Microorganismos extremófilosDr. J.V. Sinisterra
Biotransformations GroupFaculty of Pharmacy
Universidad Complutensewww.biotransformaciones.com
Tabla 1 Tipos de microorganismos extremófilos
AMBIENTE COMPORTAMIENTO PARÁMETRO EJEMPLO ORGANISMO
Temperatura HipertermófiloTermófiloPsicrófilo
Crecimiento > 80ºCCrecimiento 60-80ºCCrecimiento < 15ºC
Pyrolobus fumarii (113ºC)Synechoccus lividisPsychrobacteria (algunos insectos)
Radiación Atomófilos Superior a 6000 rad/hr; 15 Mradtot.
Deinococcus radiodurans
Presión Barófilos Por encima de los gigapascals Sh. Oneidensis, E. coli
Sequedad Xerófilos Ausencia de agua Artemia salina, hongos, etc
Salinidad Halófilos 2-5 M NaCl Halobacteriaceae, D. salina
pH (Acidez/alcalinidad)
AlcalófilosAcidófilos
pH > 9pH < 0
Natronbacterium, B. FirmusCyanadium caldarium (pH 0)
Presión de oxígeno AnaerobioMicroaerófilos”
No tolera O2Tolera bajas [O2]
Methanococcus jannaschiiClostridium
Extremos químicos GasesMetales
Atmosfera pura de CO2Elevadas concentraciones de metales
Cyanidium caldariumFerroplasmic acidarmanus
Total 1,9 x 107 1,2 x 105 0,65
Virus 13 x 104 - 13 x 106 5 x 103 0,04
Archea ?? 500 ??
Bacteria 4 x 104 - 4 x 106 4,8 x 103 0,12
Hongos 1,5 x 106 69 x 103 5
Algas 6 x 104 4 x 104 67
ReinoReinoEspecias Especias EstimadasEstimadas
Especies Especies Conocidas Conocidas
19951995%%
ConocidoConocido
BIODIVERSIDAD
BIODIVERSIDADBiotopoBiotopo
% Microorganismos% Microorganismoscultivablescultivables
Lodos Activos 1 – 15
Agua Marina 0,001 – 0,1
Agua Dulce 0,25
Lagos Mesotrópicos 0,1 – 1
Aguas de Estuario 0,1 – 15
Sedimentos 0,25
Suelo 0,30
Arqueas (Archaea)
Microorganismos primitivos cuyas biomoleculas, enzimas y mecanismo metabólicos son diferentes de los de otros microorganismos
Suelen estar adaptadas a vivir en condiciones extremas de T, pH, salinidad etc
HipertermófilosHalófilosMetanogéncios
Diferencias con los organismos mesófilos1) No tienen triglicéridos en las membranas sino polietersformados por uniones de glicerol y unidades de isopreno
OHO
O
O
OO
O
OO
OO
HO
OO
OH
2) Microorganiosmo acidófilosSulfolobus sp. HO
OH
Paredes celulares con pseudo-peptidoglicanos deNAG beta-1-3 y NAT beta 1,3-resistentes a la lisozima
bacteriana
HO OH
HHO
H
HOHH OH
OHAcetil-CoA via oxidación y no via glicolisis normal
Lactato Acetil-CoA CH3- tetrahidrometopterina
CO2
CO-deshidrogenasa(especifica de arqueas)
2)Metabolismo especial
CO2 + 4H2 CH4 + H2 O Δ Go = -131 kJ/mol
4 CO + 2 H2O CH4+ 3 CO2Δ Go = -220 kJ/mol
4 HCOOH CH4 + 3 CO2 + 2 H2O Δ Go = -319 kJ/mol
CH3-NH2 +HCl CH4 + CO2 + 4 NH4 Cl Δ Go = -230 kJ/mol
2CH3OH CH4 + CO + 2H2O Δ Go = -319 kJ/mol
CH4 -COOH + H2O CH4 + CO2Δ Go = -31 kJ/mol
Microorganismo metanogénicos
Aplicaciones industriales
1.- Arqueas metanogénicas .- producción de metano a partir de residuos urbanos
2.- DNA polimerasas termoestables de Thermus aquaticus para ensayos de PCR
3.- Alcohol deshidrogenasas resistentes a los medios orgánicos. Sulfolobus sulfataricus
4.- Recuperación de metales Ni, Cu, U, Au etc Sulfolobus sp.
Enzimas mas termoestables que las de los mesofilos
1.- Sustitución aminoácidos flexibles (Gly, Ser, Ala etc) por aminoácidos Rígidos (Thr, Val, Pro)
2.- Sustitución de aminoacidos con grupos reactivos Cys (SH), Glu y Asp(COOH), Asn (CONH2) porotros inertes Ala, Leu etc.3.- Tiene una relación Arg/Lys alta lo que permite fuertes interacciones
polares
EXTREMOFILO HABITAT ENZIMA APLICACIONES REPRESENTATIVAS
Termófilo Elevada temperaturaTermófilos moderados (45-65ºC)Termófilo (65-85ºC)Hipertermófilos (< 85ºC)
AmilasasXilanasasProteasasDNA polimerasas
Glucosa, fructora para edulcorantesBlanqueo del papelFermentaciones, detergentesIngeniería genética
Psicrófilo Baja temperatura ProteasasDeshidrogenasasAmilasas
Maduración del queso, producción de lácticosBiosensoresDegradación de polímeros en detergentes
ACIDÓFILO Bajo pH Oxidación de sulfurosConcentrado de calcopirita
Desulfuración del carbónRecuperación de metales
AlcalinófiloHalófilo
Elevado pHElevada salinidad
Celulasas Degradación de polímeros en detergentes
Barófilos Elevada presión Cualquier microorganismo Formació de geles y almidones granulados
Metalófilo Elevada concentración de metal Cualquier microorganismo Bioremediación, biomineralización
Radiófilo Elevados niveles de radiación Cualquier microorganismo Bioremediación contaminación radionuclear???
Microaerofilo Crecimiento en <21% O2
Aplicaciones industriales de enzimas aisladas de microorganismos termófilos
Hipertermófilos
Se conocen como hipertermófilso aquellos microorganismos que crecen por encima de 80ºC.Hay algunos que crecen por enzima de la temperatura de ebullición del agua.-Pyrolobus fumarii 113ºC
Muchos de ellos corresponden al dominio de las Archeas.
Los hipertermófilos se encuentran en entornos terrestres o marinos, siempre que haya agua Caliente v.g. agua calentada por fuentes termales, geisers o volcanes.
El estudio de secuencias 16S rDNA de los hipertermófilso ha demostrado que se encuentran en lo mas profundo de las ramas de la evolución. Son organismos muy primitivos.
Enzimas de hipertermófilos
Hidrolasas.- Pyrobaculum calidifontis y Sulfolobus solfataricus producenCarboxil-esterasas y esterasas termoresistentes.No se han descrito hasta ahora verdaderas lipasas .-selectivas hacia esteres de ácidos grasos
Pyrococcus furiosus es un excelente productor de proteasasSu perfil de actividad es similar al de la subtilisina
P.furiosus, P.horikoskhii y S. sulfataricus producen enzimas sacarolíticasEstan descritas α-amilasa, β-glicosidasa, β- glucosidasa, β-galactosidasa yExo-β-D- glucosaminidasa
Enzimas de hipertermófilos
Alcohol dehidrogenasas.- P. furiosus, S. solfataricus y Aeropyrum pernixSe han descrito como productores de estas enzimasEn concreto la de P. furiosus tiene 234 aminoacidos y presenta similitudes con las ADH de cadena corta (van der Ost ycol 2001)
Este tipo no suele tener una gran estereospecificidad
O
HO
HO
R- 21.8 U/mg
S- 32.3 U/mg
ADH P. furiosus
Enzimas de hipertermófilos
Alcohol dehidrogenasas.- S. solfataricusTiene 347 aminoacidos y es NADH dependiente. Muestra una buena Enantioselectividad en la reducción de cetonas pequeñas (Esposito y col 2002)
Asi la (R,S) 3-metil-butan-2-ona da el alcohol de configuración S, pero nohay una marcada selectividad hacia la configuración del centro que lleva el metilo
O
HO
ADH S. solfataricus
HO
Enzimas de hipertermófilos
En la actualidad se están identificando los genes de los hipertermófilso que producenlas enzimas de interés para expresarlas en E. coli.
Psicrofilos. Organismos cuya T óptima de crecimiento es <15ºC
Psicrotrofos organismos cuya T óptima de crecimiento es de 15 º<T<20ºC
Psicrotolerantes Organismos mesófilos que pueden adaptarse a vivir a bajas. T
Metodologías para aumentar la actividad enzimática en los organismos Psicrofilos
1.- aumentar la concentración intracelular de enzimas.- Psicrotolerantes y psicrotrofos
2.- Fabricando enzimas cuya actividad es casi independiente de T. ΔG ≈ 0
3.- Fabricando enzimas muy específicas y de elevado turnover
α-amilasa T(ºC) K(s-1) ΔG≠
(kJ/mol)ΔH≠
(kJ/mol)ΔS≠
(J/mol x K)
A.halophantis(psicrof)
15 187 58 71 46
B. amyloliquefaciens 15 34 62 97 122
Subtilisina
B.TA41 (psicrof) 15 25 62 36 -92
B. subtillis 15 5 66 46 -70
La diferencia fundamental es que sus proteínas son muy flexibles para que a bajas T sigan manteniendo la estructura 3D.
Por ello tienen:1)pocos puentes salinos o pares iónicos y por ello la relación (Arg+Lys)/ Lys
es muy baja2) posee pocos enlaces de H. esto hace que se pierdan los contactos
entre los barriles β. Tienen además pocos aminoácidos tipo Ser, Thr, Asn, Gln
3) tienen pocas interacciones de stacking entre anillos aromáticos Tyr, Phe y Trp.4) tiene pocas interacciones bipolares entre C=O y NH en las hélices – α5)sus proteínas tienen poca afinidad por iones estabilizadores de estructuras
tales como Ca(II)6)sus superficies son muy hidrófobas dando valores anormales de pI7) su interior es mas hidrófilo que en los mesofilos pro lo que hace que sedesnaturalicen por el agua.
La Ingeniería de los Procesos Enzimáticos- aplicación a enzimas de termófilosLa Ingeniería de los Procesos Enzimáticos- aplicación a enzimas de termófilos
BÚSQUEDA DE NUEVAS ENZIMAS MÁS EFICIENTESCLONAJE E HIPEREXPRESIÓNMUTACIÓN (PURIFICACIÓN, PROPIEDADES…)MEJOR PROTOCOLO DE PURIFICACIÓNPROTOCOLOS MUY SENCILLOS DE INMOVILIZACIÓN + ESTABILIZACIÓNINGENIERÍA MICROSCÓPICA DEL CATALIZADORINGENIERÍA DE LA REACCIÓNINGENIERÍA DEL REACTOR
RESULTADOS PODRIAN SER ESPECTACULARES
INGENIERIA ENZIMÁTICA COMO INGENIERIA MULTIDISCIPLINAR Y COMPLEJA: NUEVAS POSIBILIDADES EN TECNOLOGIAS DE ALIMENTOS
ENZIMASENZIMASENZIMAS
Biodiversidad Súper-producciónAlteración de la secuencia
de aminoácidos 3D
NUEVOS YMEJORES ENZIMAS
NUEVOS YMEJORES ENZIMAS
MICROBIOLOGÍAMICROBIOLOGÍA BIOLOGÍA MOLECULARBIOLOGÍA MOLECULAR
DNA RECOMBINANTE PCR
Aplicación a la QUIMICA ORGANICA
ENZIMAS DE TERMÓFILOS
““criterio de seleccicriterio de seleccióón naturaln natural””: eficacia biol: eficacia biolóógica gica a altas temperaturasa altas temperaturas
producto de la evoluciproducto de la evolucióón natural: enzimas n natural: enzimas termotermo--resistentesresistentes
criterio seleccicriterio seleccióón natural = criterio seleccin natural = criterio seleccióón industrialn industrial
enzimas muy minoritariaslos microorganismos extremófiloscrecen muy lentamente
Clonación, súper expresión en microorganismos hospedadores adecuados
Microorganismos Termófilos: Viven a Altas TemperaturasMicroorganismos Termófilos: Viven a Altas Temperaturas
ENZIMAS TERMORRESISTENTESENZIMAS TERMORRESISTENTES
PROCESOS A ALTA TEMPERATURA(prevención de contaminaciones, economía del proceso)PROCESOS A ALTA TEMPERATURA(prevención de contaminaciones, economía del proceso)
Microorganismos termófilosMicroorganismos termófilos Enzima minoritariaDifícil de crecer en fermentadores
industriales
Enzima minoritariaDifícil de crecer en fermentadores
industriales
Clonación e hiperexpresión en microorganismos mesófilos hospedantes fáciles de manejar
Clonación e hiperexpresión en microorganismos mesófilos hospedantes fáciles de manejar
BIOLOGIA INDUSTRIA
ENZIMAS DE MICROORGANISMOS QUE NO HAN SIDO DETECTADOSENZIMAS DE MICROORGANISMOS QUE NO HAN SIDO DETECTADOS
ClonajeClonaje, s, súúperper--expresiexpresióónn
Nuevas EnzimasNuevas Enzimas
Homología conenzimas conocidas
Bibliotecade
Secuencias
AmplificaciónDNA
(PCR)
ExtracciónDNA
mRNA
SuelosAguas TermalesAguas de Dorsales
Marinas
Aprovechamiento de evoluciAprovechamiento de evolucióón natural n natural –– TERMTERMÓÓFILOSFILOS
UtilizaciUtilizacióón directa de DNA ( organismos difn directa de DNA ( organismos difííciles de identificar)ciles de identificar)
Mejora por evoluciMejora por evolucióón dirigidan dirigida
Estructura 3D ( Rayos X, modelos matemEstructura 3D ( Rayos X, modelos matemááticos... )ticos... )
Mejora por Mejora por mutagmutagéénesisnesis dirigidadirigida
ENZIMAS INDUSTRIALESENZIMAS INDUSTRIALES
Actividad y selectividad substratos naturalesActividad y selectividad substratos naturalesEstabilidadEstabilidad
Las enzimas deben ser purificadasLas enzimas deben ser purificadas
Alta actividad volumAlta actividad voluméétricatrica
Enzimas puras
Problemas de alergenicidad (solubles)
Ausencia de reacciones laterales catalizados por otras enzimas
contaminantes (oxidaciones, hidrólisis, proteasas solubles o inmovilizadas)
Máxima capacidad de carga de los derivados inmovilizados
Enzimas inmovilizadas y estabilizadasEnzimas inmovilizadas y estabilizadas
Re-uso
Reactores en continuo para tratamiento de grandes volúmenes de sustrato
La enzima no se libera al alimento
(posibilidad de utilizar un mayor número de enzimas)
Derivados inmovilizados y estabilizados para su uso por prolongados periodos de
tiempo
tecnología y economía
Purificación de enzimas industriales mediante procesos cromatográficosPurificación de enzimas industriales mediante procesos cromatográficos
ESTE MÉTODO DE PURIFICACION PUEDE SER:
a). Muy eficiente y útil a escala laboratorio
b). Deberían ser muy útiles a escala industrial pero necesitan simplificarse y optimizarse
Adsorción Selectiva de Enzimas Grandes Sobre Soportes Iónicos Poco ActivadosAdsorción Selectiva de Enzimas Grandes Sobre Soportes Iónicos Poco Activados
Adsorción de enzimas grandes y pequeñas
Adsorción de enzimas grandes y pequeñas
Adsorción selectiva de enzimas grandes Adsorción selectiva de enzimas grandes
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Act
ivid
ad (%
)
0
20
40
60
80
100
Prot
eina
s (%
)
Grado de aminación del soporte (µmols)
Desorción de la β-galactosidasas de Thermus sp. T2, Adsorbida a Soportes MANAE de Diferente Grado de Activación
Desorción de la β-galactosidasas de Thermus sp. T2, Adsorbida a Soportes MANAE de Diferente Grado de Activación
PesselaPessela y col. y col. J. Chromatgr. AJ. Chromatgr. A, 1034, (2004), 155, 1034, (2004), 155--159159. .
AnAnáálisis por filtracilisis por filtracióón en gel de las proten en gel de las proteíínas del extracto crudo de nas del extracto crudo de E. coliE. coliadsorbidas a soportes MANAEadsorbidas a soportes MANAE--agarosa con diferente grado de activaciagarosa con diferente grado de activacióónn
Volumen de Elución (mL)
Prot
eína
s (µ
g/m
l)
0
2
4
6
8
10
12
50 60 70 80 90 100 110
ProteProteíínas adsorbidas a nas adsorbidas a MANAE altamente activadoMANAE altamente activado
ProteProteíínas nas adsorbidas adsorbidas
a MANAE 1 a MANAE 1 μμmolmol/g /g
Purificación de Enzimas Multiméricas de Microorganismos Termófilos Clonadas en Mesófilos por Adsorción Selectiva a Soportes de Intercambio Iónico Poco ActivadosPurificación de Enzimas Multiméricas de Microorganismos Termófilos Clonadas en
Mesófilos por Adsorción Selectiva a Soportes de Intercambio Iónico Poco Activados
0
2
4
6
8
10
12
45 55 65 75 85 95 105
Volumen de elución (mL)
Prot
eina
s (u
gr /m
L)
- Se eliminan las proteínas de elevado peso molecular del organismo mesófilo
- La proteína de mayor peso molecular se mantiene intacta (nuestro interés)
PesselaPessela y col. y col. Biotechnol. Biotechnol. ProgrProgr. 20, (2004), 1507. 20, (2004), 1507--15111511
Análisis por Filtración en Gel de PROTEINAS de Microorganismos TermófilosClonadas en Mesófilos por Adsorción Selectiva a Soportes de Intercambio Iónico Poco Activados
α-galactosidasa
1 2 3 4
9467
43
30
20
1- Patrón de PM
2- Extracto crudo
3- Proteínas tras choque térmico
4- Proteínas adsorbidas a soportescon baja densidad de grupos
1- Patrón de PM
2- Extracto crudo
3- Proteínas tras choque térmico
4- Proteínas adsorbidas a soportescon baja densidad de grupos
Purificación de la α-galactosidasa de Thermus sp. T2 Clonada en E. coliPurificación de la α-galactosidasa de Thermus sp. T2 Clonada en E. coli
PesselaPessela y col. y col. J. J. ChromatogChromatog. A. A, 1055, (2004), 93, 1055, (2004), 93--9898
ENZIMAS DE TERMOFILOS
Elevada estabilidad térmicaElevada estabilidad en presencia de codisolventes orgánicosTemperatura óptima elevadaBaja actividad a temperaturas moderadas
Esterasa de Bacillus stearothermophilusCatecol 2,3 dioxigenasa de Bacillus stearothermophilusAlfa y beta galactosidasa de Thermus sp.Xilanasa de Thermotoga maritima
ESTERASA DE B. stearothermophilus
Temperatura óptima del microorganismo: 60ºCTemperatura óptima de la enzima: 62ºCElevada actividad a temperatura moderadaAmplia especificidad
30
95
0
20
40
60
80
100
60
95
0
20
40
60
80
100
Act
ivid
ad R
esid
ual,
(%)
Act
ivid
ad R
esid
ual,
(%)
Act
ivid
ad R
esid
ual,
(%)
Act
ivid
ad R
esid
ual,
(%)
30% 30% propanolpropanol 500 500 mMmM ClNaClNa
Efecto de Efecto de coco--disolventesdisolventes Efecto de la fuerza iEfecto de la fuerza ióónicanica
ACTIVIDAD DE LA ESTERASA DE ACTIVIDAD DE LA ESTERASA DE B. B. stearothermophilusstearothermophilusEN MEDIOS DESFAVORABLESEN MEDIOS DESFAVORABLES
XY OH
OHZ Z COOHCH
O
XOHY
CatecolCatecol 2,3 2,3 dioxigenasasdioxigenasas
CatecolCatecolSemialdehidoSemialdehido
22-- hidroximuchidroximucóóniconico
CatecolCatecol 2,3 2,3 dioxigenasadioxigenasa de de B. B. stearothermophilusstearothermophilus
EstabilidadEstabilidad ttéérmicarmica elevadaelevada ( ( microorganismomicroorganismo crececrece a 55a 55ººC )C )
Enzimas multimEnzimas multimééricasricasCentro Centro catalcatalííticotico con un con un grupogrupo Fe Fe 2+2+ no no hemohemoMuyMuy inestablesinestablesPosibilidadPosibilidad de ser de ser utilizadasutilizadas
en en ssííntesisntesis de de piridinaspiridinas complejascomplejasEE
0
25
50
75
100
0 25 50 75 100A
ctiv
idad
Act
ivid
adR
esid
ual,
(%)
Res
idua
l, (%
)
EFECTO DE LA UNION COVALENTE MULTIPUNTUALEFECTO DE LA UNION COVALENTE MULTIPUNTUALEN LA ACTIVIDAD DE LA CATECOL 2, 3 DIOXIGENASA EN EN LA ACTIVIDAD DE LA CATECOL 2, 3 DIOXIGENASA EN
CONDICIONES DESFAVORABLESCONDICIONES DESFAVORABLES
0
25
50
75
100
0,00001 0,001 0,1 10 1000Act
ivid
adA
ctiv
idad
Res
idua
l, (%
)R
esid
ual,
(%)
[[catecolcatecol mMmM]]TemperaturaTemperatura
pH 7, 40pH 7, 40ººCC pH 7, 0.1 pH 7, 0.1 mMmM catecolcatecol
XILANASA DE XILANASA DE ThermotogaThermotoga maritimamaritima
Temperatura crecimiento, 80ºCEnzima muy termoestableMáximo de actividad 105ºCVida Media a 100ºC aproximadamente 10 minutos
Un buen modelo para estudiar la degradaciUn buen modelo para estudiar la degradacióón qun quíímica mica de protede proteíínas correctamente plegadas nas correctamente plegadas
EFECTO DE LA INMOVILIZACION EN LA ESTABILIDAD DE LA XILANASA DE T. maritima
Vida
med
ia (m
in)
T, (ºC)
0,01
0,1
1
10
100
1000
10000
95 105 115 125
pH 7
EFECTO DE LA INMOVILIZACION EN LA ESTABILIDAD DE LA XILANASA DE T. maritima
Vida
med
ia (m
in)
T, (ºC)
0,01
0,1
1
10
100
1000
10000
95 105 115 125
pH 7
INMOVILIZACIÓN Y ESTABILIZACIÓN DE LA ß-GALACTOSIDASA DE Thermus sp. T2.
Enzima tetramérica de elevado peso molecularAltamente termorresistenteActiva y estable en un amplio rango de pH.
Potencialmente útil para hidrolizar lactosa en leche y en sueros de quesería a alta temperatura
INMOVILIZACIÓN MULTIPUNTUAL CON DIFERENTE ORIENTACIONES SOBRE SOPORTES EPÓXIDO
Inmovilización y Estabilización de Enzimas Multiméricas
Inmovilización Multipuntual de Enzimas Sobre Soportes Epóxido
Muy estables: transporte Pueden reaccionar con distintos nucleofilos de la enzima:
inmovilización multipuntual muy favorable Facilidad del bloqueo de epóxidos remanentes
Muy poco reactivos: velocidad de inmovilización extremadamente lentaPosibilidad de modular la enzima sobre el soporte
H2N
HS
HO
O
O
O
O
O
O
O
O
O
Derivado no estabilizado Derivado no estabilizado
Detección de subunidades enzimáticas no unidas al soporte vía epóxido.DetecciDeteccióón de subunidades enzimn de subunidades enzimááticas no unidas al soporte vticas no unidas al soporte víía epa epóóxido.xido.
+SDS-PAGESDS-PAGE
derivado estabilizadoderivado estabilizado
Mecanismo de Estabilización de Enzimas
SDS Mercaptoetanol, 100ºC
++
Estabilización del Derivado Boronato por Entrecruzamiento con Dextrano Aldehído pH 6,5 70 ºC
1 Patr1 Patróón de peso molecularn de peso molecular2 Derivado boronato sin entrecruzar2 Derivado boronato sin entrecruzar3 Derivado boronato entrecruzado3 Derivado boronato entrecruzado
ββ-- galactosidasagalactosidasade de ThermusThermus sp. T2sp. T2
11 22 33
9797000000
4500045000
3000030000
2010020100
6600066000
1440014400
Act
ivid
ad re
sidu
al,(%
)A
ctiv
idad
resi
dual
,(%)
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10
Tiempo (horas)Tiempo (horas)
derivado boronato entrecruzadoderivado boronato entrecruzado
ββ--galactosidasa solublegalactosidasa soluble
Pessela y col. Biotechnol. Prog. 20, (2004), 388-392
AdsorciAdsorcióón en ausencia de Imidazoln en ausencia de Imidazol AdsorciAdsorcióón en presencia de Imidazol n en presencia de Imidazol
Las proteLas proteíínas de elevado peso molecular se pegan mucho mas nas de elevado peso molecular se pegan mucho mas fuertes que las protefuertes que las proteíínas de pequenas de pequeñño peso molecularo peso molecular
AdsorciAdsorcióón de proten de proteíínas sin colas de Polinas sin colas de Poli--HisHis sobre soportes quelatos altamente activadossobre soportes quelatos altamente activados
Adsorción de la α-galactosidasa de Thermus sp. T2 clonada en E. coli á soportes IMAC altamente activados
Pessela Pessela y col. y col. EnzymeEnzyme MicrobialMicrobial TechnolTechnol. 39, (2006), 909. 39, (2006), 909--915915..
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 500
20
40
60
80
100
Act
ivid
ad r
esid
ual ,
%
Prot
eína
s ad
sorb
idas
,%
[Imidazol, mM]
Proteínas totales
Actividad α-galactosidasa
Efecto del Imidazol en la adsorción de la α-galactosidasa y de otras proteínas de E. coli
Grado de activaciGrado de activacióón del soporte: 115 n del soporte: 115 μμMM de quelatos /g de soportede quelatos /g de soporte
9467
43
31
21
1 2 3
9467
43
31
21
1 2 3
LMW (kDa)
PurificaciPurificacióón de la n de la αα-- y y ββ--galactosidasas de galactosidasas de ThermusThermus sp. T2 clonadas en sp. T2 clonadas en E. coliE. coli
1.1.-- Choque tChoque téérmicormico2.2.-- AdsorciAdsorcióón selectiva a soporte IMAC muy activados en presencia de 50 mM dn selectiva a soporte IMAC muy activados en presencia de 50 mM de imidazoe imidazo
α-galactosidasa
Adsorción de la α- y β-galactosidasas de Thermus sp. T2 clonadas en E. coli ásoportes IMAC altamente activados
LMW (kDa)
1- PM; 2- Extracto crudo; 3- enzima purificada
PesselaPessela y col. y col. EnzymeEnzyme MicrobialMicrobial TechnolTechnol. (In . (In presspress).).
β-galactosidasa
Purificación-Inmovilización-Estabilización de la α- y β-galactosidasasde Thermus sp. T2 sin Poli-His, adsorbidas a soportes IMAC muy activados
PesselaPessela y col. y col. EnzymeEnzyme MicrobialMicrobial TechnolTechnol. (In . (In presspress))
Condiciones de inactivaciCondiciones de inactivacióón: pH 7, 70n: pH 7, 70ººCC
Inactivación Térmica de los Derivados de la α- y β-galactosidasas
β-galactosidasaα-galactosidasa
0
20
40
60
80
100
0 10 20 300
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6 7
Sepabeads-EB-IDA-Ni
Soluble
Tiempo (h)
Act
ivid
ad re
sidu
al, (
%)
Sepabeads-EB-IDA-Ni
Soluble