TheraSense por 1.2 bilhões USD
Monitorização da glucose no sangue – case study
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Figura: MiniMed analisador de glucose para implante corporal.
Monitorização da glucose no sangue – case study
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Figura: Micro-agulha de silício desenvolvida num sensor de glucosepara implante corporal .
Monitorização da glucose no sangue – case study
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Aplicações de sistemas de células em biotransformação convencional
Tratamento de águas residuaisOclusão em polímeros de polietileno glicol
Bactérias nitrificantes
Tratamento de águas residuaisOclusão em alginatoCianobactérias
Produção de cervejaAdsorção em cerâmica porosaSaccharomyces cerevisiae
Produção de ciclodextrinasOclusão em poliuretanosBacillus circulans
Conversão de ácido fumárico a ácido L-málico
Oclusão em k-carragéneoBrevibacterium flavum
Hidrólise de sacaroseAdsorçãoSaccharomyces cerevisiae
Produção de ácido L-aspártico a partir de ácido fumárico e amónia
Oclusão em poliacrilamida ou em
k-carragéneo
Escherichia coli
Hidroxilação 11b de cortexolonaOclusão em poliacrilamida ou
alginato de cálcio
Curvularia lunata
Desidrogenação D1 de cortisol a prednisolona
Oclusão em alginato de cálcioArthrobacter simplex
Conversão de acrilotinitrilo a acrilamida
Oclusão em poliacrilamidaRhodococcus rhodochrus J1
Células
Sistema reaccionalMétodo de imobilizaçãoBiocatalisador
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Aplicações de sistemas de enzimas em biocatálise convencional
Produção de 7-ACA (1 passo reaccional)
Cefalosporina c amidase
Produção de 7-ACA (2 passos reaccionais)
Adsorção em resinas de permuta iónica à base de estireno
D-amino ácido oxidase7-ACA amidase
Remoção ou eliminação de ureia de bebidas alcoólicas
Oclusão em alginato e k-
carragéneo,
Urease
Hidrólise de lactose no leiteResina de permuta iónica àbase de polímeros de fenol formaldeído, fibras de triacetatode celulose
b-galactosidase
Produção de L-amino ácidos, resolução de misturas racémicas de amino ácidos
Oclusão em gel de
poliacrilamida, Adsorção iónicaDEAE-Sephadex
Amino acilase
Isomerização de glucose em frutose
Adsorção em resinas de permuta iónica
Glucose isomerase
Hidrólise da penicilina em 6-APA
Reticulação glutaraldeído, ligação covalente a suportes orgânicos sintéticos, oclusão em fibras de poliacrilonitrilo(PAN), fibras de triacetato decelulose
Penicilina acilase
Enzimas
Sistema reaccionalMétodo de imobilizaçãoBiocatalisador
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Exemplos de processos industriais em biocatálise não convencional
MeadAcetato de etiloPeroxidase do rábanoPolimerização de fenol
Energy BiosystemsÓleo(substrato)
Rhodococcus sp.Dessulfurização
UpjonhToluenoArthrobacter simplexDesidrogenação de esteróides
Bayer Sumitomo, Chemie Linz AG; BASF; Schering Plough
Vários
Subtilisina(imobilizada)Lipase
Hidrólise de ésteres
Nippon Miningn-hexadecanoNoccardia corallinaEpoxidação 1-octeno
CompanhiaSolventeBiocatalisadorReacção
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Compostos produzidos por biocatálise em escala industrial
LiaseL-DOPAL-Tirosina
D-Amidase e L-amidaseD-alanina e L-alaninaAlaninamida
Streptomyces carbophilusPravastatinaMevastatina
Desidratase, Achromobacterxylosoxidans
L-carnitinaCrotonobetaina
LipasesR-amidas, S-aminas, álcoois enantiomericamente puros
Misturas racémicas de aminasou de álcoois
NitrilaseÁcido R-mandélicoMandelonitrilo
Compostos quirais
HidrataseNicotinamida3-Cianopiridina
Achromobacter xylosoxidansÁcido 6-OH-nicotinicoNiacina
Compostos N-heterocíclicos
Penicilina acilasesÁcido 6-aminopenicilânicoPenicilinas (G ou V)
TripsinaOligolisinaL-lisina
TermolisinaAspartameÁcido L-aspártico/Éster metílico de fenilalanina
Amónia liaseÁcido L-aspárticoÁcido fumárico
Amino-ácidos, péptidos, penicilinas
BiocatalisadorProdutoSubstratoDEQB
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Arthrobacter simplexPrednisonaCortisona
Arthrobacter simplexPrednisolonaCortisol
Rhizopus arrhizus11a-OH-progesteronaProgesterona
Mycobacterium sp.Androstadiona, androstadienodiona, 9a-OH-
androstadiona
Sitosterol, colesterol
Esteróides
LipaseÁcidos gordosTriglicéridos
Penicillium roquefortiCetonas metiladasÁcidos gordos
Ácidos gordos e derivados
Acetobacter sp.L-sorboseD-Sorbitol
Ciclodextrina-glucosiltransferase
CiclodextrinasAmilose
Glucose isomereaseFrutoseGlucose
Amiloglucosidase + pululanaseGlucoseDextrinas
a-AmilaseDextrinasAmido
Hidratos de carbono
BiocatalisadorProdutoSubstrato
Compostos produzidos por biocatálise em escala industrial (cont)
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