INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Pós-Graduação em Oncologia
Brunna Luiza Misael Alves
PAPEL DO ANTÍGENO LEUCOCITÁRIO HUMANO HA-G NA INFECÇÃO E PERSISTÊNCIA DO HPV EM UMA COORTE DE GESTANTES HIV+ DO RIO DE
JANEIRO
Orientador: Dra. Esmeralda Augusta Jardim Machado Soares
RIO DE JANEIRO
2014
Ministério da Saúde
Instituto Nacional de Câncer
Coordenação de Pós-graduação Stricto sensu
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INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Pós-Graduação em Oncologia
BRUNNA LUIZA MISAEL ALVES
Papel do antígeno leucocitário humano HLA-G na infecção e persistência do HPV
em uma coorte de gestantes HIV+ do Rio de Janeiro
Dissertação apresentada ao Instituto Nacional de Câncer como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Oncologia
Orientador: Dra. Esmeralda Augusta Jardim Machado Soares
RIO DE JANEIRO
2014
Ministério da Saúde
Instituto Nacional de Câncer
Coordenação de Pós-graduação Stricto sensu
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INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER
Pós-Graduação em Oncologia
AUTOR: Brunna Luiza Misael Alves
PAPEL DO ANTÍGENO LEUCOCITÁRIO HUMANO HLA-G NA INFE CÇÃO E PERSISTÊNCIA DO HPV EM UMA COORTE DE GESTANTES HIV+ DO RIO DE
JANEIRO
ORIENTADOR: Dra. Esmeralda Augusta Jardim Machado S oares
Aprovada em: 26 / 03 / 2014
EXAMINADORES:
Prof. Dr. Miguel Angelo Martins Moreira
Prof. Dr. André Felipe Andrade dos Santos
Prof. Dra. Sheila Coelho Soares Lima
Prof. Dra. Claudia Esther Alicia Rocio Hassan – Suplente I
Prof. Dra. Anke Bergmann – Suplente II
RIO DE JANEIRO
2014
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DEDICATÓRIA
À minha família e aos meus amigos por
sempre acreditarem e me incentivarem a
ir mais longe
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AGRADECIMENTOS
Aos pacientes que aceitaram participar do estudo;
Ao Dr. Hector Seuánez pelo espaço cedido no laboratório e aos pesquisadores e funcionários do laboratório de genética, por toda ajuda e pela manutenção da ordem no laboratório;
Ao CNPq, FAPERJ e INCT do Câncer pelo apoio financeiro;
À Dra. Esmeralda Soares, minha orientadora, pelos ensinamentos, pela confiança, por todas as oportunidades e principalmente por acreditar que somos capazes;
Ao Dr. Marcelo Soares por todos os conhecimentos transmitidos, pela atenção e cuidado e por nos incentivar a sermos sempre melhores no que fazemos;
À Dr. Anke Bergmann por todo o auxílio indispensável nas análises estatísticas, por toda a gentileza e disponibilidade durante todo o processo de finalização da dissertação, meus sinceros agradecimentos;
À Fabi Germano, Val, Mirela, Sabrina e Livinha por todo o carinho, por todas as aulas que recebemos e principalmente por ajudarem a transformar o INCA na nossa segunda casa;
À Adriana e Mariana por estarem sempre presentes e dispostas a ajudar, por permanecerem do meu lado na “semana mais corrida do século”, por todas as purificações, placas e por todo o consolo tão importantes em vários momentos;
À Juliana, por ser mãe e amiga, pela paciência de ensinar mil vezes o que precisasse desde a iniciação até hoje, por toda a ajuda e apoio, sempre cheios de carinho e atenção, enfim por estar ao meu lado em todos os momentos, sejam os de comemoração ou os de completa indecisão;
À Isabel, minha gêmea postiça, sempre cheia de carinho e compreensão, por tantas vezes me dar à mão e um ombro amigo, por confiar tanto em mim e por essa amizade tão bonita e sólida que construímos. Sei que a cada passo você estará lá para me apoiar e da mesma forma sempre te incentivarei a ir cada vez mais longe, enfim por ser a sempre querida Isabel Maria;
À Amannda por ser meu porto seguro carioca, por sempre me ensinar, me incentivar, me corrigir e principalmente estar ao meu lado. Todo o cuidado, todo o amor e toda a dedicação foram fundamentais nessa jornada.
À minha família, por serem meu alicerce, meu exemplo e minha força. Por todo o colo, por todas as palavras de conforto e por me darem a certeza de que tudo é possível, basta tentar. A confiança de que vocês estarão sempre comigo me faz ir muito mais longe. Estaremos sempre unidos independente de qualquer distância;
E a todos que, de alguma forma, contribuíram para que esta dissertação chegasse ao fim, muito obrigado.
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PAPEL DO ANTÍGENO LEUCOCITÁRIO HUMANO HLA-G NA INFE CÇÃO E
PERSISTÊNCIA DO HPV EM UMA COORTE DE GESTANTES HIV+ DO RIO DE JANEIRO
RESUMO -DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Brunna Luiza Misael Alves
Introdução: A persistência da infecção pelo papilomavírus humano (HPV) é uma etapa intermediária na progressão para a neoplasia intraepitelial cervical de alto grau e para o consecutivo câncer invasivo. Acredita-se que o sistema imune, a genética do hospedeiro e do vírus estejam entre os fatores não-comportamentais que determinam a aquisição e a persistência da infecção. Pacientes com o sistema imune comprometido apresentam lesões intra-epiteliais mais graves, com progressão mais rápida e com elevada taxa de recorrência, além de um risco aumentado para o câncer cervical. Através da expressão de HLAs-C, -E e –G, capazes de atuar como ligantes inibitórios de células “natural killers”, o vírus consegue estabelecer a infecção evitando a erradicação de células infectadas pelo sistema imune. Devido ao seu potencial em modular a resposta imune contra o HPV, estudos recentes vêm investigando polimorfismos nestes loci que possam estar associados com a susceptibilidade e a com a persistência do vírus no hospedeiro. Objetivo: Caracterizar molecularmente os alelos do HLA-G e analisar sua associação com a aquisição e a persistência do HPV em uma população de gestantes HIV+ do Rio de Janeiro. Relacionar os dados da citologia oncótica, genótipos encontrados e fatores de risco demográficos e clínicos com os alelos encontrados; além de correlacionar os alelos com a infecção por diferentes tipos, espécies, múltiplas infecções e persistência da infecção pelo HPV. Material e Métodos: Foram convidadas a participar do estudo 140 gestantes HIV+ em acompanhamento no Ambulatório de HIV/aids do Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira da UFRJ, Rio de Janeiro. A partir do DNA genômico já extraído, foi amplificado por PCR um fragmento compreendendo os éxons 2-4 do HLA-G. Esses produtos foram então sequenciados e analisados para a determinação dos alelos. Para a caracterização de alelos novos e determinação de certos casos de heterozigose foi realizada a clonagem, com posterior sequenciamento e análise dos produtos. Resultados: No total, 126 pacientes foram analisadas, totalizando 22 alelos que compõem 52 diferentes genótipos. A variedade de alelos observada é condizente com a alta diversidade genética associada à população brasileira. No total, encontramos 44% dos alelos já descritos na literatura. Foi possível evidenciar uma associação entre dos alelos G:01:03 e G:01:01:02 à proteção contra a infecção por espécies do grupo B e C, respectivamente. Os dados relativos à citologia oncótica permitiram observar um efeito protetor contra a ocorrência de lesões em pacientes com o alelo G:01:01:02. Além disso, pudemos evidenciar pela primeira vez a associação do alelo G:01:04 à persistência da lesão em pacientes com citologia alterada. Quanto aos parâmetros clínicos, foi possível correlacionar o alelo G:01:05N a contagem de cels CD4>=350 cels/mm3. Em conjunto, esses dados contribuem para uma melhor compreensão sobre o impacto dos alelos do HLA-G em mulheres HIV/HPV positivas a fim de esclarecer o papel desses alelos na susceptibilidade e persistência do vírus HPV, além do desfecho clinico e de parâmetros associados a ele.
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ROLE OF HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN HLA-G IN INFECTION AND PERSISTENCE OF HPV IN A COHORT OF HIV + PREGNANT WO MEN IN RIO
DE JANEIRO
ABSTRACT- MASTER THESIS Brunna Luiza Misael Alves
Introduction : Persistent infection with human papillomavirus (HPV) is an intermediate step in the progression to high grade cervical intraepithelial neoplasia and to invasive cancer. It is believed that the gene of HPV and the host immune system are among the non-behavioral factors that determine the acquisition and persistence of infection. Patients with compromised immune systems have more severe intraepithelial lesions, more rapidly progression and a high recurrence rate, beside an increased risk for cervical cancer. By expressing HLAs -C ,-E and –G, capable of acting as inhibitory ligands of "natural killers" cells, the virus can establish infection avoiding the elimination of infected cells by the immune system . Because of its potential to modulate the im4mune response against HPV, recent studies have investigated polymorphisms at these loci that may be associated with susceptibility and persistence of the virus in the host. Objective: To molecularly characterize the alleles of HLA-G and analyze its association with acquisition and persistence of HPV in a population of HIV + pregnant women in Rio de Janeiro. Relate data from cytology, genotypes found and demographic and clinical risk factors with alleles found, besides correlating alleles with infection with different types, species, multiple infections and persistence of HPV infection. Material and Methods: We invited to participate in the study 140 HIV+ pregnant women followed at the HIV/aids of the Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira-UFRJ, Rio de Janeiro. From already extracted genomic DNA, was amplified by PCR a fragment comprising exons 2-4 of HLA-G. These products were then sequenced and analyzed to determine the alleles. For characterization of novel alleles and determination of heterozygosis in certain cases the cloning was performed, with subsequent cloning and analysis of the product. Results: Altogether, 126 patients were analyzed, totaling 22 alleles that compound 52 different genotypes. The variety of alleles observed is consistent with the high genetic diversity associated with the Brazilian population. In total we found 44% of the alleles described in the literature. The results showed an association between alleles G:01:03 and G:01:01:02 to protection against infection by species of the group B and C, respectively. Data on cytology allowed to observe a protective effect against the occurrence of lesions in patients with the allele G:01:01:02. Additionally, we demonstrate for the first time the association of the allele G:01:04 and persistence of the lesion in patients with abnormal cytology. Regarding clinical parameters, it was possible to correlate the allele G:01:05N to cels CD4 count >=350 cels/mm3. Together, these data contribute to a better understanding of the impact of the alleles of HLA-G in HIV/HPV positive women in order to clarify the role of these alleles in susceptibility and persistence of HPV, in addition to clinical outcome and it associated parameters.
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ix
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS................................................................................................. XI
LISTA DE FIGURAS................................................................................................. XII
LISTA DE ABREVIATURAS..................................................................................... XIII
1. INTRODUÇÃO..................................................................................................... 15
1.1. Epidemiologia do Câncer de colo uterino e do Papilomavírus Humano....... 15
1.2. O papilomavírus humano.............................................................................. 16
1.2.1. Descrição, história natural e aspectos clínicos.......................................... 16
1.2.2. Partícula viral, genoma e ciclo replicativo.................................................. 18
1.2.3. Classificação molecular do HPV................................................................ 20
1.2.4. Classificação do HPV quanto ao potencial oncogênico............................. 21
1.2.5. Epidemiologia molecular do HPV.............................................................. 22
1.3. Evasão da Resposta Imunológica do HPV e do Câncer............................... 23
1.4. O sistema gênico HLA................................................................................... 24
1.4.1. Histórico do gene HLA-G........................................................................... 26
1.4.2. O gene HLA-G, proteínas, isoformas e funções........................................ 26
1.4.3. HLA-G e evasão da resposta imune.......................................................... 30
1.4.4. HLA-G e Polimorfismos associados ao HPV............................................. 32
1.4.5. HLA-G e polimorfismos associados ao HIV............................................... 34
1.5. Co-infecção HPV e HIV na gestação, persistência e câncer........................ 34
2. OBJETIVOS......................................................................................................... 36
3. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 37
3.1. Casuística...................................................................................................... 37
3.2. Análise Molecular.......................................................................................... 39
3.2.1. Amplificação por PCR dos genes que codificam os domínios α1, α2 e α3 do HLA-G................................................................................................................ 39
3.2.2. Purificação dos produtos de PCR.............................................................. 40
3.2.3. Sequenciamento das regiões genômicas de interesse............................. 41
x
3.2.4. Edição, Alinhamento das sequências e definição dos alelos.................... 42
3.2.5. Clonagem de heterozigotos e investigação de novos alelos..................... 42
3.3. Análises Estatísticas..................................................................................... 43
4. RESULTADOS..................................................................................................... 45
5. DISCUSSÃO........................................................................................................ 55
6. CONCLUSÕES.................................................................................................... 63
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 64
8. ANEXOS.............................................................................................................. 79
8.1. Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva................................................................................. 79
8.2. Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira...................................................................................... 80
8.3. Questionário aplicado as pacientes.............................................................. 81
8.4. Tabelas estatísticas....................................................................................... 82
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.2.2.1. Característica das regiões gênicas do Papilomavírus Humano e suas
principais funções no hospedeiro...............................................................................19
Tabela 3.1.1: Perfil clínico-epidemiológico da amostragem estudada (n=140).........38
Tabela 3.2.1.1: Descrição dos iniciadores utilizados ................................................40
Tabela 4.1 . Informações dos seis alelos novos de HLA-G encontrados no estudo ..47
Tabela 4.2. Genótipos encontrados nas pacientes do estudo (n=126).....................48
Tabela 4.3 . Correlação entre os alelos de HLA-G e a infecção por diferentes tipos de HPV...........................................................................................................................50
Tabela 4.4. Correlação entre os genótipos de HLA-G e a infecção pelo HPV..........52
Tabela 4.5: Correlação entre os alelos de HLA-G e a presença de alterações citológicas (LSIL e/ou HSIL) ......................................................................................54
Tabela 8.4.1: Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a persistência da infecção pelo HPV.....................................................................................................82
Tabela 8.4.2. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a infecção pelo HPV ..........................................................................................................................82
Tabela 8.4.3. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a ocorrência de casos de múltipla infecção pelo HPV ........................................................................83
Tabela 8.4.4. Correlação entre os alelos de HLA-G e os casos de melhora citológica..................................................................................................................................83
Tabela 8.4.5 . Correlação entre os alelos de HLA-G e pacientes com contagem de cels TCD4>= 350 cels/mm3.......................................................................................84
Tabela 8.4.6. Correlação entre os alelos de HLA-G e pacientes com carga viral do HIV indetectável durante o período de estudo ..........................................................84
Tabela 8.4.7. Correlação entre os alelos de HLA-G e infecção pelo HPV-16...........85
Tabela 8.4.8. Correlação entre os alelos de HLA-G e infecção persistente pelo HPV-16 ..............................................................................................................................85
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1.1 : Prevalência mundial do HPV em mulheres com citologia normal........15
Figura 1.2.1.1: Relação entre incidência da infecção cervical pelo HPV, pré-câncer e câncer. ......................................................................................................................17
Figura 1.2.2.1: Reconstrução de uma partícula semelhante a vírus (VLP) de HPV-11 e fotomicrografia eletrônica da estrutura do papilomavírus humano observado ao microscópio eletrônico de transmissão .....................................................................18
Figura 1.2.3.1: Árvore filogenética de 100 tipos de papilomavírus humano. ............21
Figura 1.2.5.1: Prevalência da infecção pelo HPV e prevalência dos cinco tipos de alto risco mais frequentes entre mulheres com citologia normal nas diferentes regiões do mundo......................................................................................................23
Figura 1.4.1: Mapa da região HLA ...........................................................................25
Figura 1.4.2.1: Processamento alternativo e isoformas do HLA-G...........................27
Figura 1.4.2.2: Nomenclatura dos alelos de HLA-G. ................................................28
Figura 1.4.2.3: Funções imunorreguladoras mediadas pelo HLA-G, células-alvo e receptores .................................................................................................................29
Figura 1.4.4.1: Polimorfismos do HLA-G associados à infecção pelo HPV..............33
Figura 3.2.1.1 : Organização genômica do HLA-G....................................................39
Figura 4.1. Alinhamento da sequência da paciente 110 com a referência do HLA-G, destacando o pico duplo na posição 1381 ................................................................45
Figura 4.2. Alinhamento contendo os clones obtidos de HLA-G da paciente 121....46
Figura 4.3 . Frequências alélicas dos variantes de HLA-G encontrados no estudo com valor superior a 3%............................................................................................49
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
°C- graus Celsius
CD8+- do inglês cluster of direferentiation 8 (grupamento de diferenciação 8)
CDC – NPIN- Centro de Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos, do inglês Center for Disease Control and Prevention- National Prevention Information Network-
DNA- ácido desoxirribonucléico
dNTP- trifosfato de desoxirribonucleotídeo
DST- doenças sexualmente transmissíveis
GM-CSF - fator estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos
HAART- Terapia Antirretroviral Altamente Ativa, do inglês High Active Antiretroviral Therapy
HIV- vírus da imunodeficiência humana
HLA – Antígeno Leucocitário Humano
HPV- Papiloma Vírus Humano (do inglês Human Papillomavirus)
HR-HPV- HPV de alto risco oncogênico (do inglês High Risk)
HSIL- lesões escamosas intraepiteliais de alto grau
HWV- do inglês human wart vírus
IARC- Internacional Agency for Research on Cancer
ICO- Institut Català d'Oncologia
ICTV- Comitê Internacional para a Taxonomia dos Vírus
IFN- Interferon
IL- Interleucina
ILT-2- Immunoglobuline-Like Transcripts
INCA- Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva
IPPMG- Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira
Kb- Quilobase
KV- Quilovolt
LB- Meio de cultura Luria-Bertani Broth
LIF- Fator inibitório de leucócitos
LR-HPV- HPV de baixo risco oncogênico (do inglês Low Risk)
xiv
LSIL- Lesões escamosas intraepiteliais de baixo grau
LT-α- Linfotoxina alfa
LT-β- Linfotoxina beta
MgCl2- cloreto de magnésio
Min- minuto
ml- mililitro
NaOH- hidróxido de sódio
NK- do ingles Natural Killer
OMS- Organização Mundial da Saúde
pb- pares de base
PBS- tampão fosfato salina
PCR- reação em cadeia da polimerase
rpm- rotação por minuto
seg- segundo
TCD4+- linfócitos T CD4 positivos
TCD8+- linfócitos T CD8 positivos
TH1- Linfócitos T helper perfil 1
Th2- Linfócitos T helper perfil 2
TNF-α- Fator de Necrose Tumoral α
UFRJ- Universidade Federal do Rio de Janeiro
WHO- World Health Organization
ηg- nanograma
µg- micrograma
µL- microlitro
µFD- Microfarad
ρmol- picomol
Ω- Ohm
15
1. INTRODUÇÃO
1.1. Epidemiologia do Câncer de colo uterino e do P apilomavírus Humano
O papilomavírus humano (HPV, do inglês Human Papillomavirus) é
atualmente uma das infecções virais sexualmente transmitida mais comuns em todo
o mundo. Estima-se que 11,4% das mulheres na população geral mundial estejam
infectadas pelo vírus (WHO/ICO, 2010) (Fig. 1.1.1). Estudos realizados com
mulheres com câncer cervical apontaram a presença do vírus em praticamente
100% dos casos (WALBOOMERS et al., 1999).
Figura 1.1.1: Prevalência mundial do HPV em mulheres com citologia normal (Modificado de
WHO/ICO, 2010).
O câncer do colo do útero é o segundo tipo de câncer mais comum na
população feminina mundial. Estima-se que em 2008, mais de 530 mil novos casos
(aproximadamente 86% desses em regiões menos desenvolvidas) e mais de 275 mil
óbitos ocorreram em todo o mundo devido a esse tipo de câncer (WHO/ICO, 2010).
Projeções globais estimam que em 2030 os novos casos de câncer cervical irão
aumentar para 770 mil (BOSCH et al., 2013).
No Brasil, esperam-se 15.590 novos casos para o ano de 2014, o que o torna
o terceiro em prevalência dos casos de câncer no país. Entretanto, tal distribuição é
bastante heterogênea: enquanto a taxa de incidência estimada para a região
Sudeste é de aproximadamente 10 casos para cada 100.000 mulheres no ano de
16
2014, na região Norte estimam-se 24 casos para cada 100.000 mulheres (INCA,
2014).
Diversos estudos têm mostrado que a infecção por HPV é significativamente
mais comum em mulheres infectadas pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV).
A prevalência da infecção pelo HPV nesta população varia de 44 a 98%
(GONCALVES et al., 1999; LEVI et al., 2002a; LEVI et al., 2004; CAMPOS et al.,
2005; LEIBENSON et al., 2011; LUZ et al., 2012; GARBUGLIA et al., 2012).
1.2. O papilomavírus humano
1.2.1. Descrição, história natural e aspectos clíni cos
A utilização da microscopia eletrônica – a partir da década de 1930 – e do
cultivo de células – na década de 1940 – possibilitou um grande avanço na virologia.
Em 1949, Maurice Strauss e outros pesquisadores da Escola de Medicina da
Universidade de Yale, usando um microscópio eletrônico, observaram partículas
semelhantes aos vírus em amostras retiradas de papilomas da pele (STRAUSS et al.,
1949). O vírus então foi denominado de HWV (do inglês human wart virus), mas
apenas em 1965 dois grupos caracterizaram o material genético viral (CRAWFORD,
1965; KLUG e FINCH, 1965). Em 1975, o Comitê Internacional para a Taxonomia
dos Vírus (ICTV – International Committee on Taxonomy of Viruses) decidiu chamá-
lo de HPV – papillomavírus humano. Em 1983, foram isolados, pelo grupo do
pesquisador Harald zur Hausen, dois importantes genótipos do HPV, a partir de
tecido de biopsias de câncer cervical (DURST et al., 1983; BOSHART et al., 1984).
O pico de infecção em homens e mulheres ocorre logo após a primeira
exposição sexual, o que faz com que as maiores taxas de prevalência da infecção
sejam associadas a indivíduos com menos de 25 anos, diminuindo ao longo do
tempo em diversas populações. Estima-se que aproximadamente 75% da população
sexualmente ativa entrará em contato com um ou mais tipos de HPV durante sua
vida (KOUTSKY, 1997; TROTTIER e FRANCO, 2006).
A transmissão do vírus ocorre através do contato do epitélio ou da mucosa
infectada com outra região mucosa ou epitelial. Além da transmissão sexual, pode
ocorrer a transmissão perinatal da infecção (BURCHELL et al., 2006). O HPV possui
17
um tropismo por células epiteliais cutâneas ou mucosas da camada basal, na qual
penetra através de microlesões presentes nessa região.
Diferente da maioria das infecções genito-urinárias, a infecção pelo HPV não
está usualmente associada a sintomas imediatos como dor, prurido, queimação e
corrimento vaginal (MAO et al., 2003). A maioria dos casos permanece sem
sintomas clínicos ou produzem lesões não aparentes (ZUR HAUSEN, 1996). A
forma clínica da infecção apresenta verrugas genitais, caracterizadas por sua
elevada transmissibilidade e recorrência comum (FERENCZY et al., 1985).
Estudos revelam que até 90% das infecções pelo HPV são eliminadas ou
suprimidas a níveis indetectáveis após 12 a 24 meses, enquanto os outros 10%
serão infecções persistentes, com um risco aumentado de desenvolvimento do
câncer cervical. Apenas 1,5% dos indivíduos com infecção persistente irão
desenvolver câncer cervical após vários anos da infecção (HO et al., 1998; FRANCO
et al., 1999; SCHIFFMAN et al., 2011) (Fig. 1.2.1.1).
Figura 1.2.1.1: Relação entre incidência da infecção cervical pelo HPV, pré-câncer e câncer. A curva
azul representa o pico de prevalência de infecções transitórias pelo HPV, que ocorre entre as
mulheres após o início da atividade sexual. O pico de prevalência das lesões pré-cancerosas (curva
verde) ocorre cerca de dez anos depois. O pico de prevalência do câncer do colo do útero (curva
vermelha) reflete o intervalo relativamente longo entre a lesão pré-cancerosa e o câncer (Modificado
de SCHIFFMAN et al., 2005).
As lesões escamosas intraepiteliais associadas ao vírus vêm sendo
18
classificadas desde 1988 pelo sistema de Bethesda, o qual introduziu duas
terminologias, LSIL (lesões escamosas intraepiteliais de baixo grau) e HSIL (lesões
escamosas intraepiteliais de alto grau), para classificar a diversidade de
anormalidades escamosas cervicais não-invasivas. A classificação foi mantida após
o Workshop de Bethesda de 2001. Essa divisão reflete evidências virológicas,
moleculares e clínicas de que LSIL é uma infecção pelo HPV geralmente eliminada
de 6 a 12 meses após o aparecimento, enquanto HSIL está mais frequentemente
associado à persistência viral e a um maior risco de progressão (ZUR HAUSEN,
2000).
Cabe destacar que a persistência de tipos de HPV de alto risco é necessária,
mas não suficiente para a progressão para o câncer (WALBOOMERS et al., 1999).
A persistência é definida como infecções detectadas mais de uma vez em um
intervalo de seis meses ou mais. Além dela, outros fatores estão envolvidos na
progressão da doença, como a variabilidade tanto do genoma do hospedeiro quanto
do DNA viral e co-fatores como o estilo de vida do indivíduo, o DNA viral circulante,
co-infecções por múltiplos tipos de HPV e co-infecções por outros agentes.
1.2.2. Partícula viral, genoma e ciclo replicativo
O papilomavírus pertence à família Papillomaviridae, composta por vírus não
envelopados, com cerca de 50-55 nm de diâmetro e capsídeo formado por duas
proteínas, L1 e L2, que se organizam em 72 subunidades (capsômeros) num arranjo
icosaédrico (Fig. 1.2.2.1).
Figura 1.2.2.1: Reconstrução de uma partícula semelhante a vírus (VLP) de HPV-11 feito em
colaboração com Merck & Co. disponível em http://nramm.scripps.edu/hpv-type-11-vlp/ (esquerda) e
fotomicrografia eletrônica da estrutura do papilomavírus humano observado ao microscópio eletrônico
de transmissão (direita), disponível em www.cdcnpin.org/scripts/std/std.asp#1e.
19
O HPV possui um DNA genômico circular de dupla fita de aproximadamente
8000 pb, que pode ser divido em três regiões: precoce ou E (early), responsável pela
patogenicidade (E1-E8); tardia ou L (late), que codifica as proteínas estruturais L1 e
L2; e uma região não-codificante, contendo elementos genéticos para replicação e
transcrição do genoma viral (Tabela 1.2.2.1) (SCHEFFNER et al., 1994; ZUR
HAUSEN, 2002; HOORY et al., 2008).
Tabela 1.2.2.1. Característica das regiões gênicas do Papilomavírus Humano e suas principais
funções no hospedeiro. Adaptado STANLEY et al., 2007.
Genes Função Principal E6 Ligação e degradação de p53, transformação celular
E7 Ligação a proteína retinoblastoma (pRB), desregulação da checagem do
ciclo em G1/S, transformação celular; coopera com E6 para imortalização celular
E1 Helicase, ATPase, essencial para replicação do DNA viral
E2 Regulação da transcrição viral. Liga-se a E1 para facilitar início da
replicação do DNA E3/E8 Função desconhecida
E4 Ligação e desarranjo da citoqueratina E5 Transformação celular, interação com receptores do fator de crescimento L1 L2
Proteína primária do capsídeo viral Proteína secundária do capsídeo viral
O genoma viral pode permanecer de duas formas dentro da célula, epissomal
e linear. A forma epissomal está presente nos estágios precoces da infecção, se
localiza dentro do núcleo da célula, sob a forma circular, e não está integrada ao
genoma. Já a forma linear é observada com frequência nas infecções por tipos de
HPV associados ao câncer cervical e representa o DNA do vírus integrado a um
cromossomo do hospedeiro (VILLA, 1997), através de uma quebra na região de E2
(DOORBAR, 2006).
O vírus infecta exclusivamente células epiteliais indiferenciadas da camada
basal (por serem as únicas células em divisão ativa) após essa ter sido exposta
através de feridas ou abrasões. O DNA viral é mantido na forma epissomal no
núcleo das células epiteliais basais com baixo número de cópias, variando de 50 a
100 cópias por célula (HEBNER e LAIMINS, 2006). Nessa fase inicial da infecção as
proteínas virais são expressas em baixos níveis e confinadas principalmente ao
núcleo (DOORBAR, 2005). A expressão desses genes é fortemente controlada
durante a diferenciação dos queratinócitos e aumenta apenas quando esses migram
20
para as camadas superiores do epitélio. Nessa etapa, a expressão de todos os
genes virais é induzida a fim de acelerar a replicação do genoma viral, aumentando
o número de cópias virais para milhares de cópias por célula (DOORBAR, 2006;
HEBNER e LAIMINS, 2006). O estágio final da infecção leva ao empacotamento dos
genomas amplificados em partículas infecciosas formadas pelas proteínas virais L1
e L2, que são liberadas na forma de capsídeos icosaédricos. Novas partículas virais
são produzidas dentro da camada superior do epitélio e eliminadas através do
processo natural de liberação das células epiteliais que ocorre ao fim do seu ciclo de
vida (DOORBAR, 2006).
1.2.3. Classificação molecular do HPV
Variações na sequência genômica do HPV permitem a classificação dos vírus
em diferentes níveis taxonômicos: gêneros, espécies e tipos; além disso, variações
no genoma completo ainda diferenciam os tipos em subtipos e variantes (DE
VILLIERS et al., 2004). O HPV é dividido em cinco gêneros: Alfapapillomavirus,
Betapapillomavirus, Gamapapillomavirus, Mupapillomavirus e Nupapillomavirus (Fig.
1.2.3.1). Diferentes gêneros possuem identidade menor que 60% entre as
sequências nucleotídicas do gene L1. O gênero Alfapapillomavirus é o principal
responsável pelas lesões em mucosas, incluindo as anogenitais, enquanto os
demais infectam principalmente regiões cutâneas (BERNARD et al., 2010).
Os gêneros ainda são divididos em espécies, que apresentam de 60 a 70%
de identidade no gene L1 (DE VILLIERS et al., 2004). Dois tipos diferem entre si
quando a sequência do gene L1, que é a mais conservada do genoma viral, possui
mais de 10% de divergência nessa região ( DE VILLIERS et al., 2004; BERNARD et
al., 2010). Atualmente, os vírus estão agrupados em 189 tipos identificados por
números de acordo com a ordem de sua descoberta, dos quais 151 afetam humanos
(BERNARD et al., 2010). Por sua vez, os subtipos são definidos considerando o
genoma completo com 2 a 10% de diferenças em relação a outro tipo. Por fim, o
HPV é dividido em variantes, que possuem menos de 2% de diferença no genoma
completo (DE VILLIERS et al., 2004). Poucos tipos são classificados em variantes, e
cada tipo possui uma nomenclatura de variantes diferente (CHEN et al., 2011).
21
Figura 1.2.3.1: Árvore filogenética de 100 tipos de papilomavírus humano. Em laranja estão
destacados os tipos de alto risco do gênero alfa (IARC, 2012)
1.2.4. Classificação do HPV quanto ao potencial onc ogênico
Uma outra forma de classificação do vírus se baseia no potencial oncogênico,
sendo este estabelecido considerando a frequência em diversos estudos
epidemiológicos dos diferentes tipos do HPV envolvidos no desenvolvimento do
câncer cervical. Foram definidos os grupos de HPV de alto risco ou HR-HPV (High
Risk) e de baixo risco ou LR-HPV (Low Risk).
Em 2003, Muñoz e colaboradores dividiram os vírus em alto risco (HPV 16,
22
18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, e 82), baixo risco (HPV 6, 11, 40,
42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81, e 89) e provável carcinogênico (HPV 26, 53 e 66)
(MUNOZ, 2003). Em 2007, Varnai e colaboradores sugeriram que os tipos HPV 32,
62, 74, 83, 84, 86, 87, 91 são de baixo risco e os tipos HPV 69, 30, 67, 34 de
provável alto risco (VARNAI et al., 2007). Atualmente, o IARC classifica as espécies
5, 6, 7, 9 e 11 do gênero Alphapapilomavirus em alto risco. Estas espécies incluem
os tipos descritos pelos outros autores como alto risco e provável alto risco
(BOUVARD et al., 2009).
1.2.5. Epidemiologia molecular do HPV
A prevalência dos tipos de HPV de alto risco varia nas diferentes regiões no
mundo. Entretanto, nas mulheres com citologia normal o HPV16 é o mais prevalente
em todo o mundo (Fig. 1.2.5.1) (IARC, 2012). Estudos apontam a presença dos
HPVs 16 e 18 em aproximadamente 50% e 20% dos casos de câncer cervical,
respectivamente (LI et al., 2011). Os cinco tipos de HPV mais prevalentes em todo
mundo são o HPV-16 (3,2%) seguido pelos HPVs 18 (1,4%), 52 (0,9%), 31 (0,8%) e
58 (0,7%) (BOSCH et al., 2013). No entanto, a freqüência dos tipos de HR-HPV
podem variar de acordo com fatores geográficos, demográficos e clínico-patológicos
(CLIFFORD et al., 2005; LI et al., 2011), além de haver uma grande influência dos
métodos utilizados para a detecção. Estudos têm mostrado uma prevalência maior
do tipo 16 no Brasil, embora a prevalência dos outros tipos de alto risco varie de
acordo com a região analisada (OLIVEIRA-SILVA et al., 2011; CASTRO et al., 2011;
FERNANDES et al., 2011; MIRANDA et al., 2013).
23
Figura 1.2.5.1: Prevalência da infecção pelo HPV e prevalência dos cinco tipos de alto risco mais
frequentes entre mulheres com citologia normal nas diferentes regiões do mundo (Modificado de
IARC, 2012).
1.3. Evasão da Resposta Imunológica do HPV e do Cân cer
A resposta imune do hospedeiro é fator determinante no processo de
evolução da infecção viral e no desenvolvimento neoplásico. A maioria das infecções
pelo HPV é eliminada dentro de um ano, como resultado da resposta imune mediada
por células. Dessa forma, o vírus não persiste no organismo tempo suficiente para
desregular a expressão gênica (DOORBAR et al., 2012).
Grande parte dos indivíduos com lesões benignas montam uma resposta
imune efetiva mediada por células que induz a regressão da lesão. Essa regressão
está histologicamente acompanhada por uma resposta com perfil Th1 dos linfócitos
TCD4+ (MONNIER-BENOIT et al., 2006). A falha no desenvolvimento de uma
resposta imune efetiva capaz de eliminar ou controlar a infecção resulta na
persistência, e nos casos dos tipos de HPV oncôgenicos, no aumento do risco de
progressão para HSIL e câncer cervical.
Contribui também para o escape imune do HPV o fato de que o ciclo
replicativo viral é exclusivamente intra-epitelial, Assim, não há viremia, processos de
citólise ou morte celular induzidos pelo vírus. Por fim, os processos de replicação e
liberação viral não estão associados à inflamação (STANLEY, 2012). A natureza
não-lítica da infecção pelo HPV limita a produção de antígenos virais que são
24
processados e apresentados ao sistema imune adaptativo. As proteínas codificadas
pelo vírus, em sua maioria, não são secretadas através da célula infectada. As
proteínas E são expressas em níveis baixos e, sobretudo, no núcleo celular, e a
produção das proteínas do capsídeo, altamente imunogênicas, é limitada à camada
mais diferenciada e liberada ao epitélio, distante das células circulantes do sistema
imune.
As células tumorais são capazes de escapar da imunovigilância do sistema
imune por diversas alternativas. Entre elas está a habilidade de alguns tumores em
diminuir a expressão de antígenos de HLA (Human Leukocyte Antigen) de classe I, o
que permite ao tumor evitar o reconhecimento e destruição por células TCD8+, mas
tornando-o susceptível à lise mediada por células NK (do inglês natural killer). As
proteínas do sistema HLA são fundamentais para a resposta imune adaptativa
mediada por células T porque são essenciais à apresentação dos antígenos. Um
dos exemplos é o efeito da proteína E5 do HPV, que causa a diminuição da
expressão de HLA-A e B na superfície das células, mas não interfere na expressão
dos ligantes inibidores de células NK, como o HLA-C, E e G (ASHRAFI et al., 2005).
Já a proteína E7 dos HPV 16 e 18 é capaz de reprimir o gene promotor da cadeia
pesada do HLA de classe I, levando a uma perda do reconhecimento de células
infectadas por HPV pelos linfócitos T citotóxicos (MEGRET et al., 2007).
1.4. O sistema gênico HLA
O primeiro sistema gênico caracterizado como Complexo Principal de
Histocompatibilidade foi descrito em camundongos, e recebeu esta denominação por
sua constatada influência nos transplantes de tecidos nesses animais. Por sua vez,
o sistema HLA foi descoberto na década de 50 quando Dausset, Payne e van Rood
realizavam estudos sorológicos em pacientes politransfundidos e observaram a
presença de anticorpos leucoaglutinantes. Esse sistema apresenta um elevado
polimorfismo nas populações e está situado num segmento de aproximadamente
4Mb do braço curto do cromossomo 6 humano. Seus genes e suas proteínas podem
ser agrupados em três classes de acordo com a estrutura e função: classe I, classe
II e classe III (Fig. 1.4.1).
25
Figura 1.4.1: Mapa da região HLA (banda 6p21.3 do cromossomo 6). Os genes e pseudogenes não-
clássicos classe I estão representados por retângulos não preenchidos.
A região de HLA de classe I pode ser subdividida em moléculas de HLA
clássicas (HLA-Ia) e não-clássicas (HLA-Ib). Seus receptores interagem com
linfócitos TCD8+ que detectam alterações de expressão nas células que podem
ocorrer devido a infecções ou durante o desenvolvimento de células tumorais
(GERAGHTY et al., 1987). As moléculas HLA de classe Ia, que incluem os genes
HLA-A, -B e -C, são expressas na superfície de quase todas as células nucleadas e
possuem um alto grau de polimorfismo, já que devem ser capazes de apresentar
uma grande diversidade de peptídeos antigênicos intracelulares para linfócitos T
citotóxicos. Já as moléculas Ib incluem os genes HLA-E, -F, -G que ao contrário dos
clássicos, são pouco polimórficos e possuem distribuição limitada a certos tecidos.
Há também os loci HLA-H, -J, -K e –L, que constituem pseudogenes (HUGHES,
1995).
As moléculas de classe II são codificadas por diferentes loci e mapeadas nas
sub-regiões HLA-DR, -DQ, -DP. Sua expressão é restrita às células apresentadoras
de antígenos (APC), células endoteliais e linfócitos T ativados. Elas interagem com
linfócitos TCD4+ para a apresentação de antígenos exógenos (MURPHY et al.,
2010).
A região de classe III, localizada entre as regiões de classe I e II, possui a
maior densidade gênica das três regiões de HLA, contendo um gene a cada 14.500
bases (SHIINA et al., 2004). Destaca-se o seu papel na codificação de proteínas
solúveis importantes na modulação e regulação da resposta imunitária. Essa região
abriga genes atuantes no processo de ativação do sistema complemento (Bf, C2,
26
C4A, C4B) e genes da 21-hidroxilase, da hemocromatose, TNF e LT-α, que
codificam as citocinas TNF-α e LT-β (antigo TNF-β) respectivamente, entre outros
(XIE et al., 2003).
1.4.1. Histórico do gene HLA-G
O gene HLA-G foi primeiramente descrito por GERAGHTY et al. (1987),
quando realizavam uma análise de DNA genômico que revelou genes similares aos
bem conhecidos genes de HLA classe Ia (GERAGHTY et al., 1987). Ele descreveu o
gene e lhe deu o nome de HLA-6.0 (por estar localizado no interior de um fragmento
de restrição gerado pela enzima de restrição Hind III de aproximadamente 6.0 Kb).
Estudos de Loke, juntamente com Ellis, Kovats e seus respectivos colaboradores
foram os primeiros a identificar a molécula de HLA-G em citotrofoblastos extravilosos
(ELLIS et al., 1990; GRABOWSKA et al., 1990; KOVATS et al., 1990). Somente em
1990 foi possível unificar a nomenclatura do HLA-6.0 para HLA-G.
1.4.2. O gene HLA-G, proteínas, isoformas e funções
O HLA-G é um gene não-clássico de classe Ib, composto por oito éxons, sete
íntrons e uma região 3´ não traduzida. O éxon 1 é responsável por codificar o
peptídeo-sinal, os éxons 2, 3 e 4 codificam os domínios extracelulares de ligação α1,
α2 e α3, respectivamente, o éxon 5 codifica a região transmembrana e os éxons 6, 7
e 8 codificam o domínio citoplasmático da molécula. Devido a um códon de término
de leitura no éxon 6, a cauda citoplasmática apresenta apenas 6 aminoácidos
enquanto a cauda das moléculas de classe Ia apresenta aproximadamente 30.
Devido ao códon de terminação, o éxon 7 está sempre ausente do RNAm maduro e
o éxon 8 não é traduzido.
A sequência de aminoácidos da proteína codificada pelo gene HLA-G possui
86% de identidade com as proteínas codificadas pelos genes HLA-A, -B, e -C
(O'CALLAGHAN e BELL, 1998). Mais especificamente, a molécula de HLA-G exibe
um alto grau de similaridade com a molécula funcional HLA-A2 (todas as posições
relevantes para interação com b2-microglobulina - uma condição básica para a
manutenção da conformação nativa das moléculas HLA classe I - são conservadas
entre as duas sequências) (VAN DER VEN et al., 2000).
27
O processamento alternativo do RNAm origina sete isoformas diferentes da
proteína, sendo HLA-G1, -G2, -G3 e -G4 ligadas à membrana, e -G5, -G6, e -G7
solúveis. O HLA-G1 é a isoforma completa, contendo uma estrutura similar às
moléculas de HLA clássicas ligadas à membrana e associadas a β2-microglobulina.
A forma solúvel ocorre devido à presença de um códon de término de leitura nos
íntrons 2 (para –G7) e 4 (para –G5 e –G6), o qual impede a tradução do domínio
transmembrana da proteína (codificada pelo éxon 5) (BAINBRIDGE et al., 2001;
CAROSELLA et al., 2001; LILA et al., 2002). Dependendo do tipo de célula e
condição fisiopatológica, diferentes isoformas de HLA-G são produzidas (LILA et al.,
2000) (Fig. 1.4.2.1). Entre as isoformas, o HLA-G1 e sua forma solúvel G5 são as
mais frequentemente observadas.
Figura 1.4.2.1: Processamento alternativo e isoformas do HLA-G. Adaptado de BAINBRIDGE et al.,
2001.
Diferente dos genes clássicos Ia que exibem centenas de alelos, o lócus HLA-
G possui um polimorfismo discreto, com 50 alelos descritos até o momento,
responsáveis por codificar 16 distintas proteínas funcionais e 2 alelos nulos (IMGT –
International Immunogenetics Information Systems, http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla,
acessado em 17 de janeiro de 2014). Atualmente, o nome dos alelos deve conter 4,
28
6 ou 8 dígitos. Os primeiros dois dígitos se referem à família do alelo e o 3º e o 4º se
referem à ordem de descrição dos alelos (Fig. 1.4.2.2). Portanto, um alelo que difere
nos primeiros quatro dígitos deve ter ao menos uma substituição não-sinônima, ou
seja, uma modificação na sequência dos aminoácidos que define a proteína.
Figura 1.4.2.2: Nomenclatura dos alelos de HLA-G. Padronização da nomenclatura dos alelos de
acordo com o WHO Nomenclature Committee for Factors of the HLA System (adaptado de STEVEN,
2012 )
A expressão do HLA-G é ativada in vivo através de estímulos ambientais,
como condições de stress (como a hipóxia existente no microambiente adjacente a
tumores de rápido crescimento), citocinas e variações epigenéticas (MENIER et al.,
2009). Além disso, essa expressão é restrita a alguns tecidos e ocorre
principalmente em órgãos imunoprivilegiados, em alguns órgãos durante o
desenvolvimento e em células da linhagem hematopoiética, como placenta, timo,
córnea, pâncreas, eritroblastos e células-tronco mesenquimais. Entretanto, o
aumento da expressão pode ser induzido durante o curso de inúmeras patologias e
condições, como câncer, transplante, esclerose múltipla, doenças inflamatórias e
infecções virais (PAUL et al., 1998; LILA et al., 2000; ARACTINGI et al., 2001;
LOZANO et al., 2002; LAFON et al., 2005; WIENDL et al., 2005).
Em relação à sua função, o HLA-G exerce suas propriedades
imunossupressivas devido à sua capacidade de se ligar a receptores inibitórios
expressos em diferentes células imunes, incluindo ILT-2 (Immunoglobuline-Like
Transcript) expresso por células mielóides e linfóides, ILT-4 expresso apenas por
células mielóides e KIR2DL4, presente apenas em células NK (COLONNA et al.,
1998; RAJAGOPALAN e LONG, 1999). Através da ligação a esses receptores, o
HLA-G inibe a citotoxicidade das células TCD8+ e NK, além de inibir a resposta
29
alogênica proliferativa das células TCD4+. Recentemente, estudos também
demonstraram a capacidade das moléculas de HLA-G solúveis em diminuir a
expressão dos receptores de quimiocina em células T, o que leva ao
comprometimento da quimiotaxia. Outra forma de indução de células supressoras T
e NK se refere a uma propriedade adquirida temporariamente por essas células
através da transferência de fragmentos de membrana de células apresentadoras de
antígenos ou de células tumorais contendo o HLA-G, processo denominado
trogocitose (LE MAOULT et al., 2004). Além disso, o HLA-G é capaz de induzir a
apoptose de células TC8+ e NK e afetar a função das células dendríticas, em
particular sua maturação, migração, apresentação de antígenos e o processo de
comunicação entre as células T e NK (CAROSELLA et al., 2008a; LOUSTAU et al.,
2013). Todas as funções estão sintetizadas na figura 1.4.2.3.
Figura 1.4.2.3: Funções imunorreguladoras mediadas pelo HLA-G, células-alvo e receptores
(adaptado de Veit et al., 2010).
Várias citocinas podem induzir a expressão de HLA-G, tais como GM-CSF
(fator estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos), interleucina (IL)-10,
Interferons (IFNs) e LIF (fator inibitório de leucócitos) (CAROSELLA e DAUSSET,
2003; ROUAS-FREISS et al., 2007). Tanto IFN-β como IFN-γ parecem reforçar a
30
expressão de HLA-G na superfície celular, como demonstrado in vitro e mais
recentemente in vivo (CAROSELLA e DAUSSET, 2003; MITSDOERFFER et al.,
2005).
1.4.3. HLA-G e evasão da resposta imune
Diversas linhas de pesquisa tem evidenciado o papel do HLA-G como uma
molécula tolerogênica, desempenhando um importante papel na supressão da
resposta imune. O HLA-G está envolvido na patogenia de diversas doenças
humanas, como as infecções virais crônicas (HIV, citomegalovírus, hepatite C e
hepatite B), rejeição a transplante de órgãos sólidos (rim e coração), neoplasias e
doenças autoimunes (artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose
sistêmica e diabetes mellitus tipo I) (CAROSELLA et al., 2008a, CAROSELLA et al.,
2008b).
De maneira geral, todos os segmentos da molécula estão envolvidos nesse
processo. A cauda citoplasmática curta é responsável por reter o HLA-G por um
tempo maior no retículo endoplasmático e prolongar a meia-vida das moléculas na
superfície celular devido à ausência de um domínio ativador da endocitose (PARK et
al., 2001), permitindo assim múltiplas interações com células do sistema imune. Já
os domínios extracelulares interagem com os receptores inibitórios de leucócitos,
incluindo CD8, LILRB1, LILRB2 e KIR2DL4 (GAO e JAKOBSEN, 2000; SHIROISHI
et al., 2006).
Apesar dos efeitos inibitórios do HLA-G em células citotóxicas exibindo CD8
em sua superfície, outras interações entre a molécula de HLA-G e as células CD8
merecem atenção. Moléculas de HLA-G solúveis podem induzir em taxas similares a
apoptose em linfócitos TCD8 ativados e em células NK CD8+ (com a ausência do
receptor de células T) através do aumento da produção de Fas e da interação
Fas/FasL (CONTINI et al., 2003). Em condições nas quais as moléculas solúveis de
HLA-G estão presentes em elevadas quantidades, incluindo gravidez, alguns
tumores e transplantes com bom prognóstico, esse mecanismo pode representar um
efeito imunomodulatório adicional do HLA-G (DONADI et al., 2011).
Outra estratégia potente das células tumorais para induzir um ambiente
imunossupressor e escapar do controle imune, consiste na indução pelo HLA-G do
aumento da frequência das células T supressoras regulatórias (Tregs) e células
31
supressoras mielóides (MDSCs), assim como a mudança do perfil dos linfócitos T de
Th1/Th17 para Th2 (MORANDI et al., 2010; AGAUGUE et al., 2011, AMIOT et al.,
2011). As células Treg ou células T supressoras são uma subpopulação de células T
capazes de modular o sistema imune, manter a tolerância a antígenos próprios e
anular as doenças autoimunes. A mudança para o perfil Th2 é caracterizada pela
secreção de IL-10 e associada com a progressão das lesões pré-malignas para o
câncer (BAIS et al., 2007, CLERICI et al., 1997). Essa citocina contribui na
interferência da resposta imune antitumoral tanto através da diminuição da
expressão de HLA classe I quanto pelo aumento da expressão de HLA-G.
Por mecanismos indiretos, o HLA-G também induz a expressão do HLA-E,
outro gene HLA classe Ib capaz de inibir a atividade de células T e NK através da
interação com o receptor inibitório CD94/NKG2A (PENDE et al., 1997).
Dependendo da presença de fatores no microambiente que podem aumentar
a produção do HLA-G e da composição genética do indivíduo, a expressão do HLA-
G pode ser benéfica ou prejudicial, estando sujeito ao ajuste da reposta imune. Essa
expressão pode ser prejudicial em condições patológicas onde uma resposta imune
vigorosa e permanente são desejáveis, como no caso das infecções virais crônicas e
do câncer. Em contraste, quando uma resposta imune vigorosa é indesejável, a
expressão do HLA-G se mostra benéfica, como no caso de doenças autoimunes e
no transplante alogênico de organismos e tecidos (DONADI et al., 2011).
A proteína do HLA-G tem sido encontrada em praticamente todos os tipos de
câncer, independente de sua origem celular (ectodérmica, mesodérmica ou
mesenquimal). A proporção de tumores expressando HLA-G varia de 10 a 95%,
incluindo tumores sólidos e hematopoiéticos. O exame de fluidos biológicos de
pacientes com câncer permitiu observar que altos níveis da forma solúvel do HLA-G
estão associados a estágios mais avançados da doença, lesões de alto grau na
histologia e pior prognóstico (MENIER et al., 2009).
Recentes estudos sobre o comportamento da molécula HLA-G em lesões
cervicais associadas ao HPV demonstraram baixa expressão de HLA-G associado
ao grau de diferenciação da neoplasia intra-epitelial cervical (GONCALVES et al.,
2008; GUIMARAES et al., 2010). Dentre os diferentes graus histológicos, a
expressão da molécula HLA-G aparece aumentada nas lesões benignas, lesões pré-
32
malignas e carcinomas in situ de laringe, e diminui progressivamente entre as lesões
malignas (SILVA-ALVES, 2009).
1.4.4. HLA-G e Polimorfismos associados ao HPV
O grau de polimorfismo do HLA-G só é considerado baixo quando comparado
às moléculas clássicas de HLA. Os polimorfismos presentes tanto na região
codificante quanto na região 3’ não traduzida (3’UTR) podem afetar todas as funções
biológicas do gene. A variabilidade nucleotídica na região promotora e 3’UTR pode
influenciar os níveis de HLA-G através da modificação da afinidade entre a
sequência-alvo do gene e os fatores de transcrição ou fatores pós-transcricionais.
Da mesma maneira, a variabilidade na região codificante pode produzir mudanças
conformacionais na molécula, o que pode modificar suas principais funções como as
interações com os receptores celulares, a produção de diferentes isoformas, a
modulação da resposta imune, as características de polimerização e a habilidade de
formar peptídeos duplos.
Dado o potencial do HLA-G de modular a resposta imune contra o HPV,
diversos trabalhos vêm investigando polimorfismos nestes loci que possam estar
associados à susceptibilidade e à persistência do HPV no hospedeiro. Um estudo
recente conduzido em Montreal observou a associação dos alelos HLA-G*01:01:02 e
HLA-G*01:01:08 com o risco aumentado de infecção pelo HPV-16 e por alguns tipos
do HPV das espécies 1, 8, 10 e 13. O mesmo estudo associou também os alelos de
HLA-G*01:01:02 e G*01:03 com a persistência da infecção por HPV-16 e pelas
espécies 2, 3, 4 e 15 (FERGUSON et al., 2011). Em um trabalho publicado
posteriormente, esse mesmo grupo também encontrou uma associação entre os
genótipos homozigotos G*01:01:02 e G*01:06 e o aumento do risco do câncer
cervical invasivo, e de portadores do alelo G*01:01:01 a uma redução no risco do
câncer invasivo (FERGUSON et al., 2012). Outras associações entre polimorfismos
no HLA-G e a história natural da infecção pelo HPV foram identificadas por Metcalfe
e colaboradores, como a associação entre o HLA-G*01:01:02 e a diminuição do
risco de infecção por qualquer tipo de HPV, do alelo G*01:01:01 (incluindo genótipos
heterozigotos) ao aumento do risco de infecção pelas espécies 1, 3, 8, 10, 13 e 15.
Além disso, o genótipo homozigoto G*01:04:01 foi associado a uma redução do risco
de infecção pelas espécies 3 e 15. Entretanto, diferente dos estudos de Ferguson e
colaboradores, nenhuma associação foi encontrada entre os alelos de HLA-G e a
33
persistência. Por fim, foi observada uma correlação entre o alelo G*0:01:01 e o
aumento do risco de múltiplas infecções, e entre o alelo G*01;01:02 e genótipo
homozigoto G*01:04:01 e a diminuição do risco de múltiplas infecções quando
comparado a mulheres HPV-negativas (METCALFE et al., 2013).
Figura 1.4.4.1: Polimorfismos do HLA-G associados à infecção pelo HPV (com dados extraídos de
FERGUSON et al., 2011; FERGUSON et al., 2012; METCALFE et al., 2013)
34
1.4.5. HLA-G e polimorfismos associados ao HIV
O vírus da imunodeficiência humana (HIV) desenvolveu inúmeros
mecanismos de escape do sistema imune, incluindo um mecanismo dependente da
proteína viral Nef, responsável pela diminuição da expressão de moléculas de HLA
classe I, de forma a evitar o reconhecimento das células infectadas por linfócitos
TCD8+ (COLLINS et al., 1998). Entretanto, a expressão de HLA-C, -G e –E
permanece inalterada para inibir a resposta inata executada pelas células NK
(COHEN et al., 1999; PIZZATO et al., 2004). Além disso, a proteína gp41 do
envelope viral aumenta a síntese de IL-10 por monócitos, o que leva ao aumento da
expressão das moléculas de HLA-G a fim de controlar a resposta imune e facilitar a
infecção (MATTE et al., 2004).
Estudos na região codificante do HLA-G encontraram uma associação entre o
alelo G*01:01:01 e a resistência a infecção pelo HIV em mulheres, e entre o alelo
G*01:04:04 e a susceptibilidade à infecção (TURK et al., 2013). Além disso, Matte e
colaboradores encontraram uma correlação do alelo G*01:05N (alelo nulo que
impede a produção de uma molécula de HLA-G funcional) com a proteção contra a
infecção pelo HIV (MATTE et al., 2004; LAJOIE et al., 2006), diferente do encontrado
por Segat e colaboradores, que mostraram um significativo aumento na frequência
desse alelo em mulheres HIV+ em relação a controles HIV- (SEGAT et al., 2010).
Uma associação entre o alelo G*01:01:08 e o aumento do risco de infecção pelo HIV
também foi encontrada (MATTE et al., 2004).
1.5. Co-infecção HPV e HIV na gestação, persistênci a e câncer
A frequência da infecção genital pelo HPV, bem como a progressão para
lesões displásicas ou mesmo o câncer, é mais comumente observada em mulheres
imunodeficientes (como as pacientes com aids e gestantes), quando comparadas a
mulheres imunocompetentes (PANTANOWITZ, 2010). Uma maior presença de tipos
de alto risco e de infecções por múltiplos tipos de HPV também pode ser observada
nesta população (GRINSZTEJN et al., 2009; MACLEOD et al., 2011; GARBUGLIA et
al., 2012; LUZ et al., 2012). Além disso, a imunossupressão causada pelo HIV
aumenta a persistência do HPV, aumentando o risco para lesões cervicais
(VERNON et al., 1994). A taxa de múltipla infecção nesta população varia de 44 a
35
79% (LEVI et al., 2002b; LEVI et al., 2004; LUQUE et al., 2006; GARBUGLIA et al.,
2012).
A gestação também é uma condição que está associada ao aumento da
prevalência de HPV, principalmente de alto risco (FIFE et al., 1996; HERNANDEZ-
GIRON et al., 2005). Além disso, mulheres gestantes têm uma rápida progressão da
lesão intraepitelial ao carcinoma durante a gestação e após o parto (ARMBRUSTER-
MORAES et al., 2000; PALLE et al., 2000).
Embora já esteja bem estabelecido que indivíduos HIV+ possuam um maior
risco de desenvolvimento de neoplasias anogenitais associadas ao HPV, os
mecanismos dessa interação ainda são pouco entendidos. Acredita-se que o HIV
possa interagir diretamente com o HPV, variando de acordo com o estágio da
doença neoplásica (PALEFSKY, 2003).
Considerando mulheres e homens infectados pelo HIV, existe uma correlação
entre a quantidade de DNA e a prevalência da infecção pelo HPV e baixos níveis de
células TCD4+ (< 500/mm3, com risco ainda maior entre indivíduos com contagens
menores de 200/mm3), indicando que a resposta imune pode exercer um importante
papel no controle da replicação do HPV (SUN et al., 1997; MOSCICKI et al., 2000,
PALEFSKY, 2003). Além disso, nessa população, baixas contagens de CD4+ estão
associados a um aumento no número de tipos de HPV presentes em amostras
cervicais (PALEFSKY et al., 1999).
Quanto ao uso da terapia antirretroviral altamente ativa (HAART- do inglês
High Active Antiretroviral Therapy) em indivíduos co-infectados, as análises
examinando o efeito do tratamento na história natural das lesões cervicais tem
obtido diferentes resultados, mostrando desde efeitos benéficos até a ausência de
efeitos (HEARD et al., 1998; LILLO et al., 2001; MINKOFF et al., 2001). Entretanto,
há um consenso de que mulheres com lesões cervicais em estágio mais avançado
falham na regressão das lesões mesmo após o início da HAART, inclusive em
pacientes com aumento nos níveis de células TCD4+ (HEARD et al., 2002).
Considerando seu potencial em modular a resposta imune contra o HPV, a
diversidade populacional encontrada no Brasil e a pequena quantidade de estudos
correlacionando a infecção pelo HPV ao HLA-G, nós conduzimos esse estudo
envolvendo gestantes HIV+ acompanhadas no Instituto de Puericultura e Pediatria
Martagão Gesteira da UFRJ, Rio de Janeiro, a fim de correlacionar os alelos de
HLA-G à susceptibilidade a infecção e persistência do HPV.
36
2. OBJETIVOS
Objetivo principal:
Analisar a associação dos alelos do HLA-G com a aquisição e a persistência
do HPV em uma população de gestantes HIV+ do Rio de Janeiro.
Objetivos secundários:
• Determinar os alelos de HLA-G da coorte de pacientes gestantes HIV+ em
acompanhamento no Programa de Assistência Integral à Gestante HIV
positiva do Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira da UFRJ,
Rio de Janeiro.
• Correlacionar os alelos de HLA-G com infecção por diferentes tipos, espécies,
múltiplas infecções, evolução clínica e persistência da infecção pelo HPV.
• Relacionar os dados da citologia oncótica, fatores de risco e aspectos clínicos
com os alelos encontrados.
37
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Casuística
Este é um estudo longitudinal onde foram incluídas pacientes em
acompanhamento no Programa de Assistência Integral à Gestante HIV positiva do
Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira (IPPMG) da UFRJ, Rio de
Janeiro. O projeto foi aprovado pelos Comitês de Ética em Pesquisa do Instituto
Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva (INCA) e do IPPMG (Anexos I e
II).
As pacientes foram convidadas a participar do estudo durante suas visitas
regulares de acompanhamento pré-natal no período entre abril de 2009 e maio de
2011 e foram acompanhadas por ao menos um ano. As pacientes incluídas no
estudo assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, e para as
pacientes menores de 18 anos foi ainda requerida à assinatura do responsável. Os
critérios de inclusão estabelecidos foram: ser infectada pelo HIV e estar no início do
segundo trimestre de gestação.
Cada paciente teve uma amostra de esfregaço cérvico-vaginal coletada no
ambulatório do IPPMG no início do segundo trimestre de gestação e seis meses
após o parto. As amostras foram acondicionadas em 1 ml de salina tamponada com
fosfato (PBS). Na primeira consulta um questionário com dados demográficos e
clínicos foi preenchido para cada gestante, incluindo: idade da menarca, idade da
primeira relação sexual, número de parceiros sexuais, uso de métodos
contraceptivos, paridade, doenças sexualmente transmissíveis (DST) prévias e
tabagismo (Tabela 3.1.1 e Anexo III).
38
Tabela 3.1.1: Perfil clínico-epidemiológico da amostragem estudada (n=140)
Dados epidemiológicos Mediana de idade (anos) 27 Mediana da menarca (anos) 12 Mediana da idade da primeira relação sexual (anos)
15
Alto risco de exposição ao HPV * (n)
116
Nº de parceiros sexuais ao longo da vida (n) 1 a 3 47 4 ou mais 90 Profissionais do sexo 2 Sem resposta 1
Status HPV+ (nº pacientes HPV+/ nº total analisado) No início do primeiro trimestre da gestação
80% (110/138)
Um ano após o parto 39% (38/97) * Alto risco de exposição ao HPV definido pela idade da primeira relação sexual igual
ou menor que 17 anos, ou mais de cinco parceiros sexuais ao longo da vida.
Informações relacionadas à infecção pelo HIV como contagem de células T
CD4+, carga viral e exames para detecção de outras DST foram obtidas na UFRJ
durante a rotina de acompanhamento das gestantes. A citologia foi classificada de
acordo com o sistema de Bethesda 2001 (SOLOMON et al., 2002). As amostras
coletadas foram enviadas para o Programa de Genética do Centro de Pesquisas do
INCA, e armazenadas em freezer a -80ºC para a realização dos estudos
moleculares.
O DNA genômico destas pacientes já havia sido extraído anteriormente para
outro estudo desenvolvido pelo nosso grupo durante o projeto de mestrado da aluna
Juliana Domett Siqueira. A definição do status da infecção pelo HPV, bem como o
tipo viral e a existência de múltiplas infecções já foram analisados e publicados
(MEYRELLES et al., 2013).
Das 138 amostras coletadas no início do segundo trimestre da gestação, 80%
(n=110) eram HPV+. Das 97 amostras coletadas um ano após o parto, 39% (n=38)
estavam infectadas pelo vírus. Com isso, puderam ser observados 13 casos de
novas infecções (quando o HPV da primeira e da segunda amostra eram de tipos
39
diferentes) e 32 casos de persistência tipo-específica (definida como a manutenção
da infecção com o mesmo tipo de HPV nos dois pontos analisados). A partir do
questionário com dados demográficos e clínicos, foi definido um subgrupo composto
por mulheres com alto risco de exposição ao vírus HPV, definido pela idade da
primeira relação sexual igual ou menor que 17 anos e/ou que tiveram mais de cinco
parceiros sexuais ao longo da vida.
3.2. Análise Molecular
3.2.1. Amplificação por PCR dos genes que codificam os domínios α1,
α2 e α3 do HLA-G
A região genômica de interesse foi amplificada pela técnica de reação em
cadeia da polimerase (PCR), incluindo os éxons 2, 3 e 4 do HLA-G, totalizando um
fragmento de aproximadamente 1.718 pb. A reação de PCR utilizou iniciadores
específicos como descrito por Fegurson e colaboradores (FERGUSON et al., 2011;
Tabela 3.2.1.1) e esquematizados na figura 3.2.1.1.
Figura 3.2.1.1 : Organização genômica do HLA-G, destacando-se a região de anelamento dos
iniciadores utilizados. Os nomes de iniciadores terminados com R especificam os iniciadores anti-
senso (modificado de http://humupd.oxfordjournals.org/content/12/3/209/F2.expansion).
40
Tabela 3.2.1.1: Descrição dos iniciadores utilizados na amplificação e sequenciamento da região
genômica estudada
Iniciador Sequência TM (ºC) Orientação Uso
G25 TCCATGAGGTATTTCAGCGC 55.1 Senso PCR
G26 GTGAGTAACTCCGGCCCAG 57.7 Senso Sequencimento
G26R CTGGGCCGGAGTTACTCAC 57.7 Anti-senso Sequencimento
G3R GGGTCACGTGTGTCTTGGG 58.4 Anti-senso Sequencimento
G4R CACCACCGACCCTGTTAAAG 55.7 Anti-senso PCR
As reações padronizadas de PCR foram utilizaram: 5 µL de tampão 10X, 1,5
µL de MgCl2 a 25 mM, 0,4 µL de dNTP mix a 25 mM, 0,5 µL de cada iniciador a 25
ρmol/µL, 0,4 µL de Taq Platinum polimerase (Invitrogen, São Paulo, Brasil) 5 U/µL,
100 ng de DNA e água ultrapura (Life Technologies, Carlsbad, EUA) para um volume
final de 50 µL. As reações foram realizadas em uma única etapa em termocicladores
modelo Veriti® 96 Well Thermal Cycler (Life Technologies, Carlsbad, EUA). A
ciclagem foi iniciada com ativação da enzima a 94°C por 2 minutos, seguida de 35
ciclos de três etapas compreendendo desnaturação a 94° por 30 segundos,
anelamento a 60°C por 30 segundos e extensão a 72°C por 1min/kb. Um ciclo final
de extensão submetia as amostras à temperatura de 72°C por 8 minutos.
Para analisar se a amplificação fora bem sucedida, uma alíquota de 5,0 µL do
produto amplificado de cada amostra era misturada em 1 µL do corante BlueGreen
(LGCBiotecnologia) e submetida à eletroforese horizontal (100 mAmp) com tampão
NaOH 1X em gel de agarose 1%. A visualização do gel foi realizada em um
transiluminador de ultravioleta (Bio-Rad, Tokyo, Japão) utilizando o programa
“KODAK Molecular Imaging Software©” (East Kodak Company, Nova York, EUA).
Para estimar o tamanho do fragmento desejado foi utilizado o marcador “1000 pb
DNA Ladder” (Amershan Biosciences, Baie-D'urfe, Canadá).
3.2.2. Purificação dos produtos de PCR
Os produtos de PCR foram purificados utilizando o conjunto de reagentes
“HiYield Gel/PCR DNA Mini Kit” (Real Genomics, Bio America Inc, Miami, USA),
segundo protocolo do fabricante. Brevemente, a purificação visa eliminar todos
reagentes não incorporados ao final da PCR. Foram adicionados 500 µL de tampão
41
de ligação (DF Buffer) ao produto, que foi posteriormente transferido para uma
membrana de sílica de alta capacidade, na qual o DNA é adsorvido na passagem
por centrifugação a 13.000 rpm por um minuto. Após essa etapa, 600 µL de tampão
de lavagem (Wash Buffer) foram adicionados, sendo novamente a amostra
centrifugada em duas etapas, cada uma delas com duração de um minuto e
velocidade de 13.000 rpm. O processo de purificação terminou com a eluição do
DNA com 40 µL do tampão de eluição depositado diretamente sobre a membrana da
coluna de purificação.
Os produtos foram novamente analisados em gel de agarose a 1% utilizando
2 µL do purificado para verificar sua integridade e estimar a concentração do DNA
através da intensidade da banda comparada à 2 µL do marcador de massa
molecular, Low DNA Mass Ladder (Life Technologies, Carlsbad, EUA). Esse
marcador permite estimar o valor aproximado da concentração dos produtos através
da comparação com bandas de diferentes concentrações definidas no manual do kit.
Após todo o procedimento, as amostras foram armazenadas em freezer a -20°C.
3.2.3. Sequenciamento das regiões genômicas de inte resse
As reações de sequenciamento foram realizadas com os reagentes do “Big
Dye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit” (Life Technologies, Carlsbad, EUA)
seguindo o protocolo do fabricante. Para cada reação utilizou-se de 5 a 20 ng de
DNA purificado, 1 µL (5 ρmol/mL) de cada iniciador, 1 µL de Big Dye, 1,5 µL de
tampão de sequenciamento 5x e água ultrapura para um volume final de 10 µL por
reação. As reações foram feitas em termociclador nas seguintes condições: 35 ciclos
de 96ºC por 10 segundos (desnaturação), 50º C por 5 segundos (anelamento) e
60ºC por quatro minutos (extensão).
A precipitação foi feita adicionando-se 80 µL de isopropanol a 75%, seguida
da incubação por 15 minutos a temperatura ambiente e posterior centrifugação por
45 minutos a 4ºC. Após o sobrenadante ser eliminado, foi realizada uma lavagem
com etanol a 70% e centrifugação por 5 minutos a temperatura ambiente.
Desprezou-se cuidadosamente o sobrenadante e o DNA foi ressuspendido em 10 µL
de formamida. As amostras foram sequenciadas em um aparelho ABI3130xl (Life
Technologies, Carlsbad, EUA).
42
3.2.4. Edição, Alinhamento das sequências e definiç ão dos alelos
Os eletroferogramas obtidos a partir de cada iniciador foram agrupados e
editados manualmente no programa “DNASTAR Lasergene 7” (DNAstar, Wisconsin,
EUA), com a ferramenta “SeqMan”, gerando uma sequência-consenso. Os
consensos gerados e as sequências-referência para todos os alelos descritos
retiradas do banco de dados IMGT/HLA
(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/ipd/imgt/hla/G_gen.fasta) foram alinhados no
programa Bioedit (HALL et al., 1999) para definição dos alelos. O site especifica
todas as sequências utilizadas como referência, sendo única para cada alelo, com
seus respectivos números de acesso, nome do alelo e tamanho do fragmento. A
definição foi baseada em análises de similaridade das sequências com as
referências através de uma inspeção visual.
Amostras heterozigotas que não puderam ser definidas seja por suspeita de
novos alelos quanto pela presença de picos duplos em posições definidoras de
alelos, foram submetidas à clonagem a fim de definir os alelos presentes.
3.2.5. Clonagem de heterozigotos e investigação de novos alelos
As reações de clonagem usaram o conjunto de reagentes do “TOPO® TA
Cloning® Kit for Sequencing” (Life Technologies, Estados Unidos) seguindo
instruções do protocolo do fabricante. Este se baseia no fato de que os produtos de
PCR amplificados com a enzima Taq® frequentemente possuem uma adenosina
projetada nas extremidades 3’, dessa forma o sistema de clonagem T-A possui uma
sequencia com timinas complementares projetadas para se ligarem ao fragmento de
interesse amplificado pela PCR.
Como o tamanho do inserto (aproximadamente 1800 pb) dificultou a
realização da clonagem da sequência completa em um único experimento, optamos
por dividir nossa região de interesse em dois fragmentos com cerca de 1300 pb
cada, o que confere uma região de sobreposição entre esses fragmentos de cerca
de 600 pb. Dessa forma cada amostra teve de ser clonada em duas reações
diferentes. Os produtos utilizados nessas reações foram obtidos através de uma
reação de PCR semi-aninhada a partir do produto de PCR obtido inicialmente para
ser utilizado no sequenciamento direto. Nessas novas reações foram utilizados os
iniciadores G25 e G3R em uma reação e G26 e G4R em outra. As condições da
PCR foram semelhantes as já descritas.
43
Na primeira etapa da clonagem, a 4 µl produto de PCR foi adicionado 1 µl de
TOPO Cloning Vector e 1 µl de Salt Solution diluído quatro vezes. Essa reação foi
incubada por 30 minutos em temperatura ambiente. As reações de ligação (2 µl)
foram adicionadas em 50 µL de células eletrocompetentes “Gene Hogs” (Life
Technologies, EUA). Em seguida, as amostras foram transferidas para uma cubeta
de eletroporação de 0,2 cm e submetidas a um choque elétrico (Capacitância 25
µFD, resistência 200Ω-500 Ω, voltagem 2,5 KV). Após o choque, em cada tubo
foram adicionados 400 µl de meio SOC (contido no kit). Posteriormente as bactérias
incubadas foram incubadas para recuperação a 37°C por 1 hora no agitador (LAB-
LINE Incubator-Shaker, ORBIT, modelo 3525, EUA). Após o período de recuperação
das bactérias, a cultura líquida foi plaqueada em meio LB ágar contendo o antibiótico
de seleção.
A reação de transformação foi dividida em duas partes iguais e cada metade
foi colocada em uma placa com meio sólido contendo ampicilina, totalizando duas
placas por vírus clonado. Usando uma alça de vidro previamente flambada em
álcool, a transformação foi espalhada em ambas às placas que foram incubadas na
estufa (REVCO\Lindberg, modelo RCO3000TABA, EUA) a 37°C por 12-16 horas.
Para cada placa foram selecionadas aleatoriamente no mínimo 20 colônias. A
confirmação de que os clones continham o inserto de interesse foi feita através de
PCR de colônia ajustados para um volume final de 25 µL, utilizando-se os
iniciadores M13 senso (5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’) e anti-senso (5’-
CAGGAAACAGCTATGAC-3’) fornecidos pelo kit. Cada colônia foi tocada com uma
ponteira de micropipeta estéril e colocada na mistura da PCR. A ciclagem utilizada
foi similar a da PCR aninhada, descrita anteriormente, somente alterando a
temperatura de anelamento para 55°C por trinta segundos. Para cada amostra,
foram incluídos controles negativos contendo apenas os reagentes utilizados na
PCR para verificar a presença de contaminantes. Posteriormente, foi verificada a
existência do inserto desejado em gel de agarose 1%. Confirmada a presença do
inserto, o produto foi purificado, sequenciado, editado e analisado como descrito
anteriormente.
3.3. Análises Estatísticas
Para as análises de correlação dos alelos do HLA-G com a susceptibilidade à
44
infecção e à persistência do HPV, foram utilizados os conjuntos HLA G:01:01:01
(que abrange os alelos G:01:01:01:01/02 e G:01:01:01:03/04/05), G:01:01:02 (com
os alelos G:01:01:02:01 e G:01:01:02:02), G:01:03 (G:01:03:01:02) e G:01:04 (que
inclui os alelos G:01:04:01, G:01:04:04 e G:01:04:05). A estimativa do efeito de cada
alelo na infecção foi feita comparando os indivíduos testados positivamente para a
presença de um determinado alelo com indivíduos que não o possuem. Foram feitos
testes para inúmeros desfechos clínicos e características da infecção.
Além disso, as espécies do HPV foram compiladas em três grupos baseados
nas análises filogenéticas feitas por de Villiers e colaboradores, 2004, como
proposto por Ferguson e colaboradores, 2012. O grupo A incluiu as espécies 1, 8, 10
e 13; o grupo B incluiu as espécies 5, 6, 7, 9 e 11; e o grupo C incluiu as espécies 2,
3, 4 e 15. O grupo B compreende os tipos de HPV com alto risco oncogênico,
enquanto os grupos A e C são formados por tipos de baixo risco.
A frequência dos alelos presentes na casuística foi determinada por contagem
direta. As associações entre os alelos e os diferentes desfechos foram investigados
através do valor de odds ratio (OR) e 95% de Intervalo de Confiança (IC) obtido
através da análise de regressão logística ajustada por diferentes fatores no
programa SPSS (Statistical Package for the Social Sciences, Armonk, NY: IBM
Corp).
Os ajustes foram feitos testando-se a influência dos fatores de risco
associados ao HPV como o número de parceiros sexuais ao longo da vida,
tabagismo, número de gestações, uso de anticoncepcional, múltipla infecção e idade
da primeira relação sexual com o desfecho final a ser considerado na análise.
O teste Qui-quadrado com distribuição de Poisson foi usado para avaliar
associações entre as variáveis categóricas. Um valor de p ≤ 0,05 foi considerado
como estatisticamente significativo e os valores menores que 0,1 foram
considerados como uma tendência de associação. Todas as análises estatísticas
foram feitas em colaboração com a Profa. Dra. Anke Bergmann.
45
4. RESULTADOS
Todas as 140 pacientes arroladas no estudo tiveram a região genômica do
HLA-G amplificada e sequenciada. Dessas, apenas 14 não puderam ter o seu alelo
definido devido ao tamanho insuficiente do fragmento sequenciado. As outras 126
pacientes foram analisadas e tiveram seu alelo definido através da similaridade entre
as sequências obtidas e sequências-referência de cada alelo retiradas do banco de
dados IMGT/HLA. Cabe destacar que durante as análises dos eletroferogramas
foram observados picos duplos nas sequências, indicativo de heterozigose de
determinadas amostras (Fig. 4.1).
Figura 4.3.3.1. Alinhamento da sequência obtida com o iniciador G4R da paciente 110 com a
referência do HLA-G, destacando o pico duplo na posição 1381 (cujo nucleotídeo está destacado em
vermelho na sequência consenso gerada). A visualização do alinhamento foi feita no programa
Seqman (DNA Star).
Para serem classificadas, as sequências obtidas das pacientes deveriam
possuir total similaridade à sequência-referência de determinado alelo, caso
contrário levantou-se a possibilidade da presença de um novo alelo, fato confirmado
apenas após a realização da clonagem. Das quatorze amostras clonadas, foram
identificados seis alelos novos (não descritos na base de dados) (Tabela 4.1),
presentes em sete indivíduos, e esclarecidos sete genótipos heterozigotos que não
puderam ser definidos através do sequenciamento direto das amostras.
As amostras foram clonadas em dois fragmentos, totalizando 28 reações de
clonagem. De cada reação foram selecionadas em média 15 colônias (6-20). Para a
determinação dos alelos presentes nesses indivíduos foram feitos alinhamentos
contendo as sequências obtidas a partir dos clones de ambos os fragmentos, as
sequências utilizadas como referência para cada alelo e a sequência obtida através
do sequenciamento direto da amostra, permitindo assim a verificação da presença
46
de clones contendo os dois nucleotídeos presentes nos picos duplos, como pode ser
visualizado na figura 4.2.
Figura 4.3.3.2. Alinhamento contendo os clones obtidos de HLA-G da paciente 121. Destacado pela
seta vermelha está a troca G para C na posição 1249, definidora do novo alelo por distingui-lo do
HLA:G*:01:01:02:01. As referências iniciam com HLA:G*, a sequência obtida através do
sequenciamento direto está identificada como 121HLA-G e os demais representam os clones obtidos.
A sequência definida como modelo do novo alelo está nomeada como AN121-5 HLA-G F1.
A localização das mudanças nucleotídicas identificadas nos seis novos alelos
encontrados no estudo estão especificadas na Tabela 4.1.
47
Tabela 4.1 . Informações dos seis alelos novos de HLA-G encontrados em heterozigose no estudo
Número de
pacientes
contendo o
novo alelo
Denominação
utilizada no
estudo
ID das pacientes
Troca
nucleotídica
(Posição)*
Localização
Genômica no
gene HLA-G
4 A 2, 114, 121, 125 G1249C Íntron 3
1 B 28
G294A;
C503T
C901G
Íntron 2
Éxon 3
Íntron 3
1 C 91 C89T Éxon 2
1 D 98 G707A Éxon 2
1 E 54 C278T Íntron 2
1 F 54 A76T Éxon 2
*A posição foi definida com base na classificação do banco de dados IMGT/HLA. A paciente 54 é um
heterozigoto com 2 alelos novos.
Os novos alelos encontrados ainda serão submetidos ao Comitê de
Nomenclatura da Organização Mundial da Saúde a fim de validar os novos alelos e
incorporá-los ao banco de dados mundial IMGT/HLA.
Foi possível identificar 52 genótipos nessa casuística, todos representados na
Tabela 4.2. Além disso, 41 pacientes foram identificadas como homozigotos no gene
HLA-G, abrangendo um total de oito genótipos. Cabe destacar a presença de um
alelo novo em específico que foi observado em quatro indivíduos compondo três
diferentes genótipos.
48
Tabela 4.2. Genótipos encontrados nas pacientes do estudo ordenados por ocorrência (n=126)
As letras de A-F presentes na tabela representam os novos alelos encontrados como definido na tabela 4.1; em roxo está destacado o novo alelo que pode ser encontrado em três genótipos diferentes. Os demais novos alelos foram encontrados em apenas um individuo e, portanto, cada um representa um novo alelo único.
Os genótipos encontrados na casuística compreendem vinte e dois diferentes
alelos de HLA-G dos cinquenta descritos até o momento. Aqueles com frequência
maior que 3% estão representados na figura 4.3.
Alelo A Alelo B N Alelo A Alelo B N
G:01:01:01:01/02 G:01:01:01:01/02 14 G:01:04:04 G:01:01:01:06 2
G:01:01:02:01 G:01:01:02:01 11 G:01:01:01:01/02 B 1
G:01:01:01:01/02 G:01:03:01:02 7 G:01:01:01:01/02 D 1
G:01:01:01:01/02 G:01:01:01:03/04/05 5 G:01:01:01:01/02 G:01:01:16 1
G:01:01:01:01/02 G:01:01:02:01 5 G:01:01:01:03/04/05 G:01:01:02:01 1
G:01:01:01:03/04/05 G:01:04:04 4 G:01:01:01:03/04/05 G:01:01:06 1
G:01:04:04 G:01:04:04 4 G:01:01:01:03/04/05 G:01:01:19 1
G:01:05N G:01:05N 4 G:01:01:01:03/04/05 G:01:04:01 1
G:01:01:01:01/02 G:01:01:03:03 3 G:01:01:01:03/04/05 G:01:05N 1
G:01:01:01:01/02 G:01:04:01 4 G:01:01:01:03/04/05 G:01:01:15 1
G:01:01:01:01/02 G:01:05N 3 G:01:01:02:01 G:01:01:03:03 1
G:01:01:01:03/04/05 G:01:01:01:03/04/05 3 G:01:01:02:01 G:01:04:05 1
G:01:01:01:03/04/05 G:01:01:03:03 3 G:01:01:02:01 A 1
G:01:01:02:01 G:01:04:01 3 G:01:01:02:02 G:01:01:02:02 1
G:01:01:02:01 G:01:04:04 3 G:01:01:02:02 G:01:04:04 1
G:01:01:02:01 G:01:06 3 G:01:01:02:02 G:01:01:06 1
G:01:01:01:01/02 G:01:06 2 G:01:01:03:03 G:01:01:06 1
G:01:01:01:03/04/05 G:01:03:01:02 2 G:01:01:19 G:01:04:04 1
G:01:01:02:01 G:01:01:06 2 G:01:01:19 G:01:05N 1
G:01:01:02:01 G:01:03:01:02 2 G:01:03:01:02 G:01:04:01 1
G:01:01:19 G:01:01:19 2 G:01:04:01 G:01:06 1
G:01:04:01 G:01:04:01 2 G:01:01:01:01/02 G:01:01:06 1
G:01:04:01 G:01:05N 2 G:01:04:01 C 1
G:01:04:01 G:01:04:04 2 G:01:05N A 1
G:01:04:01 A 2 E F 1
G:01:04:04 G:01:05N 2 G:01:01:01:01/02 G:01:01:05 1
49
Figura 4.3.3.3 . Frequências alélicas dos variantes de HLA-G encontrados no estudo com valor
superior a 3%. A classe “Novos” abrange todos os seis novos alelos identificados. A classe “Outros”
se refere à soma da frequência dos alelos G:01:01:02:02, G:01:01:05, G:01:01:06, G:01:03:01:02,
G:01:04:05 e G:01:06 (Com freqüência individual abaixo de 3%).
Para as análises de correlação dos alelos do HLA-G com a susceptibilidade à
infecção e à persistência do HPV, foram utilizados os alelos HLA G:01:01:01,
G:01:01:02, G:01:03, G:01:04 e G:01:05N, descritos como os mais frequentes
mundialmente e encontrados nesse estudo com frequência acima de 4%. As
análises de regressão logística indicaram que os principais fatores de ajuste a serem
considerados foram a idade e pertencer ou não ao grupo previamente definido de
mulheres com alto risco de exposição ao vírus.
A Tabela 4.3 representa a relação entre a presença/ausência dos alelos e a
infecção pelos respectivos grupos de HPV definidos previamente (vide seção
“Análises estatísticas” em Material e Métodos), destacando-se o efeito protetor
exercido por dois diferentes alelos. O estudo mostrou que o alelo G:01:03 pôde ser
associado à proteção contra a infecção por espécies de HPV do grupo B (alto risco
oncogênico) e o alelo G:01:01:02 pôde ser associado à proteção contra a infecção
por espécies do grupo C (baixo risco oncogênico).
50
Tabela 4.3 . Resultados obtidos através de análises de regressão logística ajustada por idade mostrando a correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a infecção por diferentes tipos de HPV durante o período de estudo.
Grupo A Grupo B Grupo C
Alelo Negativo
(%)
Positivo
(%) P
OR
(IC 95%)
Negativo
(%)
Positivo
(%) P
OR
(IC 95%)
Negativo
(%)
Positivo
(%) P
OR
(IC 95%)
G:01:01:01
Ausente 88,7 11,3 0,761 22,6 77,4 0,564 87,1 12,9 2,039
Presente 90,6 9,4 0,776
0,237-2,438 34,4 65,6 0,170
0,255-1,243 76,6 23,4 0,167
0,792-5,249
G:01:01:02
Ausente 87,6 12,4 0,435 29,2 70,8 1,087 76,4 23,6 0,187
Presente 94,6 5,4 0,342
0,09-2,097 27 73 1,000
0,457-2,583 94,6 5,4 0,021
0,041-0,847
G:01:03
Ausente 90,4 9,6 1,637 25,4 74,6 0,246 81,6 18,4 0,833
Presente 83,3 16,7 0,358
0,307-8,737 58,3 41,7 0,038
0,071-0,851 83,3 16,7 1,000
0,166-4,174
G:01:04
Ausente 91 9 1,496 30,3 69,7 1,389 82 18 1,041
Presente 86,5 13,5 0,523
0,451-4,966 24,3 75,7 0,665
0,575-3,356 81,1 18,9 1,000
0,387-2,803
G:01:05N
Ausente 90,2 9,8 1,485 28,6 71,4 1,012 83,9 16,1 2,872
Presente 85,7 14,3 0,638
0,292-7,566 28,6 71,4 1,000
0,295-3,469 64,3 35,7 0,133
0,860-9,588
Grupo A: espécies de HPV 1, 8, 10 e 13; Grupo B: espécies de HPV 5, 6, 7, 9, 11; Grupo C: espécies de HPV 2, 3, 4 e 15. As associações significativas estão destacadas em vermelho. A presença do alelo se refere à soma de indivíduos homozigotos e heterozigotos (quando aplicável). A positividade para a infecção em um determinado grupo representa a presença de ao menos um tipo de HPV pertencente a alguma das espécies abrangidas no respectivo grupo.
51
A fim de melhor investigar as associações encontradas relacionando os alelos
com a infecção pelo HPV, fizemos novas análises considerando o genótipo de HLA-
G das amostras. Além disso, essa nova análise foi dividida em duas etapas: uma
onde foi feito apenas o ajuste da idade e outra ajustada para a idade e o alto risco
de exposição ao vírus. Dessa forma, foi analisada a ausência do alelo versus casos
de pacientes homozigotos com o alelo versus casos de pacientes heterozigotos com
o alelo. Cabe destacar que o alelo G:01:03 foi encontrado na nossa casuística
apenas na forma heterozigota, o que impossibilitou sua subdivisão. Nessa nova
análise não tivemos nenhuma significância estatística, entretanto encontramos uma
tendência de associação do genótipo homozigoto G:01:05N com o aumento do risco
de infecção por espécies de HPV do grupo C (Tabela 4.4).
52
Tabela 4.4. Resultados obtidos através de análises de regressão logística ajustada por idade e por alto risco de exposição ao vírus HPV evidenciando a
correlação entre os genótipos de HLA-G encontrados e a infecção durante o período de estudo.
Grupo A Grupo B Grupo C
Alelo
p OR* p ARE OR ARE p OR p ARE OR ARE p OR p ARE OR ARE
G:01:01:01
Heterozigoto 0,294 0,465 (0,111-1,946)
0,302 0,472 (0,113-1,968)
0,155 0,541 (0,232-1,261)
0,149 0,535 (0,229-1,252)
0,191 1,964 (0,715-5,398)
0,193 1,957 (0,713-5,375)
Homozigoto 0,408 1,881 (0,421-8,396)
0,435 1,819 (0,404-8,183)
0,468 0,638 (0,189-2,149)
0,436 0,615 (0,181-2,088)
0,236 2,267 (0,585-8,788)
0,249 2,226 (0,571-8,680)
G:01:01:02
Heterozigoto 0,290 0,321 (0,039-2,631)
0,301 0,329 (0,040-2,706)
0,683 0,817 (0,311-2,148)
0,701 0,828 (0,314-2,179)
0,118 0,295 (0,064-1,362)
0,121 0,298 (0,064-1,377)
Homozigoto 0,731 0,684 (0,078-5,996)
0,722 0,673 (0,076-5,931)
0,333 2,193 (0,448-10,745)
0,335 2,186 (0,445-10,726)
0,999 0 0,999 0
G:01:04
Heterozigoto 0,977 1,021 (0,250-4,166)
0,937 1,059 (0,254-4,419)
0,386 1,530 (0,585-4,000)
0,328 1,622 (0,615-4,280)
0,898 1,071 (0,376-3,055)
0,836 1,120 (0,385-3,261)
Homozigoto 0,097 4,820 (0,753-30,853)
0,124 4,491 (0,662-30,472)
0,901 0,894 (0,154-5,201)
0,806 0,799 (0,134-4,778)
0,918 0,890 (0,097-8,176)
0,862 0,818 (0,086-7,832)
G:01:05N
Heterozigoto 0,949 0,931 (0,106-8,165)
0,938 0,917 (0,103-8,127)
0,471 0,612 (0,161-2,328)
0,470 0,611 (0,160-2,328)
0,297 2,164 (0,507-9,233)
0,298 2,166 (0,506-9,276)
Homozigoto 0,306 3,464 (0,321-37,316)
0,270 3,861 (0,349-42,645)
0,999 - 0,999 - 0,103 5,443 (0,711-1,657)
0,094 5,761 (0,742-44,695)
Grupo A: espécies de HPV 1, 8, 10 e 13; Grupo B: espécies de HPV 5, 6, 7, 9, 11; Grupo C: espécies de HPV 2, 3, 4 e 15. ARE- refere-se a um grupo apenas com mulheres sob Alto Risco de Exposição ao Vírus HPV * A OR é definida em relação às pacientes negativas para o alelo em questão, definida como = 1.
53
Como não foi encontrada associação entre a família G:01:01:01 e a infecção pelo
HPV em nenhum dos três grupos, a análise foi repetida considerando-se apenas o alelo
G:01:01:01:01/02 (presente em 25% da casuística), que codifica para a mesma proteína
que o alelo G:01:01:01:03/04/05, já que os últimos dígitos separados pelas barras
representam apenas alterações nucleotídicas presentes em uma região de íntron não
incluída no nosso estudo, o que prejudica a definição do alelo com oito dígitos. A
análise mostrou a associação do alelo G:01:01:01:01/02 com a proteção contra a
infecção por espécies do grupo C (p= 0,033; OR 2,729 (IC 95% 1,082-6,887)).
Em vista do fato de que o HPV 16 foi o mais frequentemente encontrado em
nossa casuística (n = 44, 35%), analisamos também a associação de alelos de HLA-G
com a infecção por este tipo viral. Entretanto, os resultados não apontaram nenhuma
associação estatisticamente significativa (Anexo V).
Foram também realizadas análises de associação dos alelos de HLA-G com os
casos de eliminação e persistência da infecção pelo HPV durante o tempo de
acompanhamento do estudo, mas nenhuma correlação estatisticamente significativa
pode ser encontrada. As análises foram repetidas restringindo-se a série ao grupo de
mulheres com alto risco de exposição ao vírus, como definido anteriormente. Isto
permitiu observar que o alelo G:01:04 está aparentemente associado a um aumento do
risco de persistência do vírus (p= 0,091; OR 2,299 (IC 95% 0,877-6,028)) (Anexo 2).
Ainda em relação à persistência, não foi encontrada nenhuma associação entre
qualquer alelo e a infecção persistente pelo HPV 16 (Anexo V).
As análises da correlação dos alelos aos casos de múltipla infecção foram
realizadas considerando-se toda a casuística e posteriormente apenas as mulheres
pertencentes ao grupo com alto risco de exposição, entretanto nenhuma associação foi
encontrada.
Quanto às alterações citológicas detectadas por colposcopia, foram realizadas
análises de correlação entre os alelos do HLA-G e a ocorrência de lesões que
apontaram um efeito protetor contra a ocorrência de lesões em pacientes com o alelo
G:01:01:02, e uma tendência de aumento de ocorrência de lesões em pacientes
portando os alelos G:01:04 e G:01:05N (Tabela 4.5).
54
Tabela 4.5: Correlação entre os alelos de HLA-G e a presença de alterações citológicas (LSIL e/ou HSIL)
Alelos Lesão
citológica (%) OR p OR (ARE) p ARE
Ausente 34 G:01:01:01
Presente 34
1,001 (0,477-2,102)
0,997 1,009
(0,480-2,122) 0,981
Ausente 43 G:01:01:02
Presente 13
0,212 (0,075-0,597)
0,003 0,210
(0,074-0,593) 0,003
Ausente 35 G:01:03
Presente 25
0,573 (0,144-2,279)
0,429 0,558
(0,140-2,227) 0,408
Ausente 29 G:01:04
Presente 46
2,027 (0,915-4,493)
0,082 2,009
(0,903-4,469) 0,087
Ausente 31 G:01:05N
Presente 57
2,903 (0,935-9,012)
0,065 2,882
(0,928-8,955) 0,067
Em vermelho está destacado o efeito protetor do alelo G:01:01:02 contra a ocorrência de lesões,
associações estas significativas. ARE- refere-se a um grupo apenas com mulheres sob Alto Risco de
Exposição ao HPV
Em uma análise da persistência das lesões, observou-se a associação do alelo
G:01:04 (p=0,036, Anexo 8.4.1) com a persistência da lesão em pacientes com citologia
alterada, significância essa que se manteve tanto na análise de regressão ajustada por
idade, quanto na análise ajustada por idade e alto risco de exposição ao vírus.
Para as análises estatísticas também foram considerados parâmetros clínicos
como a contagem da carga viral do HIV e a contagem de células CD4 por mm3, na qual
podemos destacar apenas uma tendência de associação do alelo G:01:01:02 à valores
indetectáveis de carga viral (p=0,059; OR 2,269 (IC 95% 0,969-5,313)) e uma
associação do alelo G:01:05N a contagem de células abaixo de 350 por mm3 (p= 0,024;
OR 0,249 (IC 95% 0,74-0,835). A tabela completa está disponível no Anexo V.
55
5. DISCUSSÃO
É sabido que o HPV evoluiu a fim de escapar da detecção pelo sistema imune
através de diversos mecanismos de forma a estabelecer a infecção e manter a
persistência viral. Inúmeros são os imunomoduladores capazes de atuar nesse
processo. Nesse contexto, a importância do HLA-G na regulação negativa da resposta
do sistema imune tem sido alvo de diversos estudos atuais (revisado por CAROSELLA
et al., 2008b).
Os resultados obtidos através da genotipagem dos éxons 2 a 4 do HLA-G
permitiram a aplicação de análises estatísticas para descrever e caracterizar uma
amostra populacional de 126 gestantes HIV+ acompanhadas no Rio de Janeiro. Foi
possível traçar um perfil da variabilidade genética do HLA-G e comparar esses dados
com as poucas informações disponíveis na literatura obtidas em estudos similares com
outras amostras populacionais de Montreal e Quebec, ambos no Canadá (FERGUSON
et al., 2011; FERGUSON et al., 2012; METCALFE et al., 2013).
A elevada variedade de alelos observada é condizente com o alto nível de
diversidade genética intrapopulacional associado às amostras brasileiras. O Brasil é
relatado como uma das populações mais heterogêneas do mundo como resultado de
cinco séculos de cruzamentos entre diferentes etnias oriundas de três continentes: os
colonizadores europeus (representados principalmente pelos portugueses), os colonos
ameríndios e os escravos africanos (PARRA et al., 2003). Dessa forma, o país
apresenta a maior variabilidade já detectada de alelos do HLA-G. Em estudos
anteriores com populações brasileiras, 43% dos alelos descritos haviam sido
identificados (CASTELLI et al., 2007, CASTELLI et al., 2008). Nosso estudo encontrou
uma taxa de detecção similar, tendo identificado 22 de 50 alelos (44%) alelos descritos.
Embora a região codificante apresente menor diversidade nucleotídica do que as
regiões promotora (5’URR) e 3’UTR, com uma média de uma variação a cada 62
nucleotídeos, é responsável pela maior diversidade haplotípica do gene (CASTELLI et
al., 2011). Dessa maneira, nosso estudo se propôs a analisar exclusivamente essa
região.
Por definição, um polimorfismo deve estar presente em uma população em uma
56
frequência maior que 1%. Com isso, alguns polimorfismos do HLA-G podem não ser
validados, já que estão presentes em apenas um ou poucos indivíduos em cada estudo.
Entre os 13 polimorfismos descritos para o éxon 2, 12 para o éxon 3 e 8 para o éxon 4,
aparentemente apenas quatro desses (um no éxon 2, 2 no éxon 3 e um no éxon 4)
estão presentes com uma frequência maior do que 1% na população mundial (revisto
por DONADI et al., 2011). Cabe aqui destacar que a maioria dos sítios polimórficos
nessa região representam substituições sinônimas e que apenas uma substituição não-
sinônima em cada um dos éxons 2, 3 e 4 possui frequência mundial maior que 1%
(revisto por DONADI et al., 2011).
Esse é o primeiro estudo investigando a associação dos alelos do HLA-G com a
susceptibilidade à infecção e à persistência do HPV na população brasileira. Em
relação a estudos brasileiros com o HLA-G e a infecção pelo HPV, o primeiro estudo
publicado na literatura foi realizado por Simões e colaboradores com mulheres em
acompanhamento na cidade de Ribeirão Preto, que buscou correlacionar os alelos do
HLA-G com as lesões citológicas provocadas pelo HPV (SIMOES et al., 2009). Esse
estudo utilizou a técnica de RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) para
caracterizar os éxons 2 e 3 definindo os alelos apenas em nível de família, enquanto o
nosso estudo analisou a região dos éxons 2-4 com as técnicas de sequenciamento e
clonagem, o que nos permitiu definir os alelos além do nível de família e portanto uma
associação mais clara entre os alelos e a infecção. Um outro estudo realizado na
população brasileira foi feito com base na definição dos polimorfismos presentes na
região 3’UTR, impossibilitando a comparação com os dados obtidos a partir da região
codificante, o caso aqui presente (SILVA et al., 2013).
Nosso estudo encontrou alelos que codificam as quatro diferentes proteínas do
HLA-G comumente observadas na população mundial. Eles estão distribuídos nas
famílias G:01:01. G:01:03, G:01:04 e G:01:06 e podem influenciar na função do HLA-G
por modificarem o sítio de ligação aos aminoácidos.
O alelo mais predominante em nosso estudo foi o G:01:01:01:01/02 encontrado
em 26% da população. Por sua vez, o alelo G:01:01:01:03/04/05 foi encontrado em
11% das mulheres, totalizando uma frequência de 37% para a família G:01:01:01, taxa
essa similar à encontrada em indivíduos da cidade de São Paulo (CASTELLI et al.,
57
2007). Os alelos da família G:01:01:01 são os mais encontrados em todo o mundo, com
frequência variando de 10% no Norte da Índia, a 33% no Japão, 52% na Polônia, 56%
na Dinamarca e 83% em Gana (ISHITANI et al., 1999; ABBAS et al., 2004; HVIID et al.,
2006; SIPAK-SZMIGIEL et al., 2009). Outro alelo bastante frequente no estudo foi o
alelo G:01:01:02:01, presente em 17.46% das mulheres, taxa comparável a frequência
de 15.5% encontrada na cidade de São Paulo (CASTELLI et al., 2011, CASTELLI et al.,
2008).
Sabe-se que o alelo G:01:05N, presente em 7% das mulheres da nossa
casuística, é encontrado com frequência em algumas populações e está ausente em
outras, estando superrepresentado no norte da Índia (15.4%) e no povo Shona
localizado no Zimbábue e Moçambique (11.1%) quando comparado à Dinamarca (1%)
e a outros estudos feitos no Brasil (0.97%-4.17%) (MATTE et al., 2002; ABBAS et al.,
2004; HVIID et al., 2006; CASTELLI et al., 2007, CASTELLI et al., 2009).
Dos alelos descritos recentemente na população brasileira por Castelli e
colaboradores, foi possível encontrar em nossa casuística oito indivíduos portando o
alelo G:01:01:03:03, descrito em 2012 e encontrado em dois indivíduos da cidade de
Ribeirão Preto, São Paulo (CASTELLI et al., 2012).
Os alelos G:01:01:03, G:01:01:05 e G:01:01:08 estão associados na literatura ao
aumento do risco de infecção por espécies de HPV incluídas no grupo A, entretanto, tal
associação não foi encontrada no nosso estudo. Tal fato pode ser explicado pela baixa
frequência do alelo G:01:01:05 e pela ausência do alelo G:01:01:08 em nossa
casuística. Já o alelo G:01:01:03 estava presente apenas em mulheres infectadas por
espécies de HPV grupo B. Além desses, os alelos G:01:01:01, G:01:01:02 e G:01:04:01
também não puderam ser associados às características descritas anteriormente na
literatura, respectivamente aumento do risco de infecção por espécies dos grupos A e
C, aumento do risco de infecção pelo HPV-16 e proteção contra a infecção por espécies
de HPV do grupo C (FERGUSON et al., 2012, FERGUSON et al., 2011; METCALFE et
al., 2013).
A análise das pacientes incluídas no nosso estudo permitiu encontrar
associações protetoras contra a infecção pelo HPV em dois alelos: o alelo G:01:03 se
58
mostrou protetor contra a infecção por espécies do grupo B e o alelo G:01:01:02
ofereceu proteção contra a infecção por espécies do grupo C. Quando as análises
foram divididas em pacientes homozigotos e heterozigotos foi encontrada apenas uma
tendência de associação entre a forma homozigota do alelo G:01:05N e o risco de
infecção por espécies do grupo C (p=0.094; OR 5,761 (IC 95% 0,742-44,695).
Ainda que não tenha sido encontrada associação entre a família G:01:01:01 e a
infecção por espécies de HPV incluídas no grupo C, foi evidenciada uma associação
com o alelo G:01:01:01:01/02 (p=0.04413). Deve-se esclarecer que esse alelo possui a
mesma sequência que o alelo G:01:01:01:03/04/05 que também compõe o conjunto
G:01:01:01, exceto por uma única substituição nucleotídica no íntron 3. Dessa forma,
acreditamos que o menor número de indivíduos com o alelo G:01:01:01:03/04/05
quando comparado aos indivíduos com o alelo G:01:01:01:01/02, e alta taxa de
heterozigotos nesse último grupo tenham influenciado na falta de significância
estatística quando a família foi analisada.
Com relação à persistência, assim como no estudo de Metcalfe e colaboradores,
nenhuma associação dos alelos com a manutenção de ao menos um tipo viral durante
o tempo de acompanhamento do estudo foi significante nem mesmo dos alelos
G:01:01:02 (descritos na literatura como associados à persistência do HPV-16) e
G:01:03 (associado a persistência das espécies do grupo C) (FERGUSON et al., 2012,
FERGUSON et al., 2011; METCALFE et al., 2013). Esse fato também pode estar
correlacionado ao baixo número de pacientes persistentes com esses alelos. A
tendência de associação entre o alelo G:01:04 e o aumento do risco da persistência
viral ainda precisa ser melhor investigada, de forma a validar a correlação evitando-se a
influência do baixo número de amostras (p=0,091; OR 2,299 (IC 95% 0,877-6,028)).
As análises de associação entre as alterações citológicas detectadas por
colposcopia e os alelos do HLA-G, permitiram evidenciar um efeito protetor contra a
ocorrência de lesões em pacientes portando o alelo G:01:01:02 e uma tendência de
aumento da ocorrência de lesões em pacientes com os alelos G:01:04 e G:01:05N. O
trabalho realizado por Simões e colaboradores encontrou uma correlação entre o alelo
G:01:03 e a proteção contra a ocorrência de lesões associadas ao HPV (SIMOES et al.,
2009). Tal associação não pode ser confirmada pelo nosso estudo uma vez que 25%
59
das mulheres com o alelo apresentavam lesão citológica versus 35% das mulheres em
o alelo. Em contrapartida, nosso estudo encontrou significância ao correlacionar o alelo
G:01:01:02 às lesões ocasionadas pelo HPV, diferente do estudo de Metcalfe, que
encontrou associação dos alelos G:01:01:02, G:01:04:01 e G:01:06 com as lesões mas
não alcançou significância estatística (METCALFE et al., 2013). De maneira
interessante, foi evidenciada a associação do alelo G:01:04 à persistência da lesão
durante o tempo de acompanhamento do estudo em pacientes com citologia alterada,
fato esse não demonstrado por nenhum estudo anterior. Cabe destacar que as
casuísticas usadas nos estudos citados não incluíram pacientes HIV positivos.
Entre os seis alelos novos encontrados nesse estudo, apenas um foi encontrado
em quatro pacientes. Os demais foram encontrados apenas em uma única paciente,
representando assim alelos raros. O novo alelo mais frequente nessa casuística
apresenta uma transversão G → C na posição +1249 de acordo com o banco de dados
IMGT/HLA. Esse novo alelo é provavelmente derivado do alelo G:01:01:02:01, bastante
frequente em nossa população (18%).
Já o alelo novo encontrado no paciente 28 apresenta uma transição na posição
249 de G → A, uma tranversão C → G na posição 901 e uma transição C → T na
posição 503 localizada no éxon 3, originando assim uma nova proteína e
caracterizando um novo alelo a partir do G:01:01:02:01.
A clonagem também indicou a presença de dois alelos novos na paciente 54,
sendo um dos alelos novos oriundo através de uma transição C → T na posição 278
localizada no íntron 2, gerando assim um alelo novo oriundo provavelmente a partir de
uma troca sinônima do alelo G:01:05N, tendo inclusive a deleção característica desse
alelo. O outro alelo desse paciente é provavelmente derivado do alelo G:01:12 tendo
apenas uma transversão A → T na posição 76, acarretando assim a geração de uma
nova proteína por ocorrer no éxon 2.
Além desses, o paciente 91 apresentou um alelo novo formado a partir de uma
transição C → T na posição 89 do éxon 2 gerando um novo alelo a partir do G:01:11.
Por fim, o paciente 98 apresentou uma transição G → A na posição 707 do éxon 2,
originando um novo alelo a partir do já descrito G:01:01:01:03/04/05.
60
Todos os alelos novos encontrados serão submetidos ao Comitê Internacional de
Nomenclatura (WHO Nomenclature Committee) para que sejam validados e tenham
então um nome oficialmente atribuído a eles.
As informações relativas à carga viral do HIV e a contagem de células CD4 por
mm3 presentes nos questionários das gestantes foram obtidas apenas na entrada
dessas mulheres no estudo (início do segundo trimestre da gestação) e no momento do
parto, totalizando ao menos seis meses de diferença entre as duas coletas. Dessa
forma, consideramos a presença de carga viral indetectável e contagem acima de 350
cells/mm3 quando essas mulheres apresentavam essa característica em ao menos um
momento do estudo. Ao correlacionarmos os alelos encontrados a esses parâmetros,
pudemos observar uma tendência de associação do alelo G:01:01:02 à valores
indetectáveis de carga viral e uma associação do alelo G:01:05N a contagem de células
abaixo de 350 por mm3. Cabe ressaltar que essas pacientes estavam em
acompanhamento médico durante o estudo e que o protocolo de tratamento a que
estavam submetidas visa a redução da carga viral e o reestabelecimento da contagem
de CD4 a fim de melhorar o sistema imune da mãe e para evitar a transmissão do vírus
ao neonato, o que poderia ser um fator de confusão nas análises. Dessa forma, mais
estudos precisam ser feitos de forma a validar essa associação.
Ainda quanto ao status soropositivo da infecção pelo HIV dessas pacientes, é
interessante observar que ocorre uma maior expressão de moléculas de HLA-G
solúveis nessas pacientes. Essa expressão é ainda maior em pacientes que fazem uso
do HAART- em particular naqueles que utilizam a classe dos inibidores análogos
nucleosídicos (NRTI) (RIVERO et al., 2007). Dessa maneira, a expressão aumentada
do HLA-G nessa população poderia favorecer o escape imune do vírus HPV, evitando
assim sua eliminação e favorecendo sua persistência no indivíduo.
Dentre os poucos trabalhos da literatura correlacionando os alelos do HLA-G à
infecção pelo HIV por transmissão sexual, destaca-se o trabalho de Matte e
colaboradores que encontrou uma associação entre o alelo G:01:01:08 e o aumento do
risco de infecção pelo HIV em mulheres adultas do Zimbábue, e uma maior frequência
do alelo G:01:05N em controles do que em mulheres infectadas pelo HIV (MATTE et al.,
2004). Posteriormente, a associação do alelo G:01:05N à diminuição do risco de
61
infecção pelo HIV foi corroborada por Lajoie e colaboradores em uma coorte de
mulheres também zimbabuanas (LAJOIE et al., 2006). Contrastando com esses
estudos, Segat e colaboradores encontraram uma associação do alelo G:01:05N ao
aumento do risco de infecção pelo HIV em italianas caucasianas adultas (SEGAT et al.,
2010, SEGAT e CROVELLA, 2012). Nosso estudo não encontrou o alelo G:01:01:08 e
observou uma elevada frequência do alelo G:01:05N, o que também pode estar
associado a uma maior risco de infecção pelo HIV em mulheres portando esse alelo. A
falta de trabalhos brasileiros correlacionando a infecção pelo HIV ao HLA-G impede
uma observação mais clara dessa correlação e destaca a necessidade de maiores
estudos a fim de verificar a validade dessa associação.
Resultados contrastantes sobre os níveis de expressão das formas solúveis do
HLA-G em pacientes HIV positivos e controles têm sido publicados (LOZANO et al.,
2002; DERRIEN et al., 2004; LAJOIE et al., 2009, LAJOIE et al., 2010). Uma hipótese
levantada por Aghafar e colaboradores afirma que variantes genéticas do HLA-G que
afetam a ligação aos receptores das células NK podem comprometer a inibição dessas
células, protegendo os carreadores dessas variantes da infecção pelo HIV (AGHAFAR
et al., 2012).
A busca contínua por melhores marcadores de prognóstico e o potencial
relativamente inexplorado de imunoterapias efetivas para o tratamento da infecção pelo
HPV e HIV impulsionam a busca para o melhor entendimento das interações entre o
vírus e o sistema imune que levam à regressão ou permitem a persistência da infecção
viral. Atualmente, o HLA-G tem sido alvo de inúmeros estudos que tem por objetivo
bloquear sua liberação em tumores com altos níveis de expressão, tornando-o uma
atrativa estratégia terapêutica contra diversos tipos de câncer, como mama, endométrio
e ovário (SINGER et al., 2003; DAVIDSON et al., 2005; BIJEN et al., 2010; DE KRUIJF
et al., 2010; HE et al., 2010; AGAUGUE et al., 2011; ZHENG et al., 2011).
Dessa forma, estudos com o lócus HLA-G se tornam cada vez mais necessários,
a fim de validar seu potencial uso como estratégia terapêutica contra o câncer,
infecções virais e doenças inflamatórias. Além disso, são necessários novos estudos
que possam validar o seu potencial como biomarcador, uma vez que poderia identificar
mulheres com alto risco de infecção pelo HPV e persistência viral, permitindo assim um
62
acompanhamento diferenciado dessas pacientes que inclua um rastreamento mais
frequente para o câncer cervical ou até mesmo uma prioridade no acesso à vacina
profilática do HPV.
63
6. CONCLUSÕES
A diversidade de alelos observada na população de mulheres HIV-positivas em
acompanhamento no Programa de Assistência Integral à Gestante HIV-positiva do
Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira da UFRJ, Rio de Janeiro, é
condizente com a alta diversidade genética associada à população brasileira. Nesse
estudo encontramos 44% dos alelos já descritos na literatura. As frequências dos alelos
encontrados em nossa casuística corroboram com os dados brasileiros disponíveis na
literatura.
As análises correlacionando os alelos do HLA-G à infecção pelo HPV
evidenciaram uma associação entre o alelo G:01:03 e a proteção contra a infecção por
espécies do grupo B e do alelo G:01:01:02 a proteção contra a infecção por espécies
do grupo C. Em nosso estudo, não foi evidenciada nenhuma correlação dos alelos
encontrados aos casos de múltipla infecção, persistência e eliminação viral.
Os dados relativos à citologia oncótica permitiram observar um efeito protetor
contra a ocorrência de lesões em pacientes portando o alelo G:01:01:02. Além disso,
pudemos evidenciar pela primeira vez a associação do alelo G:01:04 à persistência da
lesão em pacientes com citologia alterada. Quanto aos parâmetros clínicos, foi possível
correlacionar o alelo G:01:05N à contagem de celulas CD4 maior ou igual a 350
cels/mm3.
Em conjunto, esses dados contribuem para uma melhor compreensão sobre o
impacto dos alelos do HLA-G em mulheres co-infectadas pelos vírus HIV e HPV de
forma a esclarecer o papel desses alelos na susceptibilidade à infecção e persistência
do vírus HPV. Dessa forma, o estudo contribui para o desenvolvimento e
implementação de intervenções que possam ser efetivas para a população mais
susceptível, prevenindo assim a persistência da infecção e consequentemente a
progressão para o câncer cervical, tão frequente em nossa população. Entretanto, a
conscientização a fim de prevenir a disseminação do HPV e um sistema que garanta o
diagnóstico rápido e adequado da infecção devem ser prioridades da saúde pública,
garantindo assim o acesso e aprimorando os programas de prevenção e tratamento
disponíveis para todas as mulheres de nosso país.
64
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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79
8. ANEXOS
8.1. Aprovação do projeto no Comitê de Ética em Pe squisa do Instituto
Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva
80
8.2. Aprovação do projeto no Comitê de Ética em Pe squisa do Instituto de
Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira
81
8.3. Questionário aplicado as pacientes
Nome: Prontuário n°:
Endereço:
Bairro: Município: Estado:
Telefone: Outro contato:
Data de Nascimento: / / Idade atual:
Estado civil: ( ) Solteira ( ) Casada ( ) Viúva ( ) Divorciada ( ) União Consensual
Escolaridade: ( ) Analfabeta ( ) 1° Grau ( ) 2° Grau ( ) 3° Grau
Usuária de drogas injetáveis: ( ) Sim ( ) Não
( ) Sim
( ) Até 10 cigarros/dia
( ) 10 a 20
Tabagismo atual:
( ) Mais de 20
( ) Não
Menarca aos _____ anos
Primeira relação sexual aos ____ anos
N° de parceiros sexuais: ( ) 1 até 3 ( ) 4 ou mais ( ) Profissionais do sexo
Gesta - Para - Aborto -
DST prévia: ( ) Ausente ( ) Presente
( ) Condom pregresso ( ) Condom atual
( ) Anticoncepcional atual ( ) Anticoncepcional pregresso
( ) Diu atual ( ) Diu pregresso Método contraceptivo:
( ) Outro método -___________________
82
8.4. Tabelas estatísticas
Tabela 8.4.1: Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a persistência da infecção pelo vírus HPV durante o período de estudo, obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade e ajustada por idade e alto risco de exposição ao vírus (ARE). Destacado em negrito está a tendência de significância observada na análise.
Persistência Persistência ARE Alelo
OR (IC 95%) P OR (IC 95%) P
G:01:01:01 0,751
(0,308-1,831) 0,529
0,704
(0,285-1,739) 0,447
G:01:01:02 0,485
(0,165-1,429) 0,190
0,486
(0,164-1,444) 0,194
G:01:03 0,966
(0,191-4,872) 0,967
1,077
(0,211-5,494) 0,929
G:01:04 2,041
(0,799-5,216) 0,136
2,299
(0,877-6,028) 0,091
G:01:05N 1,863
(0,521-1,155) 0,338
1,967
(0,547-7,075) 0,300
Tabela 8.4.2. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a infecção pelo vírus HPV durante o período de estudo, valores de OR obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade e ajustada por idade e alto risco de exposição ao vírus.
Eliminação viral Eliminação viral ARE Alelo
OR (IC 95%) P OR (IC 95%) P
G:01:01:01 0,971
(0,461-2,046) 0,939
0,984
(0,466-2,078) 0,966
G:01:01:02 1,296
(0,578-2,906) 0,529
1,290
(0,575-2,895) 0,537
G:01:03 1,592
(0,464-5,467) 0,46
1,552
(0,449-5,358) 0,487
G:01:04 0,807
(0,351-1,858) 0,615
0,788
(0,340-1,822) 0,577
G:01:05N 0,789
(0,232-2,688) 0,705
0,779
(0,228-2,659) 0,690
83
Tabela 8.4.3. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e a ocorrência de casos de múltipla infecção pelo vírus HPV durante o período de estudo, os valores de OR foram obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade e ajustada por idade e alto risco de exposição ao vírus (ARE).
Tabela 8.4.4. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e os casos de melhora identificados por colposcopia durante o período de estudo, valores de OR obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade.
Múltipla Infecção
Alelo OR
(IC 95%) P
OR ARE
(IC 95%) P ARE
G:01:01:01 0,789
(0,293-2,128) 0,640
0,790
(0,291-2,144) 0,643
G:01:01:02 0,927
(0,302-2,848) 0,895
0,914
(0,297-2,813) 0,876
G:01:03 0,394
(0,046-3,350) 0,394
0,374
(0,044-3,172) 0,367
G:01:04 1,055
(0,363-3,063) 0,922
1,026
(0,353-2,979) 0,963
G:01:05N 2,524
(0,694-9,178) 0,160
2,496
(0,685-9,091) 0,165
Melhora citológica Alelo
OR (IC 95%) P
G:01:01:01 1,065
(0,332-3,415) 0,915
G:01:01:02 0,193
(0,024-1,559) 0,123
G:01:03 3,018
(0,678-13,434) 0,147
G:01:04 0,639
(0,163-2,506) 0,521
G:01:05N 1,478
(0,289-7,553) 0,639
84
Tabela 8.4.5 . Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e pacientes com contagem de cels TCD4>= 350 cels/mm3 durante o período de estudo. Valores de OR obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade. Destacado em negrito está a tendência de significância observada na análise.
Tabela 8.4.6. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e pacientes com carga viral do HIV
indetectável durante o período de estudo. Valores de OR obtidos através da análise de regressão
logística ajustada por idade. Destacado em negrito está a tendência de significância observada na
análise.
CD4>=350 cels/mm3 Alelo
OR (IC 95%) P
G:01:01:01 1,177
(0,486-2,851) 0,717
G:01:01:02 1,311
(0,489-3,515) 0,590
G:01:03 2,446
(0,293-20,415) 0,409
G:01:04 1,361
(0,488-3,799) 0,556
G:01:05N 0,249 (0,74-0,835) 0,024
CV Indetectável Alelo
OR (IC 95%) P
G:01:01:01 0,547
(0,262-1,141) 0,108
G:01:01:02 2,269
(0,969-5,313) 0,059
G:01:03 1,180
(0,329-4,229) 0,800
G:01:04 1,205
(0,540-2,690) 0,649
G:01:05N 0,581
(0,189-1,784) 0,343
85
Tabela 8.4.7. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e infecção pelo HPV-16. Valores de OR foram obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade.
Tabela 8.4.8. Correlação entre os alelos de HLA-G encontrados e infecção persistente pelo HPV-16 durante o período do estudo. Os valores de OR foram obtidos através da análise de regressão logística ajustada por idade e ajustada por idade e alto risco de exposição ao vírus.
Infecção HPV-16 Alelo OR (IC 95%) P
G:01:01:01 1,311
(0,624-2,752) 0,475
G:01:01:02 0,677
(0,293-1,561) 0,360
G:01:03 0,371
(0,076-1,797) 0,218
G:01:04 1,058
(0,470-2,380) 0,893
G:01:05N 1,505
(0,484-4,680) 0,480
Persistência HPV-16 Alelo
OR (IC 95%) P OR (IC 95%) ARE P ARE
G:01:01:01 0,485
(0,114-2,060) 0,327
0,478
(0,110-2,087) 0,327
G:01:01:02 0,634
(0,110-3,649) 0,610
0,634
(0,108-3,731) 0,615
G:01:03
- -
- -
G:01:04 1,955
(0,438-8,733) 0,380
1,990
(0,428-9,257) 0,380
G:01:05N 0,721
(0,071-7,273) 0,781
0,714
(0,070-7,249) 0,776