UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Zorana Z. Lazarević
Uticaj tipa podloge na varijabilnost deformiteta
mentuma vrste Chironomus tentans Fabricus, 1805 u
testovima toksičnosti
MASTER RAD
Niš, 2018.
1
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Uticaj tipa podloge na varijabilnost deformiteta
mentuma vrste Chironomus tentans Fabricus,
1805 u testovima toksičnosti
Master rad
Niš, 2018.
Kandidat:
Zorana Lazarević
Br. Indeksa 174
Mentor:
Dr ĐuraĎ Milošević
2
UNIVERSITY OF NIŠ
FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS
DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
The influence of substrate type on Chironomus
tentans Fabricius, 1805 mentum deformities in
ecotoxicology tests
Master thesis
Niš, 2018
Cadidate:
Zorana Lazarević
Students Reg. No. 174
Mentor:
PhD ĐuraĎ Milošević
3
Zahvalnica
Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru, dr Đurađu Miloševiću, na nesebičnoj pomoći
tokom izrade ovog master rada i tokom studiranja.
Veliko hvala i doktorantkinji Dimitriji Savić Zdravković na pomoći pri pisanju ovog rada
i strpljenju za sva moja pitanja.
Hvala i doktorantu Aci Đurđević za pomoć tokom eksperimentalne faze istraživanja.
Hvala mojim roditeljima na bezuslovnoj podršci tokom školovanja.
Hvala.
4
Biografija
Zorana Lazarević roĎena je 8. novembra 1992. godine u Pirotu. Osnovnu školu „Vuk
Karadţić“ završila je 2007. godine, a Gimnaziju u Pirotu, prirodno-matematički smer, 2011.
godine sa odličnim uspehom.
Osnovne akademske studije na Prirodno-matematičkom fakultetu u Nišu upisuje 2011.
godine na Departmanu za biologiju i ekologiju. Godine 2014. završava osnovne akademske
studije i upisuje master akademske studije na istom departmanu, smer Ekolo
5
Sažetak
U ovom radu analizirano je da li tip podloge na kojoj se uzgaja kultura Chironomus
tentans utiče na variranje oblika, veličine i deformiteta mentuma larvi. Larve su uzgajane na 5
vrsta podloge: standardna podloga, standardna podloga sa medicinskom glinom, standardna
podloga bez peska, standardana podloga bez gline i standardna podloga bez treseta Ispitivanje je
sprovedeno na uzorku od 178 mentuma. Za analizu je korišćena metoda geometrijske
morfomtrije kao najpogodnija za detekciju malih promena u veličini i obliku objekata
istraţivanja. Uočeno je da se na podlogama gde je povećana količina peska javlja veća
istrošenost zuba mentuma nego na podlogama sa manje peska. TakoĎe je uočeno da ne postoji
značajni uticaj tipa podloge na pojavu i učestalost deformiteta kod larvi hironomida.
Ključne reči: Chironomus tentas, hironoimde, larve, deformiteti mentuma, geometrijska
morfometrija, podloge, ekotoksikološki testovi
6
Abstract
In this study was analysed whether the type of substrate on which Chironomus thentans
larvae were cultivated can affect the variation of shape, size and mentum deformities. Larvae
were cultivated on 5 types of substrate: standard substrate, standard substrate with medical clay,
standard substrate without quartz sand, standard substrate without kaolin clay and standard
substrate without peat. A sample of 178 mentums was analysed. Geometric morphometry
approach was used for the analysis of structures as most suitable for detecting small variations in
size and shape. On the substrate with high amount of quartz sand mentums were more worn out
than menthums of the larvae cultivated on substrate with less amount of quartz sand. It has also
been observed that there is no significant effect of the type of substrate on the frequency of
mentum deformities in cultivated Chironomus tentan larvae.
Key words: Chironomus tentans, Chironomid, larvae, mentum deformities, geometric
morphometrics, substrate, ekotoxicity test
7
Sadržaj
1. Uvod .......................................................................................................................................................... 8
1.1 Zagadjenje akvatičnih ekosistema ...................................................................................................... 8
1.2 Biomonitoring akvatičnih ekosistema ................................................................................................ 9
1.3 Ekotoksikološki testovi ..................................................................................................................... 11
1.4 Hironomide kao model organzmi ekotoksikoloških testova ............................................................. 13
2. Ciljevi istraţivanja .................................................................................................................................. 20
3. Materijali i metode .................................................................................................................................. 21
3.1 Uzgajanje kulture Chironomus tentans ............................................................................................. 21
3.2 Postavka eksperimenta ...................................................................................................................... 23
3.3 Statistčka obrada podataka ................................................................................................................ 26
3.3.1 Geometrijska morfometrija ........................................................................................................ 26
3.3.2 Multivarijantni i univarijantni testovi (CVA i PCA) ................................................................. 28
4.Rezultati i diskusija .............................................................................................................................. 30
4.1 Vidljive promene strukture mentuma ............................................................................................... 30
4.2 Variranje oblika mentuma diskriminantnom kanonijskom analizom (CVA) ................................... 31
4.3 Variranje oblika mentuma analizom glavnih komponenti (PCA) ..................................................... 34
5. Zaključak................................................................................................................................................. 36
6. Literatura ................................................................................................................................................. 37
8
1. Uvod
1.1 Zagadjenje akvatičnih ekosistema
ZagaĎena voda je izmenjeni element ţivotne sredine koja kvantitativno i kvalitativno
odstupa od prirodnih fzičkih, hemijskih i bioloških osobina, što ograničava mogućnost njene
upotrebe i izaziva nepoţeljne posledice u vodenim ekosistemima nanoseći štete ljudskom
zdravlju i ekonomiji (S. Simić i V. Simić, 2009). ZagaĎenje vode je globalni ekološki problem
čija veličina i tip varira od jedneregije do druge (S. Simić i V. Simić, 2009).
ZagaĎenje kopnenih voda dolazi kako iz prirodnih, tako iz antropogenih izvora (S. Simić
i V. Simić, 2009). Podela izvora zagaĎenja (zagaĎivača) na tačkaste (koncentrisane) i difuzne
(rasute) je koristan korak u prepoznavanju tipa zagaĎivača, što je bitno za prevenciju i
prečišćavanje zagaĎenih voda (S. Simić i V. Simić, 2009).
Tačkaste izvore zagaĎenja (eng. point sourse pollution) je moguće lako registrovati, a
njihovo zagaĎenje je relativno jednostavno kvalitativno i kvantitativno identifkovati (S. Simić i
V. Simić, 2009). Primeri ovih tipova zagaĎenja su otpadne vode iz ureĎaja za prečišćavanje
komunalnih otpadnih voda, otpadne vode iz industrija i fabrika i drugi izvori koji direktno
ispuštaju zagaĎujuće materije u recipijent kroz cevi, kanale tj. tačkaste izvore (S. Simić i V.
Simić, 2009). Ove zagaĎivače je moguće kontrolisati zakonodavno, ali se incidenti i dalje
dešavaju (S. Simić i V. Simić, 2009).
Difuzna zagaĎenja dolaze iz difuznih izvora (eng. non point source pollution) koji ne
potiču iz jedne tačke, već su prostorno široko rasprostranjeni (S. Simić i V. Simić, 2009).
Javljaju se reĎe i u kraćim vremenskim periodima od izvora tačkastog zagaĎenja (S. Simić i V.
Simić, 2009). Nastaju kada se padavine kreću preko i kroz zemljište, noseći sa sobom zagaĎenje
koje na kraju dospeva u jezera, reke, močvare, estuare i/ili u podzemne vode (S. Simić i V.
Simić, 2009). Difuzno zagaĎenje moţe takoĎe poticati iz sedimenata istaloţenih u jezerima,
rekama, močvarama ili estuarima (S. Simić i V. Simić, 2009). Ovo zagaĎenje uključuje otpadnu
vodu sa urbanih površina (ulica, parking prostora, travnih površina, bašti i sl.), vodu koja sa
9
poljoprivrednih površina spira veštačka Ďubriva, pesticide, otpadnu vodu pri eksploataciji ruda
(spiranje vode iz jama, jalovišta i sl.) (S. Simić i V. Simić, 2009).
ZagaĎujuće materije mogu da potiču iz različitih izvora i da budu različite prirode:
1. neorganska jedinjenja;
2. neorganski nutrijenti;
3. organska jedinjenja;
4. agensi koji izazivaju bolesti;
5. sedimenti;
6. radioaktivne supstance;
7. topla voda.
Dospevanjem otpadnih voda u tokove kopnenih voda mogu se promeniti zajednice
tokova dodavanjem organskih materija (kanalizacija, ţivotinjskog porekla, iz fabrika papira, i
td.), nutrijenata (hranljivih materija) i toksičnih hemikalija (Lenat, 1993). Svaki od ovih
zagaĎivača moţe da utiče na sastav i formiranje faune (Hynes, 1960). Radi zaštite dragocenih
vodenih staništa neophodna je procena individualnog i kombinovanog efekta ovih zagaĎivača,
pri čemu je kombinacije polutanata teţe proceniti (Lenat, 1993).
1.2 Biomonitoring akvatičnih ekosistema
Ţivotna sredina predstavlja sve ono što nas okruţuje i svaka čovekova aktivnost je
direktno ili indirektno povezana sa njom. Kroz antropogenu aktivnost, čovekova sredina se
suočila sa totalno novim supstancama koje do tada nisu bile prisutne u prirodnom sistemu
(ksenobiotici, mnogi sintetički radioizotopi) i potencijalno opasnim supstancama oslobodjenim u
nezamislivim količinama u prošlosti (teški metali, prirodni radioizotopi) (Oehlmann i Markert,
1999). Praćenje stanja ţivotne sredine u cilju njenog očuvanja i sprečavanja štetnih efekata
10
ksenobiotika na celokupan ţivi svet podrazumeva skup metoda koje se mogu objediniti
terminom monitoring (Despotović, 2013). Prema definiciji Programa za ţivotnu sredinu
Ujedinjenih nacija (eng. United Nations Environmental Program – UNEP) monitoring
predstavlja svako ponovljeno merenje, sa definisanom svrhom, jednog ili više hemijskih ili
bioloških parametara, prema unapred odreĎenom rasporedu u prostoru i vremenu, koristeći
metode koje su uporedive i standardizovane (Despotović, 2013). Monitoring omogućava
kontrolu i prepoznavanje promena nastalih u spoljašnjoj sredini (Despotović, 2013). Dva
osnovna tipa monitoringa koji omogućavaju procenu rizika dejstva na organizme kao i procenu
kvaliteta ţivotne sredine su: hemijski i biološki monitoring (De Zwart, 1995; Despotović, 2013).
U biološkom monitoringu (biomonitoringu) koriste se ţivi organizmi da bi se procenilo
stanje ţivotne sredine (Despotović, 2013). Metode biološkog monitoring imaju niz prednosti jer
mere efekte u kojima biodostupnost ispitivanih jedinjenja povezuju sa njihovom koncentracijom
i toksičnošću u organizmu i omogućavaju integrisanje efekata na velikom broju jedinki
(Despotović, 2013). Biodostupnost je definisana kao količina hemijske supstance koja moţe biti
usvojena iz sredine i pri tome moţe da izazove biološki odgovor (NRC 2003). Nedostatak
metoda biološkog monitoringa je posledica teškog povezivanja uočenih efekata sa specifičnim
aspektima zagaĎenja (De Zwart, 1995; Despotović, 2013).
Van Gestel i Van Brummelen (1996) predloţili su četiri različita nivoa biomonitoringa:
Suborganizmalni nivo - na nivou biohemijskih i fizioloških procesa moguće je utvrditi
odstupanje od normalnog (zdravog) stanja korišćenjem biohemijskih tehnika. Uključuje
korišćenje biomarkera.
Organizmalni nivo - korišćenjem bioanaliza prate se preţivljavanje, rast i reprodukcija
jedinki kao krajnje tačke klasičnih laboratorijskih testova ekotoksičnosti.
Populacioni nivo - prate se efekti koji se manifestuju kao promene u genetičkoj strukturi,
starosnoj strukturi ili gustini populacije korišćenjem bioindikatora.
Ekosistemski nivo - promene u sastavu, gustini i diverzitetu vrsta mogu ukazati na efekte
zagaĎenja na biocenoze.
Bioindikator je organizam koji svojim prisustvom, odsustvom ili ponašanjem
daje informacije o uslovima u sredini u kojoj ţivi (Despotović, 2013).
11
Kontrola kvaliteta ţivotne sredine mora biti primarni zadatak pri korišćenju prirodnih
resursa kao i pri svakom drugom antropogenom dejstvu sa mogućim posledicama na stanje
ekosistema (Despotović, 2013). U prošlosti se praćenje stanja ţivotne sredine zasnivalo na
merenju fizičkih i hemijskih parametara sredine, meĎutim dobijeni podaci su govorili o stepenu
zagaĎenja, ali ništa o efektima koje zagaĎivači imaju na biološke sisteme (Despotović, 2013).
Osnovna svrha praćenja stanja ţivotne sredine jeste dobijanje dovoljnog broja pouzdanih
informacija na osnovu kojih se moţe vršiti ekološka procena rizika (eng. Ecological risk
assessment-ERA) (Despotović, 2013). OdreĎivanje stepena rizika od zagaĎenja predstavlja
proces praćenja intenziteta i mogućnosti uticaja čoveka na spoljašnju sredinu (Suter, 1993,
Despotović, 2013). Prvobitno ERA je razvijena da bi se utvrdio štetan uticaj različitih hemikalija
na spoljašnju sredinu i obezbedila kvantitativna osnova za kategorizaciju i poreĎenje različitih
oblika rizika, kao i poboljšanje razumevanja rizika (Despotović, 2013).
Vodeni ekosistemi su u stalnoj biohemijskoj dinamici, čiji intenzitet zavisi od niza
abiotičkih i biotičkih faktora koji neprekidno variraju vremenski i prostorno (S. Simić i V. Simić,
2009). Na dinamične procese u ekosistemu znatno utiču i prirodni faktori koji dospevaju iz
spoljašnje sredine (atmosferske padavine, dotok vode sa mineralnim materijama), ali i faktori
koji su rezultat aktivnosti ljudi i koji uglavnom izazivaju negativne efekte na vodene ekosisteme
(S. Simić i V. Simić, 2009). Bilo koja materija, u velikim i neprirodnim količinama, koja se naĎe
u vodi moţe da bude zagaĎujuća materija (S. Simić i V. Simić, 2009).
1.3 Ekotoksikološki testovi
Testovi ekotksičnosti (bioeseji) predstavljaju eksperimente u kojim se ispituje uticaj
hemikalija i uslova sredine na raznim test vrstama (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Oni
su neophodni za procenu rizika od novih i već postojećih hemikalija, kao i za monitoring
kvaliteta ţivotne sredine (npr. otpadnih voda, sedimenata i uzoraka tla) (Ratte, Hammers-Wirtz i
Cleuvers, 2003). U svakom testu meri se jedna ili više karakterističnih varijabli, koje se kao
subletalni efekti testa nazivaju krajnje tačake (eng. „endpoints“). Termin „endpoint“ („response
variable“) odnosi se na biološki parametar koji se meri odnosno posmatra (npr. preţivljavanje,
12
broj jaja, veličina ili teţina, nivo enzima) (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Termini
„efekat“ i „odgovor“ opisuju promene u ovim varijabljama koje se posmatraju (Ratte, Hammers-
Wirtz i Cleuvers 2003). Kod kvantitativnih varijabli (npr. mortalitet) subletalni efekt je iskazan u
vidu promena broja jedinki koje su pogoĎene, kod kontinuiranih varijabli (npr. stopa rasta)
iskazan je procentom promene prosečnog nivoa varijable, tj „endpoint“-a (Ratte, Hammers-Wirtz
i Cleuvers, 2003). I kod jednih i kod drugih tipova praćenih varijabli rezultati se uporeĎuju sa
kontrolom (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Kontrola je referentno stanje bez prisustva
polutanta tj. ksenobiotika. Kod ekotoksikoloških testova najbitnije je da se meĎusobno mogu
uporeĎivati i da se moţe proveriti tačnost nekog izvedenog testa ponovnim izvoĎenjem pod
istim, tačno definisanim uslovima. (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Zbog toga se
testovi izvode po principima Dobre Laboratorijske prakse (eng. Good Laboratory Practice)
(GLP; OECD 1998b) i koriste se internacionalno prihvaćene smernice i standardi, koje su
razvijene od strane nekoliko svetskih internacionalnih organizacija: OECD (Organisation of
Economic Cooperation and Development), CEN (Comité Européende Normalisation) i ISO
(International Organization for Standardization) (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003).
Ekotoksikološki testovi se koriste u pravnoj kontroli hemikalija i procene kvaliteta
otpadnih voda (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Stoga ekotoksikološki test mora da da
pribliţno iste rezultate u različitim laboratorijama i u istoj laboratoriji u različitom vremenu, tj.
rezultati takvih biotestova moraju biti konzistentni i ponovljivi (Ratte, Hammers-Wirtz i
Cleuvers, 2003). Da bi se dostigla visoko ponovljivost i konzistentnost uslovi testa moraju da
budu striktno regulisani (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Tako, od 1980-ih, različite
organizacije (npr. OECD, CEN, ISO, ASTM) razvijaju pravilnike za vaţne ekotoksikološke
testove u cilju standardizacije testova i metoda procene (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers,
2003). Naravno, ukoliko se test ponavlja nekoliko puta ili se sprovodi u istom trenutku na
razičitim mestima, rezultati nece biti potpuno isti zbog biološke varijabilnosti test organizama
koji su uključeni, kao i zbog odreĎenih varijabli koje je nemoguće potpuno precizno kontrolisati
(Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Najveći potencijalni izvori variranja u
ekotoksikološkim testovima su genetski i ekološki (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003).
Ekološka varijabilnost u izvodjenju ekotoksikoloških testova moţe biti smanjena
striktnim regulisanjem uslova okruţenja (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Neki
13
ekološki faktori se mogu lako kontrolisati, kao što je temperature, reţim svetlosti i tip podloge
(Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Ali postoje mnogi faktori koje je teţe kontrolisati, kao
što je snabdevanje ţivom hranom pribliţno istog kvaliteta, pri čemu ovaj faktor ima veliki uticaj
na razvoj test organizama i stoga, moguće, na efekte ekotoksikanta (Soares i Calow 1993; Ratte,
Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). U većini test sistema merena varijabilnost je kombinacija
kako genetskih, tako i ekoloških varijacija (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Da bi se
odredio nivo varijacije u konzistentnosti i ponovljivost samih testova, sprovedeni su takozvani
„kruţni testovi” (eng. „ring tests“), gde su različite laboratorije istraţivale jedno ili nekoliko
toksičnih jedinjenja, nekoliko puta (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Pokazalo se da što
je sistem sloţeniji i što je manji broj uključenih test organizama, to je obično veća varijabilnost
test sistema (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers 2003). Potrebna je velika reproduktivnost i velika
ponovljivost u toksikološkim testovima, ali, s druge strane, iz ugla praktičara i onih koji plaćaju
za njih, testovi bi trebalo da budu izvodljivi, poţeljno, u malim laboratorijama i jeftini (Bödeker
et al. 1992; Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003).
1.4 Hironomide kao model organzmi ekotoksikoloških testova
Akvatični organizmi mogu posluţiti kao dobri model sistemi za proučavanje bazičnih
procesa ćelijskih i tkivnih oštećenja, praćenih fiziološkim posledicama kao što su bolesti i
starenje, kao i imunološke reakcije na nastanak slobodnih radikala u organizmu (Despotović,
2013). Slatkovodni beskičmenjaci su dobri model organizmi za proučavanje uticaja faktora
sredine u biomonitoring studijama zbog svojih karakteristika: slabe pokretljivosti, načina ishrane,
brojnosti i veličine tela. (Despotović, 2013). Oni imaju sposobnost da u svom telu akumuliraju
znatne količine zagaĎujućih materija (Despotović, 2013). Na osnovu analize sadrţaja ovih
materija u beskičmenjacima moguće je zaključivati o kvalitetu sredine (Despotović, 2013).
S obzirom da na Zemlji ima više od pet miliona vrsta, tek veoma mali broj njih se koriste
kao test organizmi u ekološkim procenama rizika i efekta na ekosistem (Ratte, Hammers-Wirtz i
Cleuvers, 2003). Vaţni kriterijumi za izbor vrste, tj. bioindikatora, koja će biti korišćena za
ekotoksikološki test su: osetljivost, dostupnost vrste, ekološki značaj i praktični aspekti (lako
14
rukovanje i uzgajanje vrste u laboratoriji) (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Osim toga,
veoma su korisne osnovne informacije o vrsti (njena psihologija, genetika i ponašanje) za
tumačenje rezultata testova (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003).
Zbog razlike u osetljivosti izmeĎu različitih vrsta, sam izbor adekvatne vrste za
ekotoksikološki test ima velikog uticaja na ishod samog testa (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers,
2003). Uopšteno najosetljivija test vrsta ne postoji zato što osetljivost vrste zavisi od vrste agensa
kojoj je ona izloţena i ostalih uslova i parametara samog eksperimenta (od tipa podloge na kojoj
se jedinke odreĎene vrste uzgajaju). (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Stoga je vaţno
istraţiti nekoliko vrsta koje pokazuju različite osetljivosti (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers,
2003).
Larve familije Chironomida (Diptera) su izuzetno pogodne za biološka istraţivanja
sedimenata slatkovodnih ekosistema iz više razloga:
Većinu svog ţivota larve provode u površinskim sedimentima, gde su izloţene
uticaju toksikanata direktnim fizičkim kontaktom ili putem ingestije;
Imaju kratak ţivotni ciklus, pa je moguće u laboratoriji proizvesti deset ili više
generacija godišnje;
Izuzetno su brojne u bentosu;
Relativno su osetljive na polutante.
Iz gore navedenih razloga larve hironomida se sve više koriste kao test organizmi, tj.
bioindikatori u biološkim istraţivanjima (Giesy et al., 1988; Pascoe et al., 1990; Timmermans et
al., 1992).
Štetne supstance se akumuliraju u tkivu beskičmenjaka, pa se tako dalje, kroz lanac
ishrane prenose do riba, a na kraju i do ljudi (Hudson i Ciborowski, 1996). Na osnovu toga, larve
hironomida potencijalno igraju glavnu ulogu u bioakumulaciji i transportu štetnih supstanci
(Hudson i Ciborowski, 1996). Kako su hironomide slabo pokretni organizmi one pokazuju stanje
sedimenata tamo gde su uzorkovane (Pinder 1995; Hudson i Ciborowski, 1996). Iako je familija
hironomida velika grupa, većina istraţivanja je koncentrisana na larvama roda Chironomus
Meigen, 1803, a u okviru tog roda Chironomus tentans Fabricius, 1805 i Chironomus riparius
Meigen, 1804, dve široko rasprostranjene vrste sedimenata mekog tla (e.g., Bird et al., 1995;
15
Janssens de Bisthoven, 1998a, b; Martinez et al., 2001; Vermeulen et al., 2000; Martinez et al.,
2004; MacDonald i Taylor, 2006).
Larve hironomida u kasnijim stupnjevima često razvijaju deformitete na delovima usnog
aparata i glavene čaure, posebno na mentumu, kada su izloţene stresu ili zagaĎenju (MacDonald
i Taylor 2006). Učestalost deformiteta moţe se iskoristiti kao jako pouzdan parametar kako bi se
procenila subletalna toksičnost koja potiče od teških metala, radioaktivnosti, organofosfatnih ili
organohloridnih pesticida i ksenobiotika (Bird et al., 1995; Servia et al., 1998; Swansburg et al.,
2002; Watanabe et al., 2000; Mori et al., 1999; Vermeulen et al., 1995; Martinez et al., 2002;
MacDonald i Taylor, 2006). Kod subletalnih toksičnih delovanja dešavaju se promene u rastu,
razvoju, razmnoţavanju i ponašanju.
Decenijama je razmatrano da li bi deformiteti usnih delova potencijalno mogli biti
indikatori kod in situ biološke procene i biomonitoringa stresa izazvanog toksičnim agensima u
potocima i jezerima (Bird 1994; Gerhardt et al. 2006; Groenendijk et al. 1998; Janssens De
Bisthoven et al. 1998a; Meregalli et al. 2000; Warwick 1990; Langer-Jaesrich, Köhler i
Gerhardt, 2010). In situ označava da se pojave posmatraju na originalnom lokalitetu u okviru
pasivnog biomonitoringa. U brojnim terenskim istraţivanjima veći broj hironomida sa
deformitetima usnih delova pronaĎeno je u zagaĎenim vodotokovima (Dermott 1991;
Groenendijk et al. 1998; Janssens De Bisthoven et al. 1998a; Warwick 1990; Wiederholm 1984;
Langer-Jaesrich, Köhler i Gerhardt, 2010). Mogući razlog za to je kontaminacija
radionukleoidima, uljanim jedinjenjima, policikličnim aromatičnim ugljovodonicima (PAH),
organohlornim pesticidima, polihlorovanim bifenilima (PCB) i posebno, teškim metalima
(Janssens de Bisthoven et al., 1998b; Langer-Jaesrich, Köhler i Gerhardt, 2010). Iako se često
stresori i povećana učestalost deformiteta usnih delova poklapaju prostorno, potrebno je obratiti
paţnju na sledeće:
Kada se poveća učestalost deformiteta usnih delova, u mnogim studijama nije
pronadjena korelacija izmeĎu toksikanata i deformiteta (Bird, 1994; Dermott,
1991; Jeyasingham and Ling, 1997; Jeyasingham and Ling, 2000; Nazarova et al.,
2004; Reynolds and Ferrington, 2001);
Usled činjenice da su mnoga pomenuta jedinjenja pronaĎena in situ, u mnogim
slučajevima nije moguće uspostaviti direktnu vezu;
16
U nekim nezagaĎenim oblastima povećana učestalost deformiteta usnih delova
varira i u zavisnosti od sezone (Jeyasingham and Ling, 2000). Nekoliko studija
sugerišu da sezona (godišnje doba) ima veliki uticaj na učestalost deformiteta
(Jeyasingham and Ling, 1997; Reynolds and Ferrington, 2001; Servia et al., 2000;
Urk et al., 1992).
Ovi rezultati oteţavaju implementaciju hironomida, kao indikatora zagaĎenja, u postojeće
monitoring programe (Langer-Jaesrich, Köhler i Gerhardt, 2010).
Postoji još nekoliko ograničenja u rutinskom korišćenju hornomida za biomonitoring
(MacDonald i Taylor, 2006).
Veoma sitni detalji usnih delova mogu biti teški za uočavanje u ranim
stadijumima larvi ili kod manjih vrsta ukoliko se ne koriste posebni mikroskopi
(MacDonald i Taylor, 2006).
Vremenski zahtevna determinacija takoĎe moţe zadati poteškoće u primeni
metoda.
Različite vrste variraju u toleranciji na toksične agense (Hamilton & Saether,
1971; Hare & Carter, 1976; Wiederholm, 1984) i svojoj sklonosti da razvijaju
deformitete (Servia et al., 1998; Janssens de Bisthoven, 1998b; Vermeulen et al.,
2000; Martinez et al., 2001; Martinez, 2004).
Pored toga, situacija sa terena koji su zagaĎeni i gde postoji povećana učestalost teških
deformiteta ne moţe se bas lako reprodukovati u laboratorijskim eksperimentima (MacDonald i
Taylor, 2006). Čak i u studijama u kojima su ispitivani polutanti uspeli da izazovu povišenu
stopu deformiteta, linearna veza izloţenosti-odgovora izmeĎu zagaĎivača (ksenobiotika) i
deformiteta ipak nije pronaĎena (Dias et al., 2008; Martinez et al., 2001; Vermeulen et al.,
2000a; MacDonald i Taylor, 2006). Ova zapaţanja nisu pouzdana da bi podrţala upotrebu
deformiteta hironomida kao indikatora zagaĎenja, pogotovo zato što je moguće da su te
deformitete kod hironomida izazvali neki drugi stresori prisutni na terenu (MacDonald i Taylor,
2006).
U većini objavlenih studija korišćen je samo jedan stresor, uglavnom neki od teških
metala, kako bi se izazvao deformitet na delovima usnog aparata hironomida (Bird et al., 1995;
17
Janssens de Bisthoven et al., 2001; Janssens de Bisthoven et al., 1998b; Martinez et al., 2001;
Vermeulen et al., 2000a; MacDonald i Taylor, 2006). MeĎutim, zagaĎena područja su uglavnom
zagaĎena većim brojem supstanci (MacDonald i Taylor, 2006). Stoga je potrebno da se obezbede
konzistentniji podaci o uzročnicima deformiteta hironomida (Vermeulen et al., 2000a;
MacDonald i Taylor, 2006).
Da bi se odredilo da li je odredjeno područje, tj. lokalitet, izloţeno polutantima, moraju se
uračunati i deformiteti koji prirodno postoje kod larvi (MacDonald i Taylor, 2006). Postoji
nedostatak informacija kada je u pitanju prirodna učestalost deformiteta u sredinama koje nisu
izloţene stresu, pogotovo za vrste koje se ne koriste često u istraţivanjima, pa to oteţava
primenu ove metode biomonitoringa (van Urk et al., 1992; MacDonald i Taylor, 2006).
U isto vreme, kontaminacija sedimenata ili druga zagaĎenja mogu da eliminišu neku
vrstu potpuno (MacDonald i Taylor, 2006). Iako se potpuni nestanak odreĎene vrste moţe takoĎe
iskoristiti da bi se ukazalo na zagaĎenje, ipak komplikuje primenu deformiteta delova usnenog
aparata za preciznije odreĎivanje zagaĎenja (MacDonald i Taylor, 2006).
Nekoliko studija je pokazalo deformitete mentuma kod hironomida kao odgovor na
zagaĎenje (Warwick, 1980a, 1980b, 1991; Warwick et al., 1987; Dermott, 1991; Janssens de
Bistoven et al., 1992; Lenat, 1993; Bird, 1994), a nekoliko studija je istraţivalo korišćenje
deformiteta mentuma kao “endpoint” u ekotoksikološkim testovima (Warwick, 1980a, 1980b,
1991; Warwick et al., 1987; Dermott, 1991; Janssens de Bistoven et al., 1992; Lenat, 1993; Bird,
1994), dok su druge studije koristile vreme u uspešnost izleganja kao “endpoint” (Wentsel et al.,
1978; Hart et al., 1987). U svim ekotoksikološkim testovima koja se vrše u laboratoriji veoma je
bitan izbor supstrata prilikom postavke eksperimenta. Njegove fizičke karakteristike mogu
uticati na rast i preţivljavanje organizama i na taj način predstavljati glavni generator prirodne
varijabilnosti u ekotoksikološkim testovima (Bird, 1997). Nekoliko autora koristilo je organsku
materiju kao supstrat (Batac-Catalan and White, 1982; Kosalwat and Knight, 1987), dok su drugi
koristili mineralne supstrate (Hamilton and Saether, 1971; Hart et al., 1987; Giesy et al., 1988).
Vavrik (1988) je sugerisao da je visok stepen istrošenosti zuba i mandibula kod larvi uzgajanih
na mineralnom supstratu (pesku) moţda uticao na analizu podataka iz studije toksičnosti
sprovedene od strane Hamilton and Saether (1971) . Korišćenje grubljeg mineralnog supstrata
(pesak krupnijeg zrna) je pokazalo manju istrošenost zuba mentuma nego na drugim testiranim
18
podlogama (D. R. Hart, Beak Consultants Ltd. Brampton, Ontario, pers. comm.). Trošenje usnih
delova zbog ingestije mineralnih čestica moţe prikriti deformacije ili biti pogrešno protumačeno
kao deformitet i tako dati laţne rezultate na kraju eksperimenta (Bird, 1997).
Kod analize efekata, tj. ocene štetnosti ili odgovora organizma na delovanje nekog agensa
procenjuje se promena nastala u prirodi kao i veličina te promene. Ta promena nastala je usled
izloţenosti datoj zagaĎujućoj supstanci, tj. stresoru, pa se u tu svrhu koristi veliki broj bioloških
eseja i testova. OECD (Organizacija za ekonomsku saradnju i razvoj, eng. “Organisation of
Economic Cooperation and Development”) obezbeĎuje uputstva za biološke testove putem kojih
se testiraju hemijske supstance. Ova uputstva su podloţna izmenama i mogu biti korigovana s
vremenom od strane zemalja članica (za koje vreme će se razviti i odobriti novi ili izmenjeni
protokol zavisi najviše od dogovora zemalja). OECD testovi predstavljaju usklaĎene test metode
do kojih se došlo zajedničkom odlukom OECD saveta za medjusobno prihvatanje podataka. Ovo
znači da je moguće meĎusobno uporeĎivati i analizirati podatke različitih testova jer su svi
izraĎeni pod istim uslovima, a u skladu sa OECD uputstvima za testove i OECD principima
dobre laboratorijske prakse. Sve ovo vodi mnogo lakšoj proceni uticaja mnogih testiranih
supstanci širom sveta i mnogo lakšem i usklaĎenijem praćenju stanja ţivotne sredine
(http://www.oecd.org/ ).
Akutni i hronični testovi sa hironomidama – biljnim komarcima (ordo: Diptera, Familia:
Chironomidae) predstavljaju deo standardne procedure analize supstanici za registraciju
agrohemikalija (pod evropskom direktivom zaštite biljnih produkata 91/414/EEC), kao i biocida.
Rezultati ovih testova koriste se pri proceni rizika i uticaja na ţivotnu sredinu. OECD protokoli
koji se najviše koriste jesu 218: test sa supstancom u sedimentu- OECD, 2004a (”Sediment water
chironomid toxicity test using spiked sediment“) i 219: test sa supstancom u vodi- OECD, 2004b
(”Sediment water chironomid toxicity test using spiked water“). Od 2011. prihvaćen je i test koji
se radi u test sistemu samo sa vodom: akutni imobilizacioni test (“Chironomus sp. acute
immobilization test”). Osmišljen je i test punog ţivotnog ciklusa (prsten test), koji predstavlja
proširenje prethodnih testova. Test se ne završava sa izletanjem adulta, već se imago prebacuju u
akvarijum za razmnoţavanje, jaja polaţu u isti sistem sa test supstancom, kao onaj iz koga su se
izlegli, prati se izleganje larvi (F1 generacija), pa se one prebacuju ponovo u posude sa
supstancom i prate do izletanja. Prate se, dakle, 2 generacije (P i F1), pa se moţe pratiti uticaj na
19
reprodukciju, fekuditet i fertilitet, akumulaciju, nasledne efekte i ostale parametre (Bruns i
Weltje, 2009).
20
2. Ciljevi istraživanja
Cilj ovog istraţivanja je optimizacija postojećeg OECD Protokola za tretiranje toksičnih
supstanci u sedimentu, u pogledu smanjivanja prirodne varijabilnosti oblika mentuma,
subletalnog efekata biološkog testa. Za realizaciju ovog cilja testiran je uticaj tipa podloge na
pojavu vidljivih deformiteta mentuma kod larvi hironomida. Pored toga, analizirana je i
varijabilnost oblika mentuma na larvama izloţenim različitim tipovima podloga.
21
3. Materijali i metode
3.1 Uzgajanje kulture Chironomus tentans
Larve hironomida sakupljene su na prirodnom staništu, starom koritu reke Nišave (Slika
1). Nakon identifikacije, larve su premeštene u akvarijum i nastavljeno je uzgajanje pod
laboratorijskim uslovima, sa kontrolisanom temperaturom, aeracijom i svetlosnim reţimom.
Nakon izletanja adulta i njihovog parenja, paketi jaja koje su poloţile ţenke sakupljeni su i
izolovani u manjim akvarijumima. Na taj način stvorena je čista kultura Chironomus tentans
kojoj je bilo moguće pratiti dalje razviće od jajeta, preko larvi do adulta i koja je bila korišćena
za dalje eksperimente.
Akvarijumi za uzgoj kulture su napravljeni od komercijalno dostupnog stakla. Iznad
svakog akvarijuma, na otvoru se delom nalazi mreţasta rojilica za rojenje adulta, a ostatak je
pokriven istom vrstom mreţice. Rojilica je napravljenja od jednostavnog drvenog okvira na koji
Slika 1. Prirodno staniste Chironomus tentans sa koga su prikupljene larve
22
je postavljena najlonska mreţica. Donja strana rojilice osigurana je sunĎerastim trakicama za
izolaciju kako bi se sprečilo bekstvo adulta (Sika 2).
Populacija hironomida je formirana u staklenim akvarijumima zapremine 80 litara. Voda
u akvarijumu sastoji se iz 50% česmene vode i 50% destilovane vode (u odnosu 1:1). Dubina
vode u akvarijumu je pribliţno 15cm. Populacija se konstantno snabdeva vazduhom pomoću
vazdušnih pumpi (akvarijumskih pumpi za kiseonik). Temperatura je odrţavana na 21 ± 0,5ºC.
Fotoperiod, tj. odnos svetlosti i mraka je vaţan kod uzgajanja larvi hironomida zbog njihovog
pravilnog razvitka, a odrţavan je u odnosu 16:8 (16 sati svetlosti : 8 sati mraka, što imitira
uslove u prirodi). Ukoliko se neki od kontrolisanih parametara promeni, npr. smanji svetli period
ili se poveća temperatura u trajanju više od dva dana, izleganje adulta je odloţeno (Maier,
Kosalwat i Knight, 1990). Tvrdoća vode je 7,3 ± 0,25 °dH, provodljivost 325 μS/cm3, a pH 7,2.
Larve hironomida zahtevaju supstrat kako bi mogle da grade zaštitne kućice u koje se
zavlače. Za supstrat je korišćen celulozni papir, koji se pokazao kao najadekvatnija podloga za
uzgoj hironomida u laboratoriji. Supstrat je pripremljen na sledeći način: usitnjeni ubrus papiri se
prvo natope acetonom kako bi se uklonile nečistoće; nakon toga papir se ispira destilovanom
Slika 2. Akvarijum za uzgoj kulture hironomida u ekotoksikološkoj laboratoriji na Prirodno-
matematičkom fakultetu u Nišu
23
vodom, sve dok se potpuno ne ukloni miris acetona (najbolje je za to koristiti sito); potom se
papir kuva u destilovanoj vodi (60 min na temperaturi od 100ºC); na kraju se pomoću sita iscedi
višak vode i supstrat je spreman za korišćenje. (Slika 3)
Larve su hranjene svakodnevno TetraMin® mešavinom riblje hrane (Sastav hrane: biljni
sastojci, riba i riblji proizvodi, belančevine, ţitarice, alge, ulja, masti, školjke, minerali, šećeri,
rakovi, kvasac, lecitin). Hrana je pripremana usitnjavanjem i rastvaranjem 1g mešavine riblje
hrane u 10ml destilovane vode.
3.2 Postavka eksperimenta
Za postavku eksperimenta korišćena su sveţe izlegla jaja. Svaki paket jaja izolovan je u
zasebnu petrijevu posudu u kojoj se nalazila voda iz akvarijuma u kojoj je uzgajana kultura
(Slika 4). Na taj način omogućeno je da se zna tačno poreklo i starost jedinki, kao i da se prate
njihove aktivnosti. Biološki test sa hironomidama izveden je praćenjem smernica OECD
protokola (Organizacija za ekonomsku saradnju i razvoj, eng. “Organisation of Economic
Cooperation and Development”), tačnije OECD testa broj 218, dizajniranog za procenu uticaja
Slika 3. Larve hironomida u podlozi
24
dugotrajnog izlaganja hemikalijama, korišćenjem larvi hironomida koje ţive u sedimentu kao
model organizama (eng. “Sediment water chironomid toxicity test using spiked sediment” – Test
toksičnosti na hironomidama u sistemu sa sedimentom i vodom korišćenjem zagaĎenog
sedimenta) (OECD, 2016).
U eksperimentu je testirano je pet vrsta sedimenata:
1. Standardna podloga – 46,66g treseta rastvorenog u destilovanoj vodi, 186,66g kaolinske
gline i 700g kvarcnog peska;
2. Standardna podloga sa medicinskom glinom – 46,66g treseta rastvorenog u destilovanoj
vodi, 186,66g medicinske gline i 700g kvarcnog peska;
3. Standardna podloga bez peska – 46,66g treseta rastvorenog u destilovanoj vodi i 186,66g
kaolinske gline;
4. Standardana podloga bez gline – 46,66g treseta rastvorenog u destilovanoj vodi i 700g
kvarcnog peska;
5. Standardna podloga bez treseta – 186,66g kaolinske gline i 700g kvarcnog peska.
U staklene tegle zapremine 600ml, prečnika 8cm stavljen je sediment u sloju visine 2cm.
Na to je dodata mešavina česmenske vode (koja je prethodno dehlorisana; pH 6.52±0.4; tvrdoća
Slika 4. Paketi jaja izolovani u Petrijeve posude kako bi se pripremili za dalje korišćenje u
eksperimentu
25
7.3 °dH; provodljivost 325 μS/cm3) i destilovane vode u razmeri 1:1. Svaki od ispitivanih
sedimenata stavljen je u po 3 tegle. Po 20 jedinki, larvi hironomida prvog stupnja, 4 dana nakon
izleganja stavljeno je u svaku teglu. Temperatura vode u teglama odrţavana je na 21 ± 1ºC
pomoću vodenog kupatila, sa laganom aeracijom i 16:8 dnevno-noćnim ciklusom (Slika 5).
Hrana je pripremana svakodnevno, rastvaranjem 0,15g TetraMin® mešavine riblje hrane u 9ml
destilovane vode i u svaku teglu je dodavano 0,5ml rastvora. Nakon 8 dana larve su dostigle
četvrti stupanj. Kako bi bili sigurni da su sve jedinke dostigle četvrti larveni stupanj, eksperiment
je nastavljen do jedanaestog dana. Tada je eksperiment prekinut i larve četvrtog stupnja iz svake
tegle su prikupljene. Larve su dalje konzervirane u 70% etanolu.
Slika 5. Staklene tegle u vodenom kupatilu
26
3.3 Statistčka obrada podataka
3.3.1 Geometrijska morfometrija
U svrhu daljih morfometrijskih analiza, glave larvi hironomida su odstranjene i kuvane
15 minuta u 15% KOH na temperaturi od 100°C u, kako bi glavena čaura (gula) omekšala i bila
speremna za montiranje na mikroskopske pločice, tj. slajdove (polutrajne mikroskopske
preparate). Glavene kapsule su postavljene na mikroskopske pločice pomoću Berlez medijuma u
ventralnu poziciju (Slika 6). Mandibule su uklonjene kako ne bi smetale pri analiziranju
mentuma. Slajdovi su ostavljeni da se osuše 20 dana. Glavene kapsule, odnosno mentumi, su
ispitivani pod mikroskopom na uvećanju 200x i fotografisani (korišćen je Leica MZ16A
stereomikroskop sa 10x/21B uvećanjem na okularu i 20x na objektivu; fotografije su uslikane
pomoću kamere Leica DFC320 Digital Camera system).
Slika 6. U toku pravljenja preparata, postavljanja glave prokuvane u KOH na berlez
27
Mentum je deo usnog aparata hironomida sa centralnom simetrijom. Na njemu se nalazi
13 zuba, po 6 zuba na svakoj strani, i oni se nazivaju lateralni, dok je u centru srednji (medijalni)
zub koji ima tri dela. Morfološke varijacije mentuma analizirane su pomoću geometrijske
morfometrije. Glavni cilj geometrijske morfometrije je proučavanje varijacije oblika i veličine
struktura i njihove kovarijacije sa drugim varijablama. Morfometrija omogućava kvantitativne
opise organizama. Geometrijska morfometrija koristi skup obeleţja, tj. tačaka (“landmark”) za
opisivanje proučavanih oblika (organizama ili delova organizama). Landmark je dvo- ili
trodimenzionalna tačka koju definiše skup pravila. Analizirano je ukupno 178 mentuma
(nekoliko je polomljeno prilikom pravljena preparata i bilo neupotrebljivo za analizu). Za
kvantifikaciju variranja u veličini i obliku mentuma, digitilizovano je (odreĎeno) 29 tačaka na
svakom mentumu (Slika 7). Za digitalizaciju tačaka korišćen je tpsDig2 program (Rohlf, 2005).
Kako mentumi imaju centralnu simetriju, tačke su postavljene na sledeći način: od 1 do 8 opisuju
četiri mala lateralna zuba sa leve strane mentuma, a od 22 do 28 opisuju četiri mala zuba sa
desne strane; od 8 do 12 opisuju dva velika unutrašnja lateralna zuba na levoj strani, a tačke od
18 do 22 opisuju dva velika unutrašnja lateralna zuba sa desne strane mentuma; tačke od 12 do
18 opisuju veliki medijalni zub koji je podeljen na tri manja dela. Pomoću ovih tačaka praćene su
suptilne promene u obliku mentuma koje nisu vidljive golim okom i mogu se analizirati samo uz
pomoć datog softvera. Smatrano je da mentum poseduje deformitet ukoliko je postojao neki
dodatni zub, nedostajao neki od zuba, postojala fuzija (bili su spojeni neki zubi), ali ukoliko je na
mestu gde nedostaje zub ivica bila oštra smatralo se da je zub polomljen.
Slika 7. Pozicija 29 tačaka na mentumu hironomida
28
Uz pomoć TpsRewl softvera proverena je pozicija homologih tačaka svih mentuma
(Slika 8).
3.3.2 Multivarijantni i univarijantni testovi
Deformaciona ploča predstavlja mreţu pomoću koje moţemo da vidimo promene u
veličini i obliku mentuma. Vektori prikazuju variranje oblika (skalirano sa “Scale Factor” = -
6,0) .Najveće variranje u veličini i obliku se primećuje kod medijalnog zuba. (Slika 9)
Slika 8. CS odabranih tačaka sa vektorskim prikazom odstupanja od centralne vrednosti
Slika 9. Promena oblika mentuma prikazana na “deformacionoj mreţici”
29
Pomoću programa MorphoJ (Klingenberg, 2011) su izračunate Prokrusteove koordinate i
veličina centroida (CS). Za vizualizaciju varijabilnosti oblika mentuma primenjena je analiza
glavnih komponenti (PCA) i kanonijska diskriminantna analiza (CVA). CVA omogućava a
priori definisanje grupa (u našem slučaju tretmana na različitoj podlozi), čime se detektuju
minimalne medjugrupne razlike u obliku struktura. Ukupno je analizirano 178 jedinki podeljenih
u pet grupa na osnovu podloge na kojoj su uzgajane: standardna podloga, standardna podloga sa
medicinskom glinom, standardna podloga bez peska, standardana podloga bez gline i standardna
podloga bez treseta. S obzirom da PCA i CVA vizuelizuju obrasce varijabilnosti mentuma bez
statističkih indikacija, značajne razlike u veličini mentuma izmedju grupa su testirane primenom
analize varijanse (ANOVA) na CS (“Centroid Size”), a razlike u obliku mentuma primenom
MANOVA na svim varijablama oblika kao zavisno-promenljivim. Konačno, razlika u stopi
mortaliteta jedinki različitih tipova podloga je testirana neparametarskom analizom varijanse
(Kruskal-Wallis-ov test). Sve statističke analize uradjene su u programskom paketu
STATISTICA (Stat Soft. Inc. 7.0).
30
4.Rezultati i diskusija
4.1 Vidljive promene strukture mentuma
Nakon 11 dana, eksperiment je prekinut, a sa svakog tipa podloge je izolovan različit broj
larvi četvrtog stupnja (Tabela 1). Na standardnoj podlozi bez gline je dostignuta stopa
preţivljavanja u skladu sa protokolom (mortalitet manji od 30%). MeĎutim, Kruskal-Wallis-ov
test nije pokazao statistički značajne razlike (p>0.05) u stopi preţivljavanja izmeĎu različitih
tipova podloge. Ovakvi rezulati upućuju da glina, korišćena u istraţivanju, verovatno toksično
deluje na jedinke vrste Chironomus tentans i da zbog toga povećava nivo mortaliteta u svim
tipovima podloge gde je prisutna.
Tip podloge Standardna
podloga bez
treseta
Standardna
podloga bez
peska
Standardna
podloga sa
medicinskom
glinom
Standardna
podloga bez
gline
Standardna
podloga
Broj tretmana 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Broj preţivelih
larvi po
tretmanu
12
13
13
9
13
11
13
15
9
17
20
14
13
14
7
Ukupno
preţivelih larvi
38
33
37
51
34
Od ukupno178 analiziranih mentuma na 5 razlučitih tipova podloga detektovano je dva
mentuma sa vidljivim deformacijama, odsustvo jednog ili dva zuba (na standardnoj podlozi bez
treseta i standardnoj podlozi bez gline; Prilog 1). Istrošeni mentumi su se najčešće javljali u
tretmanima sa standardnom podlogom bez treseta (12) i standardnom podlogom bez gline (Prilog
2).
Postoji veliki broj publikacija na temu uticaja kontaminiranih supstrata na deformitete
delova usnog aparata kod larvi familije Chironomidae (Wiederholm, 1984; Dickman i Rygiel,
1996; Hudson i Ciborowski, 1996; De Bisthoven, Vermeulen i Ollevier, 1998; Watts i Pascoe,
1998; MacDonald i Taylor, 2006; Arambourou, Beisel, Branchu i Debat, 2012) MeĎutim, samo
jedna studija (Bird, 1997) je pratila uticaj tipa podloge na stepen deformisanosti mentuma vrste
Chironomus tentas u laboratorijskim uslovima. Rezultati su pokazali da ne postoji značajna
Tabela 1 Broj preţivelih larvi po tretmanima (tipu podloge).
31
razlika u javljanju deformisanih mentuma na četiri različita tipa podloge (papir, sitan pesak,
krupan pesak i glina). S druge strane najveći broj istrošenih mentuma je detektovan na sitnom
pesku a najmanji na krupnom pesku. Rezultati našeg eksperimenta su u skladu sa prethodnom
studijom, gde je najveći broj istrošenih mentuma izolovan na podlozi bez treseta i gline. Na
takvim podlogama je povećana količina peska što verovatno dovodi do pojačanog trošenja zuba
mentuma. Frekventnost javljanja deformisanih mentuma, kao i u studiji Bird-a (1997) nije bila
pod značajnim uticajem tipa podloge.
Statistički testovi su pokazali značajnu varijaciju u okviru uzorka. Varijacija veličine
mentuma, izračunata kao veličina centroida (CS) analiziranih varijabli (one-way ANOVA, p =
0.00), kao i varijacija oblika mentuma (multivarijantna analiza varijanse - MANOVA, na celom
setu varijabli, p = 0.00) bile su statistički značajne. Potom je izvršena dalja PCA i CVA analiza i
vizualizacija u MorphoJ softveru (Klingenberg, 2011).
Effect SS Degr. of
Freedom
MS F p
Intercept 396240142 1 396240142 14143.49 0.000000
Podloga 198991 4 49748 1.78 0.135842
Error 4846722 173 28016
Effect Test Value F Effect df Error df p
Intercept Wilks 0.000000 148541483 27 147.0000 0.000000
podloga Wilks 0.177124 3 108 586.0860 0.000000
4.2 Variranje oblika mentuma diskriminantnom kanonijskom analizom
(CVA)
Rezultati diskriminantne kanonijske analize (CVA) pokazuju duţ kojih osa se prethodno
definisane grupe razdvajaju. Ove ose maksimalizuju meĎugrupno u odnosu na unutargrupno
variranje odabranih karaktera. (Slika 10) (Ilić Milošević, 2015)
Tabela 2. One-way ANOVA, p=0.00, analiza varijacije velicine mentuma, izračunata kao veličina
centroida (CS) analiziranih varijabli
Tabela 3. Analiza varijacije oblika mentuma pomoću multivarijantne analize varijanse – MANOVA
na celom setu varijabli, p=0.00
32
CVA vizualizuje razdvajanje grupa po prvoj i drugoj kanonijskoj osi (Slika 10). Elipsama
su obuhvaćene grupe jedinki koje su uzgajane na istoj podlozi. Po prvoj kanonijskoj osi (CV1,
koja objašnjava 52.808% ukupne varijabilnosti) moţe se primetiti izdvajanje grupe jedinki koje
su uzgajane na standardnoj podlozi bez treseta (plava elipsa). Ta grupa je uglavnom u
negativnom delu CV1 ose. Najveće razdvajanje po CV1 osi je izmeĎu grupe jedinki uzgajanih na
standardnoj podlozi bez treseta i grupe jedinki uzgajanih na standardnoj podlozi sa medicinskom
glinom (ljubičasta elipsa), koja se većim delom nalazi u pozitivnom delu CV1 ose. IzmeĎu
ostalih grupa ne postoji značajno razdvajanje duţ CV1 ose i uglavnom se preklapaju.
Duţ CV2 (koja objašnjava 22.546% ukupne varijanse) ose nema značajnih razdvajanja
različitih grupa jedinki ali dolazi do velikog preklapanje grupa (Slika 10). Moţe se samo
primetiti da su jedinke iz grupe na standardnoj podlozi (ţuta elipsa) većim delom rasporedjene u
negativnom delu CV2 ose.
Slika 10. Distribucija jedinki svih grupa duţ prve i druge kanonijske ose (elipse sa 0.9 verovatnoćom
obuhvatanja podataka)
33
Ukoliko rezultate prikaţemo sa elipsama koje opisuju samo srednje vrednosti skupa,
razdvajanje medju različitim tretmanima je uočljivije (Slika 11). MeĎusobno najbliţe su jedinke
sa podloge bez gline (crvena elipsa) i bez peska (zelena elipsa), a najudaljenija od svih je grupa
sa podlogom bez treseta (plava). U centralnom delu morfoprostora i ka pozitivnom delu CV1 ose
(koja objašnjava najveći deo vrijabilnosti uzorka) grupiše se ukupno 4 grupa, dok se evidentno
podloga bez treseta izdvaja u negativni deo CV1 ose. Na osnovu vizualizacije mentuma (plavi
grafici), moţe se videti da jedinke u tom delu ose imaju kraće zube, pre svega centralni zub i
odstupaju najviše od prosečnog oblika mentuma. Ako pogedamo CV2 osu, moţemo uočiti
razdvajanje standardne podloge (ţuta elipsa) od ostalih i to u negativnom delu CV2 ose.
Na osnovu CVA analiza geometrijske morfometrije moţe se zaključiti da razlike u
tretmanima na različitim podlogama meĎu jedinkama, iako ne velike, svakako postoje. Podloge
bez gline i bez peska se nalaze u centralnom delu prostora, što dalje implicira da su mentumi tih
jedinki najpribliţniji prosečnom obliku mentuma. Kako je u ekotoksikološkim testovima
neophodno smanjiti variranje praćenog parametra (u ovom slučaju promene u obliku mentuma),
prikazani rezultati ukazuju da bi trebalo koristiti podlogu bez peska i bez gline. Ovo je u skladu i
Slika 11. CVA analiza sa prikazanim elipsama srednjih vrednosti i vizuelni prikaz oblika analiziranih
mentuma u zavisnosti od pozicije u morfoprostoru
34
sa prethodnim rezultatima gde su vidne promene mentuma (istrošenost zuba) najčešće na
podlogama gde dominira sitan pesak. Konačno, osim prikazanih analiza neophodno je raditi
dodatne provere kako bi se utvrdilo da li postoji trend promene oblika mentuma u odnosu na tip
podloge i odredila najadekvatnija podloga za izvodjenje ekotoksikoloških ispitivanja u kojima se
prati promena oblika mentuma kao indikator.
4.3 Variranje oblika mentuma analizom glavnih komponenti (PCA)
Kako bi smo ispitali kako se grupišu jedinke na osnovu oblika mentuma bez
prenaglašavanja meĎugrupnih razlika, tj. uvideli realniju sliku razlika medju ipistivanim
jedinkama, uraĎena je analiza glavnih komponenti (PCA).
Značajno razdvajanje jedinki po PC1 i PC2 osi se ne moţe uočiti, što ukazuje na veliku
sličnost svih analiziranih jedinki. (Slika 12) MeĎutim ova analiza pokazala je da je najveća
varijabilnost prisutna kod jedinki gajenih na podlozi bez treseta (najveća plava elipsa). Moţemo
zaključiti da bi najbolje bilo u testvoima dalje koristiti one podloge na kojima je uočena
najmanja varijabilnost u uzorku, tj. koje ne “izazivaju” velike promene u obliku mentuma (manje
Slika 12. PCA analiza C. Tentans uzgajanih na različitim podlogama
35
elipse). TakoĎe se moţe zaključiti da je neophodno dodatno ispitati podloge, koristiti veći broj
jedinki i sa većim brojem ponovaka, kako bi se izvršila detaljnija analiza.
36
5. Zaključak
1. Najveći broj prezivelih larvi četvrtog stupnja bio je na standardnoj podlozi bez gline.
2. Glina koja je korišćena u istraţivanju verovatno toksično deluje na jedinke vrste
Chironomus tentans pa je zbog toga povećan nivo mortaliteta u svim tipovima podloge u
kojima je prisutna glina.
3. Frekventnost javljanja deformisanih mentuma nije pod značajnim uticajem tipa podloge.
4. Na podlogama bez treseta i gline, gde je povećana količina peska, javlja se najveći broj
istrošenih mentuma zato što pesak verovatno dovodi do pojačanog trošenja zuba
mentuma.
5. Na osnovu 29 homologih tačaka standardne statističke analize za utvrĎivanje
varijabilnosti uzorka, ANOVA i MANOVA pokazale su statistički značajne razlike meĎu
jedinkama sa svih 5 podloga korišćenih u eksperimentu.
6. Na osnovu CVA analiza geometrijske morfometrije moţe se zaključiti da razlike u
tretmanima na različitim podlogama meĎu jedinkama, iako ne velike, svakako postoje.
7. PCA analiza pokazala je da je najveća varijabilnost prisutna kod jedinki gajenih na
podlozi bez treseta pa bi najbolje bilo u testvoima dalje koristiti one podloge na kojima je
uočena najmanja varijabilnost u uzorku, tj. koje ne “izazivaju” velike promene u obliku
mentuma.
37
6. Literatura
Arambourou, H., Beisel, J. N., Branchu, P., & Debat, V. (2012). Patterns of fluctuating
asymmetry and shape variation in Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae) exposed
to nonylphenol or lead. PloS one, 7(11), e48844.
Bird, G. A. (1997). Deformities in cultured Chironomus tentans larvae and the influence of
substrate on growth, survival and mentum wear. Environmental Monitoring and
Assessment, 45(3), 273-283.
De Bisthoven, L. J., Vermeulen, A., & Ollevier, F. (1998). Experimental induction of
morphological deformities in Chironomus riparius larvae by chronic exposure to copper
and lead. Archives of environmental contamination and toxicology, 35(2), 249-256.
Dickman, M., & Rygiel, G. (1996). Chironomid larval deformity frequencies, mortality, and
diversity in heavy-metal contaminated sediments of a Canadian riverine
wetland. Environment International, 22(6), 693-703.
Hudson, L. A., & Ciborowski, J. J. (1996). Spatial and taxonomic variation in incidence of
mouthpart deformities in midge larvae (Diptera: Chironomidae: Chironomini). Canadian
Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 53(2), 297-304.
Ilić Milošević, M. M. (2015). Taksonomski status rodova i vrsta Euaphidius Mackauer i
Remaudierea Starý (Hymenoptera, Braconidae, Aphidiinae) na osnovu morfoloških i
molekularnih analiza 28S rRNK i COI gena (Doktorska disertacija, Univerzitet u
Beogradu-Biološki fakultet).
Klingenberg, C. P. (2011). MorphoJ: an integrated software package for geometric
morphometrics. Molecular ecology resources, 11(2), 353-357.
Langer-Jaesrich, M., Köhler, H. R., & Gerhardt, A. (2010). Can mouth part deformities of
Chironomus riparius serve as indicators for water and sediment pollution? A laboratory
approach. Journal of soils and sediments, 10(3), 414-422.
Lenat, D. R. (1993). Using mentum deformities of Chironomus larvae to evaluate the effects of
toxicity and organic loading in streams. Journal of the North American Benthological
Society, 12(3), 265-269.
MacDonald, E. E., & Taylor, B. R. (2006). Incidence of mentum deformities in midge larvae
(Diptera: Chironomidae) from Northern Nova Scotia, Canada. Hydrobiologia, 563(1),
277-287.
38
OECD: “Test No. 218: Sediment-Water Chironomid Toxicity Using Spiked Sediment”
(http://dx.doi.org/10.1787/9789264070264-en ).
Ratte, H. T., Hammers-Wirtz, M., & Cleuvers, M. (2003). Ecotoxicity testing. In Trace Metals
and other Contaminants in the Environment (Vol. 6, pp. 221-256). Elsevier.
Rohlf, F. J. (2005). TpsDig, digitize landmarks and outlines, version 2.05. Department of
Ecology and Evolution, State University of New York at Stony Brook
(http://life.bio.sunysb.edu/morph/).
StatSoft, Inc. STATISTICA (2004). (data analysis software system), version 7.
www.statsoft.com.
Watts, M. M., & Pascoe, D. (1998). Selection of an appropriate life-cycle stage of Chironomus
riparius Meigen for use in chronic sediment toxicity testing. Chemosphere, 36(6), 1405-
1413.
Weltje, L., Bruns, E., & AG, B. (2009). The chironomid full life-cycle test. Validation report,
First draft.
Wiederholm, T. (1984). Incidence of deformed chironomid larvae (Diptera: Chironomidae) in
Swedish lakes. Hydrobiologia, 109(3), 243-249.
39
Prilog 1. Vidljivi deformiteti mentuma na podlogama: 1 – standardna podloga bez treseta; 2 –
standardna podloga bez gline.
1 2
40
Prilog 2. Istrošeni mentumi sa podloga: 1 – standardna podloga bez treseta; 2 – standardna
podloga bez gline.
1 1
1 1 1
1 1 1
1 1 1
1
2
41
ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Редни број, РБР:
Идентификациони број, ИБР:
Тип документације, ТД: монографска
Тип записа, ТЗ: текстуални / графички
Врста рада, ВР: мастер рад
Аутор, АУ: Зорана Лазаревић
Ментор, МН: Ђурађ Милошевић
Наслов рада, НР: Утицај типа подлоге на варијабилност деформитета ментума врсте
Chironomus tentans Fabricius, 1805 у тестовима токсичности
Језик публикације, ЈП: српски
Језик извода, ЈИ: енглески
Земља публиковања, ЗП: Р. Србија
Уже географско подручје, УГП: Р. Србија
Година, ГО: 2018.
Издавач, ИЗ: ауторски репринт
Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.
Физички опис рада, ФО:
(поглавља/страна/
цитата/табела/слика/графика/прилога)
33 стр. ; 12 слика, 3 табеле
Научна област, НО: биологија
Научна дисциплина, НД: екотоксикологија
Предметна одредница/Кључне речи, ПО: деформитети ментума, хирономиде, екотоксиколошки тестови
УДК 631.4:597.5+615.9
Чува се, ЧУ: библиотека
Важна напомена, ВН:
Извод, ИЗ: U ovom radu analizirano je da li tip podloge na kojoj se uzgaja kultura
Chironomus tentans utiče na variranje oblika, veličine i deformiteta mentuma
larvi. Larve su uzgajane na 5 vrsta podloge: standardna podloga, standardna
podloga sa medicinskom glinom, standardna podloga bez peska, standardana
podloga bez gline i standardna podloga bez treseta Ispitivanje je sprovedeno na
uzorku od 178 mentuma. Za analizu je korišćena metoda geometrijske morfomtrije
kao najpogodnija za detekciju malih promena u veličini i obliku objekata
istraţivanja. Uočeno je da se na podlogama gde je povećana količina peska javlja
veća istrošenost zuba mentuma nego na podlogama sa manje peska. TakoĎe je
uočeno da ne postoji značajni uticaj tipa podloge na pojavu i učestalost deformiteta
kod larvi hironomida.
Датум прихватања теме, ДП: 14.2.2018.
Датум одбране, ДО:
Чланови комисије, КО: Председник: Др Ана Савић, доцент
Члан: Др Милица Стојковић Пиперац, доцент
Члан, ментор: Др Ђурађ Милошевић, доцент
42
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO:
Identification number, INO:
Document type, DT: monograph
Type of record, TR: textual / graphic
Contents code, CC: master thesis
Author, AU: Zorana Lazarević
Mentor, MN: ĐuraĎ Milošević
Title, TI: The influence of substrate type on Chironomus tentans Fabricius, 1805 mentum
deformities in ecotoxicology tests
Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: English
Country of publication, CP: Republic of Serbia
Locality of publication, LP: Serbia
Publication year, PY: 2018
Publisher, PB: author’s reprint
Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.
Physical description, PD:
(chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appe
ndixes)
33 p. ; 12 pictures, 3 tables
Scientific field, SF: biology
Scientific discipline, SD: ecotoxicology
Subject/Key words, S/KW: mentum deformities, chironomid, ecotoxicity tests
UC 631.4:597.5+615.9
Holding data, HD: library
Note, N:
Abstract, AB: In this study was analysed whether the type of substrate on which Chironomus
thentans larvae were cultivated can affect the variation of shape, size and mentum
deformities. Larvae were cultivated on 5 types of substrate: standard substrate,
standard substrate with medical clay, standard substrate without quartz sand,
standard substrate without kaolin clay and standard substrate without peat. A
sample of 178 mentums was analysed. Geometric morphometry approach was
used for the analysis of structures as most suitable for detecting small variations in
size and shape. On the substrate with high amount of quartz sand mentums were
more worn out than menthums of the larvae cultivated on substrate with less
amount of quartz sand. It has also been observed that there is no significant effect
of the type of substrate on the frequency of mentum deformities in cultivated
Chironomus tentan larvae.
Accepted by the Scientific Board on, ASB: 2.14.2018.
Defended on, DE:
Defended Board, DB: President: PhD Ana Savić, assistant professor
Member: PhD Milica Stojković Piperac, assistant professor
Member, Mentor: PhD ĐuraĎ Milošević, assistant professor
43