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MÉTODOS DE ESTUDO DE
LABORATÓRIO DE ANAERÓBIOS
http://www.icb.usp.br/bmm/mariojac
Prof. Dr. Mario J. Avila-Campos
BACTÉRIAS BUCAIS
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Para que isolar microrganismos?
- Conhecer os diferentes tipos microbianos
- Informação microbiológica completa e rápida
- Identificação dos organismos
- Susceptibilidade a antimicrobianos
- Melhor opção terapêutica e tratamento
Laboratório de Anaeróbios
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DIFICULDADES NO ESTUDO DE BACTÉRIAS BUCAIS
���� > 700 espécies podemser cultivadas e≥≥≥≥ 30 de um únicosítio;
���� Espéciessãodifíceispara cultivar e identificar ;���� Espéciessãodifíceispara cultivar e identificar ;
���� Características físicas de sítios de coleta;
���� Sítios comprogressão ativa diferente nos tempos de coleta;
���� Infecções bucais > infecções mistas e presença deoportunistas.
Laboratório de Anaeróbios
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MÉTODOS NO ESTUDO DE BACTÉRIAS BUCAIS
Dependente Cultivo
independente Cultivo
Microscopia
- Material clínico fresco
- Meio de cultivo
- Bactérias vivas
- Conta células viáveis
- Útil para antibiograma
- Material clínico fresco ou congelado
- Não precisa de meio de cultivo
- Não são necessárias bactérias vivas
- Não conta células bacterianas
- DNA diretamente de material clínico
- Métodos molecularesLaboratório de Anaeróbios
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MÉTODOS DE COLETA DE
AMOSTRAS CLÍNICASAMOSTRAS CLÍNICAS
Laboratório de Anaeróbios
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Fluxograma Geral de análise de espécimes clínicos
Paciente
Coleta espécime clínico
Gram Cultivo Sem cultivoGram Cultivo
Identificação
Bioquímica
Susceptibilidade a antimicrobianos
Imunológicos (ELISA)
Moleculares
Laboratório de Anaeróbios
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Processamento de coleta, transporte e cultivo de espécimes clínicos
MeioMeio de de transportetransporteBolsa periodontal
Laboratório de Anaeróbios
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Coleta e transporte de espécimes
Laboratório de Anaeróbios
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MÉTODO DEPENDENTE
DE CULTIVODE CULTIVO
Laboratório de Anaeróbios
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IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA
���� Morfologia colonial
���� Morfologia celular - Coloração de Gram
���� Pigmentação natural ou à luz UV
Laboratório de Anaeróbios
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IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA
���� Testes bioquímicos e fisiológicos
���� Imunológicos
���� Cromatografia gasosa
���� Biologia molecular: sondas, PCR, sequenciamento de DNA.
Laboratório de Anaeróbios
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Testes Bioquímicos
Sistema de identificação Mini-API Rapid (bioMérieux)
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Métodos Imunológicos ou de Imunodiagnóstico
���� Imunofluorescência.
���� Enzyme-linked immunoabsorbent assay
(ELISA).
���� Imunoaglutinação.
Laboratório de Anaeróbios
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Método imunológico: de Imunofluorescência
���� Clostridium septicum (verde).
���� Clostridium chauveii (vermelho).
Laboratório de Anaeróbios
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Método ELISA- imunoabsorvente ligado a enzima
• Anticorpos específicos ligados à superfície do poço da microplaca
• Adicione amostra problema. Lavar para remover Ag não ligado
• Adicione anticorpo específico conjugado à enzima.
• Adicione o substrato (à enzima).
• Medir a quantidade de produtoformado (corado).
para remover Ag não ligado
Laboratório de Anaeróbios
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Método imunológico: Imunoaglutinação do látex
Bactérias Anticorpos específicosligados látex
Aglutinação
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MÉTODOS INDEPENDENTE
DE CULTIVO
MÉTODOS MOLECULARES
Laboratório de Anaeróbios
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Métodos Moleculares
Etapas principais:
√ Desnaturaçãodo DNA√ Desnaturaçãodo DNA
√ Hibridização
√ Detecção
Laboratório de Anaeróbios
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Sonda: AGC TTA CGG AAC TCA GAT T
Composto radioativo ou quimioluminescente
Sondas de DNA
1
2
quimioluminescente
Parea-se com DNA homologo (hibridização)
Detecção
3
Emissão de luzLaboratório de Anaeróbios
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Sondas de DNA
1.
Imobilização do DNA alvo na membrana de nitrocelulose.
2.
denaturação
3.
hibridização
4.
Detecção pela sonda
Laboratório de Anaeróbios
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Detecção bacteriana por sondas de DNA
Laboratório de Anaeróbios
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���� Detecta-se pequenas quantidades de DNAbacteriano;
���� Amplifica -se pouco DNA gerando grandes
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
���� Amplifica -se pouco DNA gerando grandesquantidades;
���� Detecta-se microrganismos emespécimes clínicosestocados;
���� Viabilidade microbiana não é necessária.Laboratório de Anaeróbios
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- Iniciadores específicos
- Enzima: Taq polimerase
- Mg++
- Mistura de nucleotídeos
Máquina de PCR
9700. Perkin Elmer
- Temperatura anelamento
- DNA
Laboratório de Anaeróbios
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INICIDADORES ESPECÍFICOS PARA DETECÇÃO DE A. actinomycetemcomitans
3,5 kb
Linhas 1 a 11: A. actinomycetemcomitans; Linha 12: F. necrophorum; Linha 13: 1 kb ladder.
Avila-Campos et al. J. Clin. Periodontol. (1999). Laboratório de Anaeróbios
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Métodos de detecção bacteriana
Teste Vantagens Desvantagens
Microscopia campo escuro e contraste de fases
Detecta formas, tamanho, motilidade.
Não distingue espécies bacterianas
Cultivo bacteriano
Amplo espectro de bactérias em uma amostra; Susceptibilidade a antimicrobianos
Caro, demorado, falha para bactérias não-cultiváveis
a antimicrobianos
Sondas DNA e imunoensaios
Específicos, rápidos e relativamente baratos
Reação-cruzada, caro
Ensaios enzimáticos
Específicos, rápidos e baratos
Grupos bacterianos e não espécies individuais
PCROrganismos específicos, rápido, é o teste mais sensível
Instrumentos caros
Zambon & Haraszthy (2000). Laboratório de Anaeróbios
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Sensibilidade dos Métodos de Detecção Microbiana
Método Limite de detecção
Detecção de espécies não viáveis
Tempo
Cultivo não seletivo 104-105 Não 1-3 semanas
Métodos imunológicos 104 Sim Minutos-horas
Imunofluorescência 103 Sim Minutos-horas
Sondas DNA 102 1-48 horasSim
PCR 10 Sim 2-4 horas
Hibridização de DNA 103 Sim 1-48 horas
French et al. (1986); Furrer et al. (1991); Maiden te al. (1991); Socransky et al. (1994); Zambon & Haraszthy (2000).
Laboratório de Anaeróbios
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» Caracterização molecular fornece sequências
nucleotídicas.
APLICAÇÃO DOS MÉTODOS MOLECULARES NO
DIAGNÓSTICO DA INFECÇÕES BUCAIS
» Amplificação de sequências alvo diretamente de
material clínico.
» Detecção e identificação de organismos exigentes.
Laboratório de Anaeróbios
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“A aplicação de um único método para detecção
de organismos pode não ser ideal, assim, a
combinação de técnicas é necessária para
avaliar melhor as doenças infecciosas bucais em
termos ecológicos, epidemiológicos e de
patogênese”
Laboratório de Anaeróbios