Download - Mekanisme Transfer & Isolasi DNA
MEKANISME TRANSFER &
ISOLASI DNA
Fita Fatimah (4001410001)
Rahmawati (4001410002)
M. Irsyad (4001410016)
Inna Latifa R. (4001410036)
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
Outline
DNA sebagai Materi
Genetik
Mekanisme
Transfer DNA,
Transposons,
Mutasi
Isolasi DNA
Jurnal
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
DNA sebagai Materi Genetik
Konsep HereditasGenom
Elemen Genetik yang BergerakPercobaan Griffith, Avery et al,
Hershey & ChaseKelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012.
Mikrobiologi Terapan.
Konsep Hereditas• Ada dua fenomena biologi
pada konsep hereditas, yaitu:
1). Hereditas yang bersifat stabil : dimana generasi berikut yang terbentuk dari pembelahan satu sel mempunyai sifat yang identik dengan induknya
2). Variasi genetik yang mengakibatkan adanya perbedaan sifat dari sel induknya akibat peristiwa genetik tertentu, misal: mutasi.
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan
21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
1. Unit Herediter Bakteri (Genom)
1. Kromosom
Gen prokariota ada dalam kromosom.
Gen bakteri terdapat dalam molekul DNA tunggal (haploid). Berbentuk sirkuler, panjangnya ± 1mm, beratnya 2-3% dari berat kering satu sel, disusun sekitar 4 juta kbp DNA, makromolekul yang sangat banyak ini dikemas agar tidak berubah dalam bentuk superkoil (± 70-130 superkoil domain)
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
…Unit Herediter Bakteri (Genom)
2. Plasmid
adalah material turun temurun yang bukan bagian dari kromosom, dapat memperbanyak diri sendiri, biasanya bulat, kecil, dan relatif sederhana Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik.
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
3 Macam Plasmid1. F dan F’ plasmid, factor fertilitas konjugasi
2. R plasmid disebut juga RTF atau Resisten Transfer Factor plasmid membawa beberapa gen untuk resistensi terhadap antibiotic atau obat antibiotic yg lain.3. Col plasmid disebut juga colicinogenic, plasmid yang mengkode untuk colisin, protein yang membunuh secara sensitive sel E. Coli (Gardner, 1991).
Plasmid F Terdiri dari sekitar 25 gen, sebagian besar diperlukan untuk memproduksi
pili seks. Ahli-ahli genetika menggunakan simbol F+ untuk menyatakan sel yang mengandung plasmid F (sel "jantan"). Kondisi F+ dapat diwariskan: plasmid F bereplikasi secara sinkron dengan DNA kromosom, dan pembelahan satu sel F+ biasanya menghasilkan dua keturunan yang semuanya merupakan F+. Sel-sel yang tidak memiliki faktor F diberi simbol F- , dan mereka berfungsi sebagai resipien DNA ("betina")
selama konjugasi. Kondisi F+ adalah kondisi yang "menular' dalam artian sel F+ dapat
mengubah sel F- menjadi F+ ketika kedua sel tersebut berkonjugasi. (Campbell, 2002).
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
Plasmid RFaktor R pertama kali ditemukan di Jepang pada strain bakteri enterik yang mengalami resistensi terhadap sejumlah antibiotik (multipel resisten). Plasmid R100 disusun oleh 90 kbp yang membawa gen resisten untuk sulfonamid, streptomisin/spektinomisin, asam fusidat, kloramfenikol, tetrasiklin dan pembawa gen resisten terhadap merkuri.
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
2. Elemen Genetik yang Bergerak
Berdasarkan analisis genetik terhadap organisasi kromosom diungkapkan bahwa penyusunan kembali DNA dapat membawa elemen genetik yang bergerak.
Terdiri dari 2 Jenis :1. IS2. Transposon
Insertion Sequences (IS)
• adalah elemen urutan sisipan
yang merupakan unsur genetik yang mampu menyisip ke
tempat baru pada *replikon yang sama maupun berbeda. IS tidak dapat mereplikasi dirinya sendiri. Urutan dari kelompok IS sederhana biasanya hanya mengandung gen tunggal yang mengkode satu enzim, transposase, yang penting untuk transposisi elemen IS.
* Replikon : infomasi genetik yang diperlukan untuk replikasi dirinya sendiri.
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
Transposon• adalah unsur genetik yang
mengandung beberapa kbp DNA, termasuk informasi yang diperlukan untuk migrasi dari satu lokus genetik ke lokus genetik lain, terutama untuk fungsi khusus misalnya resistensi terhadap antibiotik.
Percobaan Frederick Griffith (1928)
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
Simpulan Percobaan Griffith
terdapat bahan yang utama untuk terjadinya proses transformasi (transforming principle) yang berperan dalam konversi tersebut yang mungkin merupakan beberapa bagian dari kapsul polisakarida atau beberapa senyawa yang dibutuhkan untuk sintesis kapsul meskipun kapsul itu sendiri tidak dapat menyebabkan pnemonia.
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
Percobaan Avery
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
Percobaan Avery et al• Filtrat dari sel IIIS yang telah dimatikan diperlakukan dengan protease
(suatu enzim yang dapat menghancurkan protein), dan RNase (suatu enzim yang dapat menghancurkan molekul RNA) secara terpisah, kemudian dicampur dengan sel galur IIR. Pencampuran ini masih menghasilkan bakteri galur IIIS, yang berarti bahwa protein dan RNA
bukan merupakan bahan untuk transformasi (transforming
principle). Percobaan lainnya adalah dengan menambahkan DNase (suatu enzim yang dapat menghancurkan enzim) pada filtrat dari sel IIIS. Filtrat yang telah dicampur dengan DNase ini ternyata
tidak mampu menghasilkan sel IIIS bila dicampur dengan sel
IIR, yang berarti tidak mampu menginduksi transformasi.
• Dari hasil percobaan ini, Avery, MacLeod, dan McCarty menyatakan bahwa DNA adalah bahan utama untuk transformasi.
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
Harshey & Chase
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
Simpulan• percobaan yang dilakukan oleh Hershey dan Chase membuktikan
bahwa DNA virus masuk ke dalam tubuh bakteri E. Coli, sedangkan sebagian besar protein virus tetap berada di luar. Masuknya materi genetik ke dalam tubuh bakteri akan menyebabkan terjadinya kerusakan program genetik bakteri karena diambil alih oleh DNA virus. Hal ini menyebabkan virus dapat dengan mudah memperbanyak diri selama di dalam tubuh bakteri. Percobaan Hershey dan Chase memberikan bukti kuat bahwa asam nukleat (bukan protein) merupakan materi hereditas.
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
TransduksiTransformasi
Konjugasi
Mekanisme Transfer Materi Genetik
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
ISOLASI DNA
Prinsip-prinsip Isolasi DNA
1. Sentrifugasi
2. Presipitasi
1. Sentrifugasi
• memisahkan substansi
berdasarkan berat jenis
molekul dengan cara
memberikan gaya
sentrifugal sehingga
substansi yang lebih berat
akan berada di dasar,
sedangkan substansi yang
lebih ringan akan terletak di
atas.
• Memakai mesin sentrifugasi.
2. Presipitasi
• Presipitasi merupakan
langkah yang dilakukan
untuk mengendapkan suatu
komponen dari campuran
(Alberts dkk. 1994: 254).
ALAT SENTRIFUGASI
Tahap-tahap isolasi DNA
1. Isolasi Jaringan2. Dinding sel dan membran dilisiskan3. Diekstraksi dalam larutan4. Dipurifikasi5. Dipresipitasi
1. Isolasi Jaringan
• Tahap pertama yaitu
mengisolasi jaringan
yang akan digunakan,
yaitu darah.
Menggunakan larutan
hipotanis yang terdiri
atas EDTA
(ethylenediamine
tetraacetic acid).
2. Dinding sel dan membran sel dilisiskan
• Melisiskan dinding sel
dan membran sel
dengan menggunakan
larutan pelisis sel darah
merah.
• Diinkubasi
• Disentrifugasi selama
10 menit dengan
kecepatan 2500 rpm.
3. Diekstraksi dalam larutan
• Ekstraksi
• Hal ini dilakukan
dengan tujuan agar
didapat ekstrak
nukleus sel darah
putih.
4. Purifikasi
• Purifikasi bertujuan
untuk membersihkan sel
darah putih dari zat-zat
lainnya; Ke dalam
larutan tadi kemudian
diberikan RNAse dan
diinkubasi selama 15
menit pada suhu 37°C.
Hal tersebut bertujuan
untuk mengoptimalkan
kerja enzim yang sangat
dipengaruhi oleh
temperatur.
5. Presipitasi
• Tahap presipitasi dilakukan
dengan cara meneteskan
larutan presipitasi protein dan
kemudian divortex yang
bertujuan untuk
menghomogenkan larutan.
• Larutan tersebut kemudian
disentrifugasi kembali selama
15 menit dengan kecepatan
3000 rpm.
• Menambahan isopropanol
untuk memvisualisasikan DNA
Lanjutan tahap 5 • Disentrifugasi
(hasil=terdapatnya pelet DNA pada dasar tabun)
• ditambahkan etanol 70% untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya dan dibolak-balik kembali..
• Disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm.
• Hasil = DNA yang berada pada tepi dasar tabung.
• Menambahkan Tris-EDTA yang bertujuan untuk melarutkan kembali DNA untuk dipreservasi
JURNAL“Transfer Plasmid Bakteri Metanogenetik Asal
Tanah Tempat Pembuangan Air Kelapa ke Dalam E coli C 600 untuk Produksi Biogas”
Tujuan dan Kegunaan • Mengisolasi dan karakterisasi bakteri metanogenik
dalam limbah air kelapa• Mengisolasi dan mengidentififikasi DNA bakteri
metanogenik dari dalam kotoran sapi• Mentransformasi plasmid bakteri metanogenik ke
dalam E. coli C600• Mengidentifikasi produk metan dari E. coli
transforman
Bakteri Metanogenik• Bakteri yang memproduksi metan• 16S rRNA termasuk kedalam archaebacteria• Bulat, batang, spiral• Motil atau tidak motil• Tidak membunyai klorofil• Aseksual : pembelahan biner
Prospek air kelapa
Penentuan Jenis Bakteri Metanogenik dalam limbah air kelapa
Penentuan Jenis Bakteri Metanogenik dalam limbah air kelapa
Di dalam media I dan III terjadi proses metabolisme yang meningkat,
Waktu yang tepat untuk mengidolasi bakteri metanogenik dan ditanam dalam media Ros bengal, kemudian di inkubasi dalam suasana
anaerob.
Penentuan Jenis Bakteri Metanogenik dalam Limbah
Air Kelapa
Karakteristik isolat bakteri Metanogenik
• Batang• Mesofil• Dapat memproduksi enzim katalase• Dapat mereduksi nitrat• Berperan dalam fermentasi gula• Dapat menghidrolisis gelatin, casein,
dan pati• Hidup pH 5,7 - 8,8
Bakteri termasuk ke dalam golongan gram positif, mempunyai endospora, berbentuk batang, dan bulat
Amphibacillus, Bacillus, Clostridium, Sporolactibacillus, Sporosarcina, Sulfobacillus, dan
Syntrophosphora.
Identifikasi Isolat Bakteri Metanogenikberdasarkan 16S rRNA
Isolasi DNA total
Ampifikasi Gen 16S rRNA
Perunutan Nukleotida
Penelusuran Produk metan dari E. coli C600 Transforman
Mengevaluasi pelet bakteri transforman
Fermentasi air kelapa steril dengan E.coli transforman
Kontrol positif : inokulan bakteri
metan putihKontrol
negatif :inokulan E. coli C600
Bertujuan untuk melihat apakah sudah terjadi ekspresi gen [enghasil metan oleh plasmid
bakteri metanogenik yang telah ditransformasikan dalam E.coli C600
KesimpulanTransformasi plasmid isolat P
kedalam E.coli C600 menghasilkan E.coli
transforman yang dapat memproduksi gas metan
setelah 3 hari fermentasi, lebih cepat 5 hari dari isolat P.
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
Kelompok 8. Pendidikan IPA Rombel 2 (2010). Dipresentasikan 21 Oktober 2012. Mikrobiologi Terapan.
Pertanyaan
1. Sujarwanto : Jelaskan kembali bagaimana mekanisme transfer genetik.
2. Dwi Lestari : Apakah replikasi virus bisa dilaksanakan tanpa adanya bakteri?