IDENTIFIKASI ESTERIFIKASI RETINOL OLEH M~CROSOM DARIMUKOSA USUS HALUS AYAM DENGAN MENGGUNAKAN [ H] RETINOL
Retno Murwani*
ABSTRAK
IDENTlrlKASI DAN KARAXTERISASI ESTERlrlKASI RETINOL OLKH MICROSOKK DARI MUCOSA3
USUS BALUS AYAM BERRASIL DILAKUKAN DENGAN MKNGGUNAKAN [ H] RETIONAL. Inkubasi micro-
some dengan [3H] retinol dan palmitoyl CoA memberikan radioaktif [3H] 'retinyl pal.i
tat yang dapat dideteksi pada kromatografi cairan tekanan tinggi (HPLC). Esterifika
si meningkat selama 15 menit dan pada temperatur antara 370C - 450C. Pembentukan3 .[ H] retinyl palmitat meningkat dengan konsentrasi protein microsome sampai 240 us
dan konsentrasi palmitoyl-CoA sampai 30 uM.pH optimal esterifikasi yaitu 6,6.3
Konsentrasi serum albumin (DSA) sedikit mempensaruhi pembentukan [H] retinyl
palmitat.
ABSTRACT
IDENTIrICATION AND CHARACTERS OF RETINOL ESTERIFICATION BY MICROSOHE OF CHICK
INTESTINAL MUCOSA WAS DEMONSTRATED IN THIS EXPERIMENT. Incubation of microsome with
[3H] retinol and palmitoyl CoA as substrate produced [3H] retinyl palmitat corres
ponding to that of authentic retinyl palmitate indentified on (HPLC). No esterifica
tion occured without palmitoyl CoA and microsome, and heat-inactivated microsome.
Esterification increased for 15 minutes at temperatur 370C - 450C. [3H] retinyl
palmitate formation was enhanced with microsomal protein concentration up to 240 us3
and palmotoyl CoA concentration up to 30 uM. Optimal pH was reached at 6.6. [ H]
retinyl palmitate formation was slightly dependent on bovine serum albumin (DSA).
PENDAHULUAN
Beta-carotene telah lama dikenal sebagai sumber vitamin A alami
yang paling potensil di antara carotenoid (1). Beta-carotene ini
diubah menjadi vitamin A terutama di dalam mukosa usus halus.
* Fakultas peternakan, Universitas Diponosoro
797
Retinal hasil pemecahan beta-carotene direduksi lebih lanjut menJadi
re~inol \2}. Retinol kemudian diesterifikasi kembali dalam sel
mukosa dengan asam lemak terutama asam lemak jenuh berantai panjang
sebelum diserap ke dalam tubuh dalam bentuk chylomicron (3). Esteri
fikasi retinol ini telah diteliti dan dikarakterisir pada beberapa
jenis mamalia (4, 5, 6), ditemukan dalam fraksi microsome dan be
reaksi terutama dengan asam palmi tat (7). Dalam penelitiannya SKLAN
(8) berhasi I menunjukkan adanya akti vitas pemecahan beta-carotene
dalam mukosa ayam. Demikian pula telah diteliti bahwa peningkatan
pemberian vitamin A dalam ransum hewan percobaan dapat meningkatkan
kandungan retinol hati. Selain itu peningkatan konsumsi beta-caro
tenepun ternyata meningkatkan simpanan vitamin A dalam hati. Namun,
masih menjadi pertanyaan apakah esterifikasi retinol yang dihasilkan
dari pemecahan beta-carotene juga dipengaruhi oleh peningkatan
konsumsi beta-carotene tersebut. Untuk mengetahui hal inilah maka
diperlukan indentifikasi adanya aktivitas esterifikasi dalam mukosa
usus ayam. Demikian pula diperlukan karakterisasinya untuk memper
oleh kondisi optimal bagi penelitian selanjutnya.
BAliAN DAN METODA
Bahan Kimia. [15-3HJ all trans retinol dengan aktivitas spesifik
23.5 Ciimmol. Stok [3HJ retinol ini diambil seperlunya dan diencer
kan dengan etanol sehingga diperoleh kurang lebih 50.000 cpm serta
diperiksa distribusi radioaktivitasnya dengan HPLC (lihat HPLC dan
Gambar 1). Adanya radioakti vitas di seki tar daerah elusi standar
retinyl palmi tat yang dapat mengganggu uj i akti vitas esteri fikasi
(1ihat uj i ARAT) memerlukan pemurnian terhadap stok [3HJ retinol.
Hasil pemurnian dengan HPLC diuapkan, dilarutkan kembali dalam
etanol dan diperikasa ulang distritNJsi radioaktivitasnya (Gambar
IB). Stok [3UJ retinol yang telah dimurnikan disimpan pada suhu
-80oC.
Kristal
kemurniannya
si masksimum
nya. Kristal
suhu -BOoC.
retinol (Serva Feinbiochima, Heidelberg,NY) deteksi
dengan Shimadzu UV Spektrofotometer berdasarkan adsorp
pada panjang gelombang 325 nm dan dihitung konsentrasi
retinol ini dilarutkan dalam elanol dan disimpan pada
798
Industry)
Chem. Co. )
Retinyl palmi tat dan DPPD (Wako Pure Chemical
dilarutkan dalam etanol. BSA dan palmitoyl-CoA (Sigma
dilarutkan dalam bufer kalium fosfat pH 7,4.
Bahan-bahan kimia lain yang digunakan memiliki kemurnian
komersial tinggi (99.5%).
Percobaan Pada Hewan. Ayam leghorn putih umur satu hari diberi
ransum bebas vitamin A ad libitum selama satu minggu. Kemudian di
beri ransum dengan tambahan beta-carotene sebesar ZO.OOO ug/kg diet
selama sepuluh hari. Setelah ayam dibunuh, ususnya diambil dan
dicuci dengan larutan NaCI dingin.
Persiapan Mukosa Usus. Usus dicuci dengan larutan NaCI dingin
untuk membersihkan sisa kotoran dan sisa-sisa makanan. Usus dibuka
dan lapisan mukosa dipisahkan dengan pengaduk. Lapisan mukosa ini
dibekukan langsung dalam nitrogen cair dan disimpan beku bila tidak
langsung dipakai.
Persiapan Microso.e. Mukosa beku dihomogenisasi dengan tiga
volume bufer Tris-HCl pH 7,5 yang mengandung 0,25 M Sucrose, 5mM
MgS04, dan Z5 mM KCl. Homogenat disentrifus dengan kecepatan ZO,OOO
g selama 15 menit pada suhu ZOC. Supernatan diambil dan dipindahkan
ke tabung lain, sedangkan pelet dihomogenisasi dan disentrifus
sekali lagi. Kedua supernatan dicampur dan disentrifus dengan kece
pat an 105,000 g selama satu jam pada suhu ZOC. Supernatan dibuang,
pelet disuspensikan dalam tiga volume bufer kalium fosfat pH 7,4 dan
disentrifus dengan kecepatan 105,000 g selama satu jam pada suhu
ZOC. Pelet dilarutkan kembali dala bufer yang sama.
Uji Aktivitas Acyl CoA: retinol Acyl Transferasi (ARAT). Uj iaktivitas ARAT didasarkan pada terbentunya radioaktif retinyl pal
mitat dari[3H] retinol dan palmitoyl-CoA (4). Substrat terdiri dari
[3H] retinol (55.000 cpm) dan 10 nmol retinol. Substrat ditambah
DPPD (0,8 ug) dan diuapkan di bawah aliran gas NZ' Selanjutnya 1.25mg BSA bebas asam-asam lemak dan kalium fosfat bufer pH 7,4 di
tambahkan sehingga tercapai volume 480 ul. Protein microsome (70 ug)
ditambahkan dan diirikubasi selama 5 menit pada suhu 370C. Reaksi
dimulai dengan penambahan 10 ul palmitoyl-CoA 15 nmol) dengan suhu
inkubasi 370 selama 15 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 2
ml etanol dingin dan lemak diekstrak dengan 2 x 3ml heksan. Empat ml
hasil ekstraksi heksan diuapkan di bawah aliran nitrogen dan residu-
799
nya dilarutkan dalam 200 ul etanol. 180 ul larutan ini diinjeksikan
ke HPLC dan difraksinasi setiap 30 detik. Fraksi retinyl palmitate
diambil dan ditambah larutan scintilasi dan dicacah radioaktivitas
nya dengan alat "Liquid Scintilation Counter". Hasil yang diperoleh
merupakan persentase [3H]retinyl palmi tat yang terbentuk selama
inkubasi. "Recovery" radioakti vi tas setelah penguj ian >80%.
HPLC High Pressure Liquid Chromatography. Sampel diinjeksikan
melalui "Rheodyne Injector" (1000 ul loop) dan dipisahkan komponen
komponennya pada kolom Licrosorb ODS 5 uM (4,6 x 250 cm). Sampel
dibawa keluar melalui kolom dengan larutan 100% metanol berkecepatan
alir 2 ml/menit dan tekanan 1500 psi. Larutan dipompa dengan bantuan
pompa Waters Model 510. Sampel dideteksi dengan detektor Hitachi
650-10 Liq.Chrom.Flourescence Spectrophotometer dan direkam pada
rekorder Hitachi Model 461-4203.
HASIL'DAN PEMBAHASAN
Distribusi Radioaktivitas [3Hlretinol. Distribusi radioaktivitas
stok (3H)retinol terlihat pada Gambar 1. Dengan pelarut metanol
kurang lebih 2% radioaktif terdeteksi pada retinyl pelmitat setelah'
9 - 11 menit. Radioaktif "asing" ini terpisah 30 detik dari retinyl
palmitat. Namun, bila pelarut yang dipakai adalahg etanol, radiok
tif tersebut terdeteksi tepat di daerah elusi retinyl palmi tat.
Meskipun dengan pelarut etanol waktu fraksinasi menjadi lebih pendek
namun radioaktif asing tersebut dapat mengakibatkan salah pendugaan
sebagai [3H)retinYI palmi tat hasil inkubasi uji aktivitas ARAT.
Demikian pula dengan pelarut metanol, meskipun radioaktif asing
tersebut terpisah selama 30 detik namun dengan semakin lamanya pe
nyimpanan radioaktif tersebut melebar dan menganggu hasil uji ARAT.
Untuk menjamin ketelitian percohaan, stok [3H)retinol dimurnikan dan
hasil pemurniannya terlihat pada Gambar 2.
Setelah pemurnian, radioaktif hanya muncul pada daerah elusi
standar retinol, sedangkan daerah retinyl palmitat hanya memberikan
radioaktif seki tar 20-50 dpm yang merupakan pack ground count saja
Stok yang telah dimurnikan ini dipakai untuk penelitian selanjutnya
dan secara periodik diperiksa kemurniannya.
800
~o
:10.- ~~~.-:.:-:E
20
c...Q
10
:I2
o1 2 3 ~ 5 6 1 6 II 10 11 12 13
Time(minute)
Gambar 1. Distribusi radioakti stok [3H] retinol. c==r,menunjukan kuantitas radioaktif, -,menunjukan standar retinol (1,5 - 3 menit) dan retinyl palmitat(7 -9 men it) .
Identifik8si Esterifik8si {3Hlretinol yang Dik8t81is ARAT. Untuk
mengidentifikasikan bahwa pembentukan [3H]retinYl palmitat adalah
hasil esterifikasi dari subtrat [3H]retinol dan palmitoyl-CoA yang
dikatalis oleh enzim yang terdapat dalam microsome, maka berbagai
pengaruh hadirnya komponen-komponen inkubasi dicobakan (Tabel 1).
Hasil ekstraksi heksan dari inkubasi dengan [3H]retinol saja (Perco
baan 1), tanpa palmitoyl-CoA (Percobaan 3), tanpa sumber enzim (Per
cobaan 5), dan dengan microsome yang telah di tidak-aktifkan (Per
cobaan 6) menghasilkan [3H]retinyl palmi tat dengan radioakti vitas
yang kurang lebih sama dengan background yang diperoleh pad a hasil
pemurnian stok [3H]retinol (Gambar 2). Dengan komponen inkubasi yang
lengkap (Percobaan 2) terbentuk [3H] retinyl palmitat sebesar 1553
DPM. Hasil ini menunjukan bahwa esterifikasi retinol hanya terjadi
apabila microsome sebagai sumber enzim yang mengkatalis reaksi ter-
801
sebut tersedia bersama-sama dengan subtrat [3H] retinol dan palmi
toyl-CoA.
60
40,,-...,
QQc:a-X'-"' 20 .-:E a..Q
5 r" -
:U1l1- ~o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
lime (minute)
Gambar 2. Distribusi radioaktif stok c3r:r) re- .tinol setelah pernumian denganHPLC.D,rnemmjukkan kuanti tasradi oakti f
Gambar 3 memperlihatkan distribusi radioaktif hasil ekstraksi dengan
heksan yang kemudian diinjeksikan ke HPLC. lnkubasi lengkap denganmicrosome menunjukan ada radioakti vi tas pada fraksi retinol dan
retinyl palmitat, sedangkan inkubasi lengkap dengan microsome yangtelah dipanaskan hanya menunjukkan radioakti vi tas di daerah elusi
retinol saja. Hasil ini menegaskan bahwa produk radioaktif yang
802
Tabel 1. P3ngaruh komponen inkubasi terhadp pembentukan[ H]retinyl palmi tat
Komponenlnkubasi 1 2
Percobaan
3 4 5 6-------------------------------------------------------------------
[3H]retinol + + + + + +retinol + + + + + +DPPD + + + + + +BSA + + + + + +
Palmitoyl-CoA + + + + + +Microsome + + + + + +
)[3H]retinylPalmitat (DPM)
82 1533 71 661 59 63
* Microsome dipanaskan pada suhu 800C selama 30 menit.
terelusi bersama standar retinyl-palmitat adlah [3H]retinyl-palmitat
yang berasal dari radioaktif retinol [15-3H] dan palmitoyl-CoA. Hal
ini tidak terjadi bila palmitoyl-CoA digantikan oleh asam palmitat
(9). Pene lit ian HELGERUD et al. (4) dan HELGERUD et al. (5) dengan
menggunakan substrat berlabel [1-14C]palmitat membuktikan pula bahwa
radioaktivitas yang ditemukan dari hasil ekstraksi lemak tidak hanya
terdapat pada fraksi retinol saja, tetapi juga di daerah fraksi
retinyl palmitat.
lnkubasi tanpa BSA menghasilkan radiokatif retinyl palmi tat
sebesar 43% dari hasil inkubasi lengkap (percobaan 4). Hal ini me
nunjukan bahwa BSA diperlukan dalam sistim inkubasi di sini. BSA
diduga memiliki struktur yang meyerupai cRBP (cellur Retinol Binding
Protein) yang ditemukan dalam sel-sel usus halus dan hati (10,11,12)
BSA mampu mengikat retinol sehingga memungkinkan retinol lebih
mudah mengalami esterifikasi daripada dalam bentuk bebas terlarut
dalam larutan organik (9).
BiEat-siEat EsteriEikasi Retinol Jari Microsome Usu Ayam. Untuk
memperoleh kondisi optimal bagi aktivitas esterifikasi retinol, maka
diteliti berbagai pengaruh kondisi inkubasi terhadap pembentukan
[3H]retinYl palmitat. Gambar 4 menunjukan bahwa pembentukan retinyl
palmi tat naik perlahan selama awal 5 menit inkubasi dan naik hampir
803
-g 10oor-
X-~C-o 4
2
O'.~N'"""--- r~ ....5 10
Time (minute)
10-~
-000or-x 5-~c..0
o 5Time (minute)
10
Ganbar 3. Pembentukan (7+1)retinyl palmi tat oleh microsom ususayam. A, Inkubasi lengkap dengan microsom; B, Inkubasi dengan microsom yang telah dip anask an ; (J, memmjukkan standar retinol (1~5 - 3 menit) dan retinylpalmi tat (r - 9 menit). Kondisi dan prosedur inkubasiseperti tersebut dalam materi clan meto de
liner dari 5 sampai 15 menit inkubasi. lnkubasi lebih lama dari 15
menit hanya memberikan sedikit kenaikan terhadap pembentukan [3H]re
tinyl pelmi tat (panel A). Esterifikasi naik secara linier dengan
konsentrasi protein microsome sampai 240 ug per inkubasi (panel B)
dan mencapai maksimum pada konsentrasi palmitoyl-CoA 60 uM (panel
C). Est~rifikasi retinol mencapai maksimal pada pH 6,6 dan meningkat
antara temperatur 37°C sampai 45°C. Tanpa BSA t~rbentuk [3H]retinYl
palmi tat sekitar 45% dari kondisi optimal yang dicapai dengan mg/mlBSA.
KESIMPULAN
Dari keseluruhan hasil di atas dapat disimpulkan bahwa identifi
kasi pembentukan [3H]retinYl palmitat dari inkubasi [3H]retinol clan
804
palmitoyl-CoA beserta microsom dapat dideteksi dengan bantuan HPLC.
Aktivitas esterifikasi retinol pada mucosa usus ayam ini dikatalisis
oleh Acyl-CoA:retinol acyl traferase yang terdapat dalam microsome.
Kondisi optimal ARAT ini dapat dikarakterisir dan dapat digunakan
untukmenentukan aktivitas terhadap berbagai perlakuan percobaan.
UCAPAN TERIMKASIH
Terimaksih yang sebesar-besarnya kepada Prof. Soichi Masushige
atas segal a bimbingannya selama penulis melaksanakan penelitiannya
kepada Dr. Kato atas saran dan kritiknya; kepada Mr. Furusho atas
saran dan bantuan teknis yang diberikan; serta Mr. Ota yang telah
memberi ijin untuk menggunakan fasili tas di Pusat Radioisotop Tokyo
University of Agriculture yang dipimpinnya.
DAFTAR PUSTAKA
1. BAURENFEIND, J.C., Carotenoid vitamin A precursors and analog infoods and feeds, J. Agric. Food Chem. 20-3 (1972) 456.
2. OLSON, J.A., The conversion of radioactive B-carotene into
vitamin A by the rat intestine in vivo, J. Biol. Chem. 2362 (1961) 349.
3. GOODMAN, D.S., Vitamin A metabolism, Federation Proc. 39 (1980)2716.
4. HEGERUD, P, PETERSON, L.B., and NORUM, K.R., Acyl CoA:retinol
aclyltransferase in rat small intestine: its activity and someproperties of the enzymic reaction, J.Lipid Res 23 (1982) 609.
5. HEGERUD, P, PETERSON, L.B., and NORUM, .K.R., Retinol esterification by microsome from the mucosa of human small
intestine;evidence for acyi-coenzyme A retinol acyl transferaseactivity, J. Clin. Invest. 71 (1982) 747.
6. MAC DONALD, P.N., and ONG, D.E., Evidence for a lecithin
retinol acyltransferase activity in the rat small intestine,J.Biol Chem. 263-25 (1988) 12478.
805
7. FUTTERMAN, S., and ANDREWS, J.S. The composition of livervitamin A ester and the synthesis of vitamin A ester by liver
microsome, J. BioI. Chem. 239-12(1964)4077
8. SKLAN, D., Carotene-cleavage activity in chick intestinal mucosa
cytosol:association with a high-moleculer-weight lipid-protein
aggregate fraction and partial characterization of the activity, British J. Nutr. 50 (1983)417
9. ROSS, A.C., Retinol esterification by rat liver microsome;evidence for a fatty acyl coenzyme A: retinol acytransferese.
J.Biol Chern. 257-5 (1982) 2453.
10. ONG, D.E., KAKKAD, B, and MAC DONALD, P.N., . Acyl-CoA-Inde
pendent esterification of retinol bound to cellular
retinol-binding protein (type II) by microsome from rat smallintestine, J.Biol.Chem 6(1987)2729
11. OGN, D.E., MAC DONALD, P.N., and GIBITOSI, A.M., Esterification
of retinol in rat liver; Possible participication by cellular
'retinol-binding protein and cellular retinol-binding proteinIL, J. BioI. Chern. 263-12 (1988) 5789.
12. YOST, R.W., HARRISON, E.H., and ROSS, A.C., Esterification byrat liver microsome os retinol bound to cellular retinol
binding protein, J. Biol.Chem 5(1989) 18693
806
20 C3-oo 2o,....
x-~a...o
o
A
5 is 25 35
Time (minute)
10- B0 00,....xc-'"
~C-O
o 60 120 240
Microsomal Protein f,ug}
-0._01::1,....
X-10~C-0;)
o30 60 120
Palmitoyl-CoA CuM)
00o-J
5D
f(E
2F-0.4
000 0o ':
,....,.... ..
ft~1X ;2
~c-C- O2
°01
aLl.,,. 0
10[) 37!;J50 2.55
261:1j!;
pH
Temperature r~C)Bovine Serum Albumin(mg/ml)
Gani>ar4. Pengaruh-penganil waktu (A); konsentrasi protein rnicrosorre(B); konsentrasi palrnitoyl-CoA(C); pH(D); suhu(EJ; clan. BSA(F). Setiap titik adalah nilai rata-rata hasil percobaan secara duplo yang telah dikoreksidengan kontrol dari inkti:>asi tanpa rnicrosorre atau rengan rnicrosorreyang telah dipanaskan