-
Neue Methoden zur Anwendung
von Lipasen in der organischen Synthese
DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultt fr Chemie der Ruhr-Universitt Bochum
vorgelegt von Diplom-Chemiker
Wolfgang Wiesenhfer aus Dsseldorf
Mlheim an der Ruhr
2004
-
Referent: Professor Dr. M. T. Reetz
Korreferent: Professor Dr. M. Feigel
Tag der mndlichen Prfung: 22.07.04
-
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Oktober 2001 bis Juni 2004 unter der Leitung
von Prof. Dr. M. T. Reetz am Max-Planck-Institut fr Kohlenforschung in Mlheim an der
Ruhr angefertigt.
Herrn Prof. Dr. M. T. Reetz danke ich sehr herzlich fr die interessanten Themenstellungen,
die gewhrte Freiheit bei der Bearbeitung der Themen und das dabei stets entgegengebrachte
Vertrauen, die Mglichkeit unter hervorragenden Bedingungen interdisziplinr zu arbeiten,
sowie die stete Gesprchsbereitschaft bei fachlichen und darber hinausgehenden Fragen.
Herrn Prof. Dr. M. Feigel danke ich fr die bernahme des Korreferats und Herrn Prof. Dr.
M. Muhler fr sein Auftreten als Drittprfer.
-
Herrn Dr. Giancarlo Franci danke ich sehr fr die intensive und fruchtbare Zusammenarbeit
bei Versuchen mit ionischen Flssigkeiten, die Einfhrung in das Gebiet der Hochdruck-
chemie, sowie fr die vielen Diskussionen fachlicher und nicht fachlicher Art.
Fr die fachliche Zusammenarbeit auf dem Gebiet Selektion bedanke ich mich bei Herrn Dr.
Andreas Vogel.
Allen Partnern des EU-Projektes Evocatal Directed Evolution of Enantioselective Bio-
catalysts im In- und Ausland bin ich zu dank verpflichtet. Namentlich zu erwhnen sind:
Prof. Dr. W. Quax, Dr. Melloney J. Drge, Ykelien Boersma, Prof. Dr. K. E. Jger, Dr.
Thorsten Eggert, Aileen Funke, Prof. Dr. B. W. Dijkstra, Dr. Gertie van Pouderoyen, Tjaard
Pijning, Dr. R. Verger, Dr. Detlef Stckigt und Dr. J. M. Hilmer
Den Arbeitskreismitgliedern danke ich fr ein ausgezeichnetes Arbeitsklima, Hilfsbereitschaft
und gemeinsame Unternehmungen.
Herrn Prof. W. Leitner, Dr. Nils Theyssen und allen Mitarbeitern der Versuchsanlage und des
Drucktechnikums danke ich fr die sehr angenehme Arbeitsatmosphre in diesem Teil des
Max-Planck-Instituts, insbesondere mchte ich aber Herrn Lder fr das schnelle Beheben
von Kompressorschden danken.
Meinen Laborkollegen Stefanie Dehne, Dr. Andreas Eipper, Dr. Hiromasa Oka und Dr. Thor-
sten Sell danke ich fr die gute Zusammenarbeit im Labor.
Den Chemielaboranten Christian Dams, Bianca Schuchardt und Lars Winkel danke ich fr ihr
Engagement und ihre sorgfltigen Arbeiten.
Stefanie Dehne, Dr. Giancarlo Franci, Bianca Schuchardt, Dr. Nils Theyssen und
Dr. Andreas Vogel danke ich fr sorgfltiges und kritisches Korrekturlesen der vorliegenden
Arbeit.
-
Der GC-Abteilung und insbesondere Frau J. Rosentreter und Herrn D. Stoffels danke ich fr
die stets schnelle und zuverlssige Durchfhrung unzhliger GC-Analysen.
Fr die Durchfhrung von HPLC-Analysen danke ich Frau H. Hinrichs, Frau S. Schrder und
Herrn A. Deege. Herrn G. Breitenbruch danke ich fr die Untersttzung bei Arbeiten mit
HPLC-Pumpen.
Allen Mitarbeitern der MS-Abteilung danke ich ausnahmslos fr die Messung und Aus-
wertung zahlreicher Massenspektren.
Herrn R. Ettl und Herrn Dr. R. Mynott danke ich fr die Messung und die Hilfe bei der
Auswertung von NMR-Spektren.
Herrn Herrn K. Grfenstein, W. Kersten und Herrn H.-W. Schmidt danke ich fr die
Anfertigung und den Umbau von Autoklaven und sonstigen Apparaturen.
Den anderen Serviceabteilungen des Instituts bin ich fr eine Vielzahl von Analysen ebenfalls
zu Dank verpflichtet.
Frau R. Barabasch und Herrn Dr. W. J. Richter danke ich fr Literaturrecherchen und
Untersttzung bei der Beschaffung von Literatur und Informationen.
Frau Rathofer und ihren Kolleginnen gebhrt ein groes Dankeschn fr die Bewltigung
jeglicher organisatorischer Probleme.
Bei meinem Kollegen Marcus Hermes bedanke ich mich sehr fr die computertechnische und
sonstige Untersttzung.
Der Max-Planck-Gesellschaft zur Frderung der Wissenschaften und der Europischen Union
danke ich fr finanzielle Untersttzung.
Ein besonderer Dank gilt meiner Freundin Stefanie und meinen Brdern Michael und Frank.
Der grte Dank gebhrt meinen Eltern, die mir die Ausbildung ermglicht und mich immer
untersttzt haben.
-
Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits verffentlicht:
M. T. Reetz, W. Leitner, G. Franci, W. Wiesenhfer
Patentanmeldung, Deutsche Offenlegungsschrift: DE-A 10201778 A1, 17.01.2002 (Inter-
nationale Verffentlichungsnummer: WO 03/060057 A2 und A3)
Verfahren zu Durchfhrung von enzymatischen Reaktionen in ionischen Lsungsmitteln
(Method for carrying out enzymatic reactions in ionic solvents)
M. T. Reetz, W. Wiesenhfer, G. Franci, W. Leitner
Chem. Commun. 2002, 992-993
Biocatalysis in ionic liquids: batch-wise and continuous-flow processes using supercritical
carbon dioxide as the mobile phase
M. T. Reetz, P. Tielmann, W. Wiesenhfer, W. Knen, A. Zonta
Adv. Synth. Catal. 2003, 345, 717-728
Second Generation Sol-Gel Encapsulated Lipases: Robust Heterogeneous Biocatalysts
M. T. Reetz, W. Wiesenhfer, G. Franci, W. Leitner
Adv. Synth. Catal. 2003, 345, 1221-1228
Continuous Flow Enzymatic Kinetic Resolution and Enantiomer Separation using Ionic
Liquid/Supercritical Carbon Dioxide Media
-
Und wenn ich prophetisch reden knnte
und alle Geheimnisse wsste
und alle Erkenntnisse htte;
wenn ich alle Glaubenskraft bese
und damit Berge versetzen knnte,
htte aber die Liebe nicht,
wre ich nichts
1. Korinther 13, 2
-
Entscheidend ist auf dem Platz
Addi Preiler
-
Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
1.1 Katalyse und Katalysatoren 1
1.2 Chiralitt 2
1.3 Strategien zur Verbesserung der katalytischen Eigenschaften von Enzymen 11
1.4 Nachhaltige Chemie 17
3.1 Biokatalyse in ionischen Flssigkeiten 26
3.2 Kinetische Racematspaltung in ionischer Flssigkeit/scCO2 35
3.3 Spezielle Separierungsstrategien nach lipasekatalysierter kinetischer Racematspaltung 51
3.4 Kinetische Racematspaltung unter Verwendung von ionischen Tags 56
3.5 Lipasenreaktionen in flssigem Polyethylenglykol 72
4.1 Bacillus subtilis Lipase 83
4.2 Synthese kurzkettiger Phosphonsureester und deren Anwendung im
Kristallisationsexperiment 85
5.1 Phage Display als Werkzeug fr die gerichtete Evolution 93
5.2 Neue Materialien fr Phage Display-Anwendungen 101
5.3 Untersuchungen zur Stabilitt von Phosphonsureestern 111
5.4 Cell Sorting zur Selektion enantioselektiver Enzyme 114
Inhaltsverzeichnis I
Abkrzungsverzeichnis III
1 Einleitung 1
2 Aufgabenstellung 25
3 Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 26
4 Arbeiten zur Aufklrung der Enantioselektivitt von Lipase Varianten 83
5 Selektion enantioselektiver Enzymmutanten 93
-
Inhaltsverzeichnis II
6 Zusammenfassung und Ausblick 134
7 Experimenteller Teil 137
7.1 Materialien und Methoden 137
7.2 Biokatalyse in ionischen Flssigkeiten und scCO2 145
7.3 Synthesen von ionischen Tags 163
7.4 Synthese von Startmaterial fr die Katalyse 172
7.5 Kinetische Racematspaltung unter Verwendung von ionischen Tags 173
7.6 Biokatalyse in Polyethylenglycol (PEG) und scCO2 177
7.7 Synthesen von Phosphonsureestern fr die Kristallisation 186
7.8 Synthesen von Phosphonsureestern fr Phage Display Anwendungen 195
7.9 Synthesen von fluoreszenzmarkierten Substanzen 213
8 Literaturverzeichnis 228
-
Abkrzungsverzeichnis III
Abkrzungsverzeichnis
AAV Allgemeine Arbeitsvorschrift IL ionische Flssigkeit
abs. absolutiert IR Infrarotspektroskopie
q. quivalent(e) J Kopplungskonstante
arom. aromatisch KF Khlfalle
[BMIM] 1-Butyl-3-methylimidazolium LipA Lipase A von Bacillus subtilis
br breit (NMR, IR) lyo. Lyophilisat
Bu Butyl m Multiplett, mittel
BTA Bis-trifilic-amide ((CF3SO2)2N-) M Molmasse; Magnetrhrplatte
c Konzentration mbar Millibar
CaL B Candida antarctica Lipase B Me Methyl
CP Kompressor min Minuten
CSTR continuous stirred tank reactor MS Massenspektrometrie
d Dublett; Tag m/z Masse/Ladung
Chemische Verschiebung; Deformationsschwingung
NMP N-Methylpyrrolidin-2-on
DC Dnnschichtchromatographie NMR Nuclear Magnetic Resonance
dest. destilliert NV Nadelventil
DMF N,N-Dimethylformamid p para
DSC Di-(N-succinimidyl)carbonat P Druck
EMIM 1-Ethyl-3-methylimidazolim PEG Polyethylenglycol
ee enantiomeric excess PR Druckminderer
EI Elektronenstoionisation PT Druck- und Temperaturkontrolle
Emmax Emissionsmaximum R Reaktor
ESI Elektronensprayionisation rac racemisch
eV Elektronenvolt RT Raumtemperatur
Exc Extinktionsmaximum s Singulett; stark
FI Fluoreszenzintensitt S Substrat; Selektivitt
G Gasuhr scCO2 berkritisches Kohlendioxid
GC Gaschromatographie t Triplett; Tonne
h Stunde T Temperatur
HP HPLC-Pumpe w schwach
HPLC high performance liquid chromatography
-
Einleitung 1
1 Einleitung
1.1 Katalyse und Katalysatoren
Die chemische Industrie besitzt in allen Industrienationen eine Schlsselfunktion, da sie
Chemikalien in alle anderen Industriezweige liefert. Nahezu alle Gter, die dabei aus Erdl,
Gas, Kohle und nachwachsenden Rohstoffe hergestellt werden, durchlaufen dabei mindestens
einen katalysierten Schritt. Produkte die in diesen Lndern mittels Katalysatoren hergestellt
werden und Prozesse in denen sie angewandt werden, machen dabei durchschnittlich ca.
des gesamten Bruttoinlandproduktes aus.[1] Am Beginn des neuen Jahrtausends berschritt der
Katalysatormarkt erstmals die Zehn Milliarden Dollar Grenze und stellt nach wie vor einen
wachsenden Wirtschaftszweig dar.[1, 2] Die Erforschung von Katalysatoren stellt dabei keine
eigenstndige Wissenschaft dar, sondern ist vielmehr ein verzweigtes und interdisziplinres
Fachgebiet, das sich aus verschiedenen Forschungsgebieten wie Anorganischer Chemie,
Organischer Chemie, Biochemie, Verfahrenstechnik, Materialforschung, Physikalischer
Chemie und Theoretischer Chemie zusammensetzt. Katalysatoren werden aber nicht nur von
Menschen in technischen Prozessen verwendet, sondern treten nahezu immer und berall auf.
Dies wurde bereits von Berzelius im Jahre 1836 festgestellt:[3]
Wir bekommen begrndeten Anlass zu vermuten, dass in lebenden Pflanzen und
Tieren Tausende von katalytischen Prozessen zwischen den Geweben und
Flssigkeiten vor sich gehen.
Allerdings dauerte es ber 100 Jahre bis Pauling mit seinem Postulat, dass Biokatalysatoren
den bergangszustand einer chemischen Reaktion stabilisieren, die Grundlage fr die heutige
moderne Katalyseforschung legte.[4, 5] Die fundamentale Eigenschaft von Katalysatoren
chemische Reaktionen zu beschleunigen hat so die Entwicklung der modernen chemischen
Industrie erst ermglicht. Neben der Geschwindigkeit knnen Katalysatoren auch den Verlauf
von chemischen Reaktionen beeinflussen und so Chemo-, Regio- und Stereoselektivitt
lenken. Auf diese Eigenschaft von Katalysatoren soll im nchsten Kapitel nher eingegangen
werden.
-
Einleitung 2
1.2 Chiralitt
Der Markt fr optisch reine Produkte ist in den letzten Jahren stetig gewachsen, besonders auf
Grund der gestiegenen Nachfrage in der Pharamzie, Agrochemie, Duft- und Aroma-
industrie.[6, 7] So stellen Lipitor und Zocor, die beiden Top-Sale-Drugs des Jahres 2002 mit
einem Gesamtvolumen von 14 Milliarden Dollar, enantiomerenreine kleine Molekle dar
(beide Prparate werden zur Regulierung des Cholesterinspiegels eingesetzt).[6]
N
F
O
NH
O
OOHOH
2
Ca2+
O
O
OOH
O
Lipitor Zocor
erenreinen
Verbindungen im Jahr 2000 die 100 Milliarden Dollar Grenze deutlich berschritt.
Abbildung 1.1 Struktur der beiden Blockbuster des Jahres 2002 Lipitor und Zocor
Enantiomere sind chemische Verbindungen, die sich wie Bild und Spiegelbild verhalten, sich
also nur in ihrem rumlichen Aufbau unterscheiden. Da das Leben auf molekularer Ebene im
Wesentlichen durch chirale Erkennung gesteuert wird, verwundert es nicht, dass biologische
Systeme Enantiomerenpaare als zwei unterschiedliche Verbindungen erkennen und auch
unterschiedlich auf diese reagieren knnen. So schmeckt die natrlich vorkommende
Aminosure L-Asparagin bitter, whrend das knstlich hergestellte D-Asparagin als s
empfunden wird. Seit der allgemein bekannten Arzneimittelkatastrophe im Jahre 1957 mit
dem damaligen Prparat Contergan wurde das Arzneimittelrecht im Hinblick auf den
Einsatz chiraler Wirkstoffe deutlich verschrft. So fordert eine Richtlinie der US-
amerikanischen Food and Drug Administration von 1992 den Einsatz von enantiomeren-
reinen Produkten, sofern die gewnschte Wirkung nicht fr beide enantiomere Wirkstoffe
eindeutig nachgewiesen ist.[7] Fr die Zulassung von neuen chiralen Medikamenten mssen
daher auch alle Stereoisomere selektiv hergestellt und auf Nebenwirkungen getestet werden.
Chemiker werden so mehr und mehr in Verantwortung gezogen Methoden zu entwickeln die
es ermglichen, enantiomerenreine Verbindungen auch im industriellen Mastab zu
synthetisieren. So ist es nicht verwunderlich, dass der Umsatz mit enantiom
-
Einleitung 3
1.2.1 Methoden zur Gewinnung von optisch aktiven Substanzen
Prinzipiell existieren vier Methoden, die grotechnisch angewendet werden, um enantio-
merenreine Verbindungen herzustellen bzw. zu gewinnen.[7-9]
Isolierung von Naturstoffen aus dem chiralen Pool
Gezielte Steuerung mikrobiologischer Stoffwechselprozesse und Fermentation
Racematspaltung
Umwandlung von prochiralen Verbindungen in eine optisch aktive Substanz
Keiner der vier Methoden kann alleine zu einem Fachgebiet der chemischen oder
biologischen Forschung zugeteilt werden. Ebenso ist auch der bergang der Methoden
untereinander flieend, was im Folgenden nher erlutert wird.
Einige optisch aktive Substanzen knnen aus dem so genannten chiralen Pool gewonnen
werden. Der Einsatz von Naturstoffen wie Milchsure, Aminosuren, Kohlenhydrate oder
Terpene ist wirtschaftlich nur rentabel, wenn eine effiziente Isolierung mglich ist. Da diese
Verbindungen in der Natur bereits in hohen Enantiomerenreinheiten vorhanden sind, kann auf
eine weitere Aufreinigung in den meisten Fllen verzichtet werden. Der Nachteil dieser
Methode liegt in der Limitierung der zugnglichen Produkte aus Naturstoffen, die zumeist nur
in einer optisch aktiven Form vorkommen.
Als eine Weiterentwicklung dieser Methode kann die Ausnutzung von fermentativen oder
mikrobiologischen Prozessen angesehen werden. Sie sind ntzliche Methoden zur Gewin-
nung von komplexen chiralen Moleklen, die zumeist in einem Schritt verlaufen. Dabei fallen
die enantiomerenreinen Verbindungen als Stoffwechselprodukte der Mikroorganismen an. So
knnen z. B. Aminosuren, Vitamine oder Hormone ausgehend von billigen Chemikalien
(vorwiegend Kohlenhydrate), die den Mikroorganismen als Energiequelle dienen, gewonnen
werden. Der Nachteil dieser Methode liegt ebenfalls in der Limitierung der zugnglichen
Produkte, die mikrobielle Metabolite darstellen. Ein Teil dieser Probleme kann durch
Metabolic System Engineering behoben werden, indem bestimmte Stoffwechselschritte im
Organismus unterdrckt bzw. gefrdert werden.[10] Diese Art der Beeinflussung ist technisch
mglich und wird industriell bereits angewandt, stellt aber nach wie vor eine sehr komplexe
und schwierige Aufgabe dar, da das Blockieren von Stoffwechselfunktionen oft ungeahnte
Auswirkungen hat.[11] Die Spaltung von Racematen in die reinen Enantiomere wurde bereits
vor ber einhundert Jahren eingesetzt. Bei der klassischen Racematspaltung durch
Kristallisation beruht die Trennung auf der bevorzugten Kristallisation eines Enantiomers,
whrend das andere Stereoisomer in Lsung bleibt. Diese Trennung ist technisch nur
durchfhrbar, wenn die Racemate als Konglomerate vorliegen, d. h. mechanische Mischungen
-
Einleitung 4
von Kristallen der beiden Enantiomere sind.[8] Pasteur fhrte als erster eine solche
Racematspaltung im Jahre 1848 bei der Kristallisation von Weinsuresalzen durch.[12] Leider
kristallisieren weniger als 10 % der Racemate als Konglomerate. Sollten die Racemate eine
homogene feste Phase ausbilden, so knnen die Enantiomere dennoch durch Kristallisation
getrennt werden. Dazu werden sie in diastereomere Salze berfhrt, die sich in ihren
Lslichkeiten teilweise stark unterscheiden. Racematspaltung durch Kristallisation wird im
grotechnischen Mastab durchgefhrt.[9] Das chirale Hilfsreagenz muss dazu mindestens in
stchiometrischen Mengen eingesetzt werden. Teilweise wird es sogar eigens fr den
Trennprozess synthetisiert. Trotz des Nachteils des notwendigen Trennschrittes stellt diese
Methode ein wichtiges Werkzeug in der industriellen Gewinnung von enantiomerenreinen
Substanzen dar. Prinzipiell knnen Racemate auch durch chromatographische Methoden
(HPLC) an chiraler Phase separiert werden. Die Kapazitt dieser Methode ist allerdings
beschrnkt und auf Grund des hohen Lsemittelverbrauches eine sehr kostenintensive
Methode, die nahezu nur dann eingesetzt wird, wenn alle anderen Methoden nicht zum
gewnschten Erfolg fhren.
Eine weitere Methode zur Trennung von racemischen Gemischen ist die kinetische
Racematspaltung. Diese erfolgt dadurch, dass eines der Enantiomere mit einem chiralen
Katalysator schneller umgesetzt wird als das andere. Der chirale Katalysator bertrgt dabei
seine chirale Information auf das Substrat, wodurch es zur Vervielfltigung von chiraler
Information kommt. Der Katalysator kann ein klassischer chiraler bergangsmetallkomplex
oder ein Biokatalysator (meist ein Enzym) sein.[13, 14] Besonders die Verwendung von
Enzymen als Katalysatoren fr kinetische Racematspaltungen findet immer mehr Anwendung
in der chemischen Industrie.[9, 15] Dies ist erstaunlich, da die Anwendung dieser Methode zwei
grundlegende Nachteile besitzt. Zum einen muss nach der kinetischen Racematspaltung
immer ein Trennschritt erfolgen, zum anderen betrgt die maximale Ausbeute 50 %. Das
Enantiomer mit der falschen absoluten Konfiguration muss entweder verworfen oder
recycliert werden. Auf dieses spezielle Forschungsgebiet soll im Kapitel 1.2.2.2 nher
eingegangen werden. Neuere Methoden, wie die dynamische kinetische Racematspaltung,
versuchen das Substrat in situ zu racemisieren, wodurch theoretische Ausbeuten von 100 %
mglich sind.[16]
Enantiomerenreine Substanzen knnen auch durch Umwandlung von prochiralen
Substraten in optisch aktive Verbindungen, in Gegenwart eines chiralen Hilfsreagenzes oder
eines chiralen Katalysators, hergestellt werden, was man asymmetrische Synthese nennt.[17]
Die chirale Information des Hilfsreagenzes bzw. des Katalysators wird dabei auf das Produkt
-
Einleitung 5
bertragen. Die Anwendung von chiralen Hilfsreagenzien ist nur dann sinnvoll, wenn es
mglich ist, die chiralen Hilfsstoffe nach der Reaktion effizient wiederzugewinnen, da es sich
sonst um einen sehr abfallintensiven Prozess handelt. Separierungsschwierigkeiten und die
notwendigen stchiometrischen Mengen der chiralen Hilfsreagenzien beschrnken den
grotechnischen Einsatz daneben erheblich. Eine konomischere Methode ist die Ver-
wendung von chiralen Katalysatoren. Bei dieser Art der asymmetrischen Synthese findet eine
Vervielfltigung der chiralen Information des Katalysators statt.[18] Als Katalysatoren knnen
chirale bergangsmetallkomplexe, Biokatalysatoren oder Organokatalysatoren eingesetzt
werden.[9, 15, 19, 20] Alle drei Katalysatorsysteme stellen leistungsfhige Methoden zur Gewin-
nung von enantiomerenreinen Verbindungen dar. Der Aktualitt und Wichtigkeit dieses
Forschungsgebietes wurde mit der Nobelpreisverleihung im Jahre 2001 an Knowles, Noyori
und Sharpless fr ihre Verdienste, auf dem Gebiet der asymmetrischen Katalyse mit
bergangsmetallkomplexen, Nachdruck verliehen.[20-22] Gewrdigt wurden hier Arbeiten die
bahnbrechende Erfolge mit chiralen bergangsmetallkomplexen verzeichneten. Allerdings ist
die grotechnische Anwendung dieser Katalysatoren oftmals durch die hohen Katalysator-
kosten beschrnkt. Im Gegensatz dazu finden Verfahren mit Enzymen als asymmetrischen
Katalysatoren immer mehr praktische Anwendung.[9, 15, 23, 24]
Welche Methode die beste bzw. wirtschaftlichste ist, hngt von vielen Faktoren ab. Alle
Methoden haben wie im Text angesprochen Vor- und Nachteile, die im Einzelfall gegen-
einander abgewogen werden mssen.
1.2.2 Biokatalyse
In den letzten zwanzig Jahren hat sich die Biokatalyse neben vielen anderen Methoden als ein
Standardwerkzeug in der organischen Chemie etabliert,[25, 26] insbesondere auf dem Gebiet der
enantioselektiven Katalyse.[9] Neben Enzymen knnen auch Antikrper[27, 28] und
Ribozyme[29-33] katalytische Aktivitt besitzen und somit als Biokatalysatoren angesehen
werden. Allerdings ist die katalytische Aktivitt und Stabilitt der beiden zuletzt genannten
Katalysatortypen begrenzt, so dass fr diese noch keine synthetische Anwendung besteht.
Ein entscheidender Aufschwung fr den Einsatz von Enzymen in der organischen Synthese
wurde von Klibanov durch deren Verwendung in organischen Lsungsmitteln bewirkt,[34]
obwohl die Anwendung im nichtwssrigen Medium schon im Jahr 1900 beschrieben worden
ist.[35] Die hohe Attraktivitt von Enzymen im Vergleich zu konventionellen Katalysator-
systemen begrndet sich vor allen Dingen in ihrer Effizienz Reaktionen zu beschleunigen und
-
Einleitung 6
ihrer hufig exzellenten Chemo-, Regio-, Diastereo- und Enantioselektivitt sowie ihrer
Anwendbarkeit unter milden Bedingungen.
Allerdings ist die Anwendung von Biokatalysatoren in der organischen Synthese nicht trivial
und bringt teilweise erhebliche Probleme mit sich, bedingt durch die Tatsache, dass bislang
nur eine beschrnkte Anzahl an Biokatalysatoren verfgbar ist und diese meist nur ein
beschrnktes Substratspektrum und eingeschrnkte operationelle Stabilitt besitzen.[24] Durch
Genomprojekte wird seit etlichen Jahren versucht, neue Enzyme zu identifizieren und somit
das Angebot an Biokatalysatoren zu vergrern. Daneben knnen Immobilisierungstechniken
die operationelle Stabilitt deutlich erhhen und somit die Desaktivierung von Enzymen
verhindern.[36-40] Inzwischen sind darber hinaus eine Vielzahl von Strategien, wie z.B.
gerichtete Evolution, entwickelt worden, um die Aktivitt und Selektivitt von Biokatalysa-
toren erheblich zu verbessern (vgl. Kapitel 1.3.1).
Bis zum heutigen Tag sind ber 3000 Enzyme identifiziert und charakterisiert worden, von
denen besonders die Enzymklasse der Hydrolasen mit ca. 65 % die strkste Nutzung
erfhrt.[41] Aus der Enzymklasse der Hydrolasen wird allerdings ein Enzym besonders hufig
verwendet, nmlich die Enzymgruppe der Lipase, auf die im nchsten Kapitel eingegangen
werden soll.
1.2.2.1 Lipasen
Lipasen (Triacylglycerin-Hydrolasen, EC 3.1.1.3.) gehren zur Enzymklasse der Hydrolasen.
Sie katalysieren im Stoffwechsel von Pilzen, Bakterien und allen hheren Lebewesen die
Spaltung von Triacylglyceriden. Die erstmalige Isolierung einer Lipase (aus Schweine-
Pankreas) gelang Willsttter im Jahre 1923.[42] Eine vollstndige Aufreinigung gelang jedoch
erst 1969 durch Verger.[43] Lipasen werden meist durch Extraktion von tierischem oder
pflanzlichem Gewebe sowie durch Kultivierung von Mikroorganismen gewonnen. Sie sind
grenzflchenaktive Enzyme, was bedeutet, dass ihre Aktivitt erst bei Vorliegen einer
Phasengrenze stark gesteigert wird.[44] Diese Tatsache stellt den Hauptunterschied zu
Esterasen dar. Gegenber wasserlslichen Substraten zeigen Lipasen solange geringe
Aktivitt, bis die kritische Mizellenkonzentration der Substrate berschritten und eine Fett-
Wasser-Grenzflche gebildet wird. Als Ursache fr diese Grenzflchenaktivierung gilt das
Vorliegen einer -helikalen, hydrophoben Domne (auch Deckel oder Lid genannt), die das
aktive Zentrum verbirgt. Erst bei Kontakt mit einer hydrophoben Schicht findet eine
Konformationsnderung der Lipase statt, die den Deckel anhebt und das aktive Zentrum
freisetzt. Durch Kristallisation der Lipase von Mucor miehei mit und ohne Inhibitor sowie
-
Einleitung 7
durch Kristallisation der Lipase aus der menschlichen Bauchspeicheldrse konnten anhand
der Strukturaufklrung eine Konformationsnderung des -helikalen Deckels durch den
Inhibitor besttigt werden.[45-47] Das aktive Zentrum von Lipasen, die sogenannte katalytische
Triade, wird aus den Aminosuren Asparagin, Histidin und Serin gebildet.[48] In einigen
Fllen (z.B. bei der Lipase aus Geotrichum candidum) ist die Aminosure Asparaginsure
gegen Glutaminsure ausgetauscht.[49] Abbildung 1.2 zeigt den allgemein anerkannten
Reaktionsmechanismus einer Esterhydrolyse.
O
O
NH NH O
Ser
RRO
O
O
O NH N+
HRRO
O
OSer
-ROHO
O
NH N
SerO
O R
Nu
O
O
NH N+
HRO
OSer
Nu
RO
Nu Abbildung 1.2 Mechanismus der Umsetzung von Estern mit Nucleophilen im aktiven Zentrum einer Lipase durch die katalytische
Triade
Die Imidazolgruppe am Histidin erhht die Nucleophilie des Serin-Restes, whrend die
Aspartat-Carboxylgruppe die durch die Protonierung des Histidins entstandene positive
Ladung stabilisiert. Die Hydroxylfunktion des Serins greift nucleophil am Carbonylkohlen-
stoff des Esters an, woraufhin der Acyl-Enzym-Komplex gebildet wird. Der so gebildete
tetraedrische bergangszustand wird ber Wasserstoffbrckenbindungen stabilisiert. Der
Acyl-Enzym-Komplex wird im Fall der Esterhydrolyse durch Wasser als Nucleophil ange-
griffen. Nach Durchlaufen einer zweiten tetraedrischen Zwischenstufe wird das Produkt
gebildet. In der Vergangenheit wurden bereits einige Strukturen grerer Lipasen aufge-
klrt.[50] Es zeigte sich, dass alle einem speziellen Faltungsmuster folgen, der sogenannten
,-Hydrolasefaltung.[51] Dieses charakteristische Faltungsmotiv besteht aus acht, fast voll-
stndig parallelen -Faltblatt-Strngen, welche durch -Helices flankiert werden (siehe
-
Einleitung 8
Abbildung 1.3). Die rot dargestellten -Faltblatt-Strukturen sind gegeneinander verdreht, so
dass 1 und 8 etwa im rechten Winkel zueinander stehen. Verbunden werden die einzelnen
-Faltblatt-Strnge durch die in blau dargestellten -Helices A bis F.
Abbildung 1.3 , -Hydrolasefold nach OLLIS: roter Pfeil = -Faltblatt, blauer Zylinder = -Helix. Die katalytische Triade ist
schematisch in Form schwarzer Kugeln dargestellt, als angreifendes Nukleophil ist hier Serin gewhlt und als Sure Aspartat.
Lipasen knnen, wie in Kapitel 1.2.1 beschrieben, bei enantioselektiven Reaktionen
eingesetzt werden, wobei sie als chiraler Katalysator in kinetische Racematspaltungen oder
Desymmetrisierungen zum Einsatz kommen knnen. Daneben stellen sie aber auch ein
leistungsfhiges Werkzeug in der Totalsynthese von komplexen Moleklen und insbesondere
in der Schutzgruppenchemie dar, da mit ihnen Esterbindungen unter milden Bedingungen
gio- und stereoselektiv geknpft bzw. verseift werden knnen.[52] Auf den Einsatz von
nchsten Kapitel einge-
gangen werden.
erbindungen herzustellen. Der Vorteil dieser Methode
spruches der Substitu-
re
Lipasen in der kinetischen Racematspaltung soll nun gesondert im
1.2.2.2 Lipasekatalysierte kinetische Racematspaltung
Wie bereits in Kapitel 1.2.1 beschrieben stellen kinetische Racematspaltungen eine mgliche
Methode dar, um enaniomerenreine V
liegt darin, dass es bei der Umsetzung von achiralen Substraten, die zumeist gnstig in
grotechnischen Prozessen hergestellt werden knnen, zu einer Vervielfltigung der chiralen
Information des Katalysators kommt.
Kazlauskas schlug 1991 ein Modell vor, mit dessen Hilfe vorausgesagt werden kann, welches
Enantiomer eines sekundren Alkohols bei einer lipasekatalysierten Reaktion schneller
reagiert.[53] Die Vorhersage erfolgt ber Bewertung des sterischen An
-
Einleitung 9
enten im Substratmolekl. Abbildung 1.4 zeigt das jeweils bevorzugt umgesetzte Enantiomer.
Im Falle von chiralen sekundren Alkoholen (1) wird das (R)-Enantiomer bevorzugt
umgesetzt, bei chiralen Suren (2) wird das (S)-Enantiomer bevorzugt.
R2
R1O
HR3
O
1
R2R1
H O
O
R3 2
R3 O
O
H
mittel
H
mittelgro
OR3O
gro
(R) (S) Abbildung 1.4 Kazlauskas-Regel fr lipasekatalysierte Hydrolysereaktionen: Als Sequenzregel gilt: gro > mittel, abgebildet ist
jeweils das bevorzugt umgesetzte Enantiomer
Entscheidend fr die Enantioselektivitt von lipasekatalysierten Reaktionen ist der Unter-
schied der bergangszustands-Energien der mglichen Enzym-Substrat-Komplexe. Dieser
rt hingegen ist unabhngig vom Umsatz und ist
definiert als das Verhl en
Enantiomere mit vR fr das (R)- und mit vS fr das (S)-Enantiomer. Es ist dem in der Metall-
energetische Unterschied spiegelt sich letztendlich auch in den unterschiedlichen Reaktions-
geschwindigkeiten der beiden Enantiomere eines Racemates wieder, ber die der sogenannte
E-Wert berechnet wird.
Sih stellte ein Modell fr die Enantiodifferenzierung einer solchen kinetischen Racemat-
spaltung auf, das die Berechnung der Enantiomerenberschsse in Abhngigkeit von der Zeit
ermglicht.[54, 55] Sih fhrte den sogenannten E-Wert (E) als Ma fr die Enantioselektivitt
ein, der die Selektivitt einer kinetischen Racematspaltung mit dem Umsatz und dem
Enantiomerenberschu (ee) in Verbindung setzt. In einer kinetischen Racematspaltung ist
der ee-Wert vom Umsatz abhngig, was bei einem Vergleich von verschiedenen experimen-
tellen Daten zu Problemen fhrt. Der E-We
tnis der Reaktionsgeschwindigkeiten (v) der beiden umgesetzt
Katalyse gebruchlichen s-Wert quivalent:[54]
S
RvE = (1) v
-
Einleitung 10
Da es sich bei Racematspaltungen hufig um reversible Reaktionen handelt, muss bei hohen
Umstzen die Rckreaktion bercksichtigt werden, da die Reversibilitt der Reaktion zu einer
Erniedrigung der optischen Reinheit fhrt. Durch das Einbeziehen der
Gleichgewichtskonstante K und des Umsatzes c in die Berechn
folgende Gleichung:[54]
ung des E-Wertes erhlt man
)]-(1cK)(1-ln[1 Ree+)](1cK)(1-ln[1 ReeE ++= (2)
Fr niedrige Umstze (c < 40%) vereinfacht sich Gleichung (2) zu:[54]
)]1()1ln[()]1()1ln[(E Reec
Reec+= (3)
Fr irreversible Reaktionen ist der E-Wert unabhngig vom Umsatz. Straathof und Jongejan
zeigten, dass der E-Wert fr diese Reaktionen sehr przise aus den Enantiomerenber-
schssen des Produkts eeP und des Edukts eeS berechnet werden kann:[56]
+
+
=
p
s
s
p
eeeeee
1
1ln
E (4)
Hgeberg wies allerdings darauf hin, dass eine Irreversibilitt in Umesterungen prinzipiell
nicht erreichbar ist, solange der gebildete Produktester auch als Acylierungsmittel fr das
Edukt zur Verfgung steht.
+
s
s
eeeeee
1
1ln
b durchgefhrt werden kann [54]
sich icht umgesetzten Edukt effizient abtrennen lsst. Auf dieses
[57] In der Literatur finden sich verschiedene Richtwerte ab wann
eine kinetische Racematspaltung effizient in industriellem Masta
(Sih schlgt z. B. einen Richtwert fr E von 100 vor ). Die Praktikabilitt von kinetischen
Racematspaltungen ist allerdings nicht nur vom EWert abhngig, sondern auch davon, ob
das Produkt vom n
Grundlegende Problem wird in Kapitel 3.3 eingegangen werden.
-
Einleitung 11
1.3 Strategien zur Verbesserung der katalytischen Eigenschaften von Enzymen
Besitzt ein Enzym fr eine gewnschte Reaktion mangelnde Aktivitt oder Selektivitt, so
kann nach einem anderen Enzymen aus dem vorhandenen genetischen Pool gesucht werden,
das die gewnschten Ei tegie ist, Methoden an-
zuwenden, die die gewnschte Eigenschaft des Enzym ierfr steht heutzutage
ein ichkei
knnen etzung u
sind. In Tabelle 1.1 sind die m z
beschrTabelle 1.1 Strategien zur Optimierung von Biotransformationen
genschaften besitzt. Eine weitere mgliche Stra
s verbessern. H
ganzes Arsenal an Mgl
und deren Ums
ten zur Verfgung, deren Erfolgsaussichten stark differieren
nd Anwendung ebenfalls sehr unterschiedlich im Aufwand
glichen Strategien aufgezhlt und deren Potential kur
ieben.
Strategie Wirkung/Ziel
Einsatz in organischen Umkehrung der Reaktionsfhrung mglich, mit teilweiser Ste tt Lsemitteln[34] igerung der Aktivitt und Regio- und Enantioselektivi
Immobilisierung von Er er auch zur Erhhung der Selektivitt
Io Reaktionsmedie 62] Erhhung der Selektivitt
Optimierung der Erhhung der Stabilitt und Aktivitt, aber auch zur
Einsatz rekombinanter Hauptschlich Erhhung der Enzymproduktion und
P ] Vernderung des katalytischen Profils (Beeinflussung von
Molecular Modeling[70-72] Voraussagen, welche Aminosureaustausche zur
Enzymen[39, 40, 58] hhung der operationellen Stabilitt und Aktivitt, ab
nische Flssigkeiten alsn[59-
Erhhung der Stabilitt und Aktivitt, aber auch zur
Imprinting[63] Erhhung der Selektivitt fr ein bestimmtes Substrat
Reaktionsbedingungen[14] Erhhung der Selektivitt
DNA[64, 65] Enzymaktivitt
unktmutagenese[64, 66-69Aktivitt, Selektivitt, Stabilitt, Substratspektrum)
Verbesserung des katalytischen Profils fhren knnen
Optimierung von Fermentationsbedingungen[25]
Hauptschlich Erhhung der Enzymproduktion und Enzymaktivitt
Gerichtete Evolution von Enzymen[64, 73-81]
Vernderung des katalytischen Profils (Beeinflussung von Aktivitt, Selektivitt, Stabilitt, Substratspektrum)
-
Einleitung 12
In der Literatur werden die aufgelisteten Strategien unterschiedlich diskutiert und so ist es
nicht verwunderlich, dass zu fast jeder Strategie unterschiedliche Resultate im positiven wie
im negativen Sinn publiziert sind. Welche Strategie letztlich zum Erfolg, d.h. zu einem
und ist stark von
ktion) auf die gewnschte Eigenschaft und Identifizierung
tzt genannte Methodik wird separat
glicht schlielich die Untersuchung des Enzyms auf die gewnschte
Eigenschaft; Identifikation einer verbesserten Variante und Rckfhrung der zugehrigen
DNA in Schritt 1 tens zwei Zyklen
verbesserten Biokatalysator fhrt, kann nicht pauschal beantwortet werden
der jeweiligen Problemstellung abhngig. Trotz allem soll auf zwei Punkte - den Einsatz von
ionischen Flssigkeiten und auf die gerichtete Evolution von Enzymen - im Folgenden nher
eingegangen werden.
1.3.1 Gerichtete Evolution von Enzymen mittels Screening
Die gerichtete Evolution von Enzymen macht sich die natrliche Kraft der Darwinistischen
Evolutionsprinzip[82] zur Verbesserung von Enzymeigenschaften zu Nutze. Mehrere Zyklen
von Mutation, Screening (bzw. Sele
des verbesserten Klons im Labormastab fhren zu verbesserten Enzymvarianten.
Es sei an dieser Stelle darauf hin gewiesen, dass es zwei verschiedene Arten der Auffindung
von verbesserten Enzymvarianten gibt, nmlich die durch aktives Suchen (Screening) oder die
durch Selektion von verbesserten Varianten. Auf die zule
im nchsten Kapitel eingegangen.
Diese Imitation der natrlichen Evolution, die auf hnliche Art die Funktion und Wirkungs-
weise von Enzymen ber Jahrmillionen auf einen bestimmten Zweck hin optimiert hat, kann
so im Reagenzglas in kurzer Zeit zum Erfolg fhren. Die schematische Vorgehensweise der
Evolution im Reagenzglas ist in Abbildung 1.5 skizziert.
Zunchst muss das Ausgangsgen, welches das zu verbessernde Enzym kodiert, erkannt und
ausgewhlt werden. Verschiedenste Mutagenesemethoden knnen zur Erzeugung von
Bibliotheken in Schritt 2 herangezogen werden.[83] Die DNA-Bibliothek wird anschlieend in
einen geeigneten Expressionsvektor kloniert und dieser nach Ligation in kompetente Zellen
eines Wirtsorganismus (z. B. Escherichia coli) transformiert. berexpression im jeweiligen
Wirtsorganismus erm
komplettiert den Zyklus. Nach Durchlaufen von mindes
kann man von einem evolutionren Druck auf die gewnschte Eigenschaft sprechen. Wird nur
ein Zyklus durchlaufen, erhlt man lediglich eine Bibliothek von Zufallsvarianten des
untersuchten Enzyms.
-
Einleitung 13
Abbildung 1.5 Schematische Darstellung der gerichteten Evolution von Enzymen
Durch diesen Ansatz knnen eine Vielzahl an Enzymeigenschaften wie Thermostabilitt,
pH-Stabilitt, Substratspezifitt oder Aktivitt in organischen Lsemitteln verbessert
werden.[64] Fr die pharmazeutische Industrie ist vor allem die Verbesserung der Enantio-
selektivitt von Enzymen in einer gegebenen Umsetzung von hohem Interesse. Durch
gerichtete Evolution kann ein Enzym mit niedriger Selektivitt in einer gegebenen Umsetzung
in wenigen Zyklen zu einem hochselektiven Enzym optimiert werden (siehe Abbildung 1.6).
Ein groer Vorteil dieser Methode ist, dass Kenntnisse ber die Struktur des Enzyms oder den
Reaktionsmechanismus hierbei nicht erforderlich sein mssen.
-
Einleitung 14
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6
Mutanten-Generation
ee / %
Wildtyp 1 2 3 4 5
Abbildung 1.6 Steigerung der Enantioselektivitt mittels gerichteter Evolution
Das erste Beispiel fr die Steigerung der Enantioselektivitt einer Lipase stammt von Reetz,
der den E-Wert der Pseudomonas aeruginosa Lipase A in e enantioselektiven
Esterhydrolyse deutlich steigern konnte. Neben der Steigerung des Wildtyp E-Wertes von
E = 1.1 auf E = 25 konnt
iner
e die natrliche Selektivitt bezglich des Modellsubstrats auch bis
auf einen Selektivittsfaktor von E = 51 umgekehrt werden.[76, 79, 80, 84] Wichtig bei der An-
andomisierung wendung von gerichteter Evolution ist die Wahl der Mutagenesemethode zur R
des Ausgangsgens, denn je nach Grad der Diversifizierung entstehen unterschiedlich groe
Bibliotheken, die den so genannten Sequenzraum bilden der unterschiedlich durchwandert
werden muss. Die Anzahl der mglichen Varianten N bei einem Enzym bestehend aus X
Aminosuren bei M randomisierten Positionen kann mit folgender Formel berechnet werden:
!)!(!19MMX
XMN
= (5)
M = Anzahl der ausgetauschten Aminosuren, X = Sequenzlnge, N = Bibliotheksgre
Werden in einem Mutageneseexperiment beispielsweise nur zwei Aminosuren zufllig
ausgetauscht, entsteht bei einer Sequenzlnge von 200 Am6
inosuren eine theoretische
Bibliotheksgre von ber 710 Enzymvarianten (siehe Tabelle 1.2).
-
Einleitung 15
Tabelle 1.2 Theoretische Bibliotheksgre bei M Aminosuresubstitutionen an einem Enzym der Sequenzlnge N
M N = 5 N = 200
1 95 3 800
2 14 440 7 183 900
68 590 9 008 610 600
4 651 605 8 429 907 368 950
5 2 476 099 6 278 520 528 393 960
6 3 876 986 426 283 270 000
7 2 042 510 281 040 010 000 000
3
Es ist einleuchtend, dass mit herkmmlichen Screening-Methoden derartige Bibliotheken
nicht mehr komplett durchmustert werden knnen, insbesondere wenn es darum geht,
Enantioselektivitt zu bestimmen. In jngster Zeit sind eine Reihe von sehr schnellen und
przisen Hochdurchsatz Screening-Verfahren entwickelt worden mit denen mehrere Tausend
Enantiomerenbestimmungen am Tag durchgefhrt werden knnen.[85-87] Doch auch diese
kommen schnell an ihre Grenze (siehe Tabelle 1.2), wenn es sich um sehr groe
Mutantenbnke handelt.
1.3.2 Selektionssystemen zur Analyse von Proteinfunktionen
Die Identifizierung interessanter Varianten in groen kombinatorischen Bibliotheken (oder
Genbanken) kann entweder, wie im vorherigen Kapitel dargestellt, durch die individuelle
Prfung aller Mitglieder erreicht werden (Screening) oder aber indem man Bedingungen
verwendet, unter denen nur die interessanten Varianten auftreten (Selektion). Generell
erfordern Screeningstrategien eine aktive Untersuchung aller in der Bibliothek vorhandenen
Varianten, wohingegen bei Selektionsstrategien ein Auswahlprozess nur die bevorzugten
Varianten begnstigt.[74, 88] Der wichtigste Vorteil der Selektion gegenber dem Screening ist
die Mglichkeit der simultanen Analyse von wesentlich mehr Bibliotheksmitgliedern. Dies
basiert auf der T ten. So knnen
Prinzipiell gibt es zwei Grundstrategien bei der Anwendung von Selektionsmethodiken. Die
eine Strategie wird als in vivo Selektion, die andere als in vitro Selektion bezeichnet.[74] Bei
atsache, dass uninteressante Varianten nie in Erscheinung tre
bis zu 1010 Klone in einem einzigen Selektionsexperiment beurteilt werden, wofr es selbst
mit den schnellsten Screening Assays Jahre brauchen wrde.[89]
-
Einleitung 16
der in vivo Stra gebunden, und
auf diese Weise erfolgt die pel erscheinende Selektion. Oft ist es
dings s geeigne
zu entwickeln. Insbesondere kann ein Selektionsschemata fr Enzyme, die in unnatrlichen
Umgebunge anischen L sein soll h
sein.[9 der angestrebten Reaktion an das berleben der Zellen im
Selektionsschritt bedarf unter U klun d
intellige nordnungen. Jedes Selektionssystem, besonders ein sehr kompli-
z tes, birgt ets die M bens er
gar unerwnschte Lsungen der g ensaufgabe auftauchen.[92, 93]
lic auch bei o Selektion in
vivo Selektion liegt darin, dass der evolutive Druck bei der in vitro Selektion nicht an das
berleben eines Organismuses gebun in muss. A
nicht zwang ollstndige, ganismen eingesetzt werden mssen, ist die
e n e geneti Methode die Kopplung von
Phnotyp (Protein) und Genotyp (DNA), denn nur solche t
w den, s rvielfltigen bzw. vervielfltigt werden. Einig er Literatur als
Selek te Met e zum B
T hnik, ei Teile vo
.4). Trotzdem folgen alle Anstze einer allgemeinen Strategie zur Analyse der Protein-
tegie ist die angestrebte Reaktion an das berleben der Zelle
auf den ersten Blick sim
te Selektionsstrategien faller chwierig, r beliebige katalytische Umsetzungen
n wie org semitteln aktiv en, schwierig oder sogar unmglic0, 91] Die Kopplung
mstnden der Entwic g von komplexen, nichttrivialen un
nten Versuchsa
dabei stier glichkeit, dass berle fhige, aber unvorhergesehene od
estellten berleb
der in vitrhn he Probleme knnen auftauchen. Der Unterschied zur
den se uch wenn bei der in vitro Selektion
slufig v
tielle Grundlage fr di
lebensfhige Or
sche Selektion auch bei dieser sse
Systeme knnen, wenn sie selektier
e in der ich selbst ve
tionssysteme diskutier
vereinigen dab
hodiken, wi
n Screening- und Teile von Selektionsassays (siehe Kapitel
eispiel die Zelloberflchen-Display-
ec
5
funktion, die in Schema 1.1 dargestellt ist.[88]
Schema 1.1 Allgemeine Strategie zur Analyse der Proteinfunktion in groem Mastab
erfolgreich angewendeten in vitro Selektionssysteme
aufgelistet, die bereits in mehreren bersichtsartikeln miteinander verglichen wurden.[74, 88]
In Tabelle 1.3 sind die bislang
-
Einleitung 17
Tabelle 1.3 Die Verknpfung von Genotyp und Phnotyp in verschiedenen Testsystemen
Nr. Methode Genotyp und Phnotyp
Testsystem (Selektion oder Screening)Verknpfung zwischen
1 Phagen-Display-
Technik Phagenpartikel Bindung an eine Affinittsmatrix
2 R
ik Ribosomenkomplex Bindung an eine Affinittsmatrix
3 Bindung an eine Affinittsmatrix
ibosomen-Display-
Techn
mRNA-Peptid-
Fusion Peptid-mRNA-Fusion
4 Peptid am Plasmid Peptid-Plasmid-
Komplex Bindung an eine Affinittsmatrix
5 Zelloberflchen-
Display-Technik Zelle Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung
6 In-vitro-
Kompartimentierung
Wasser-in-l-
Trpfchen PCR
7 Genetisches
Testsystem Zelle
Komplementation, kolorimetrische
Tests
8 Mikrotiterplatten und
Proteinchips
Rumliche
Adressierung
Radiometrisch, UV/Vis-Absorption
oder Fluoreszenztest
Auf das von Smith im Jahre 1985 entwickelte so genannte Phage Display, das ein leistungs-
fhiges Werkzeug auf dem Gebiet der in vitro Evolution darstellt, wird in Kapitel 5.1
gesondert eingegangen.[94-96] Ebenso auf das Zelloberflchendisplay im Kapitel 5.4.
Ein Nachteil aller Selektionsmethodiken als Werkzeug in der gerichteten Evolution ist, dass
u verbessernde System vorliegen mssen, im Gegensatz relativ viele Informationen ber das z
zu den meisten Screening Anstzen. Auch kann eine zu groe Hufung von falsch-positiven
Resultaten ein effizientes Screening ntig machen oder das System muss so umgestaltet
werden, dass der unerwnschte Hintergrund durch die Einfhrung eines weiteren Selektions-
schrittes eliminiert wird.
1.4 Nachhaltige Chemie
Wie in Kapitel 1.3 dargestellt, gibt es mehrere Strategien um die katalytischen Eigenschaften
von Enzymen zu verbessern. Eine Strategie kann unter anderem die Verwendung von
ionischen Lsemitteln sein (siehe Kapitel 3.1). Gegenber organischen Lsemitteln knnen
-
Einleitung 18
ionische Lsemittel daneben noch weitere Vorteile mit sich bringen, auf die im Folgenden
nher eingegangen wird.
Viele Umsetzungen in der Chemie werden in Lsung unter Einsatz eines Lsemittels durch-
gefhrt. Lsemittel werden dabei hauptschlich verwendet um:
n und Hot-Spots zu verhindern und
die Produkte leichter zu isolieren
Groe Mengen an Lsemittelabfllen fallen daher bei der Produktion von relativ geringen
Mengen an chemischen Erzeugnissen an, speziell auf dem Gebiet der Feinchemikalien-
produktion. semittel knn che Flssigkeiten, ber-[97]
Substanzen. Es ist viel mehr das Streben nach an chemischer Effizienz,
denn elegante Chemie bentigt nu indestma an Reagenzien, in einer hoch
selektiven Weise einzelne Produkte in quantitativen Ausbeuten herzustellen, und dies ohne
die Bildung von Nebenprodukten und die Notwendigkeit von Aufreinigungsschritten.[99, 100]
Somit kann man jeden, der sich esserung der Ef z von chemischen
Reaktionen oder Verfahren beschftig emiker bezeic n.[101-104]
1.4.1
man im Allgemeinen Flssigkeiten, die nur aus Ionen
bes e punkte unter 100 C liegen. Letztere Eigenschaft grenzt sie von
klassischen [105] bgrenzung ist mit der Tatsache
begrndet, dass unterhalb eines Schmelzpunktes 100 C eine sprunghafte Verbesserung in der [106]
ionische Flssigke
Entwicklung von ionischen Flssigkeiten [107] Die ersten
Publikationen in denen ionische Flssigkeiten als neuartige Lsemittel fr die Katalyse und
die Reaktionspartner in einer homogenen Phase miteinander in Kontakt zu bringen,
den Ablauf der Reaktion besser zu kontrollieren und dadurch hhere Selektivitten zu
erreichen,
die Reaktionstemperatur zu kontrolliere
Ersatzstoffe fr organische L en ionis
kritische Fluide, perfluorierte Lsemittel und Wasser sein. Ob ihre Verwendung eine
nachhaltigere Verfahrensfhrung ermglicht oder sogar durch Entsorgungsprobleme grere
Umweltschden entstehen, ist vom Einzelfall abhngig.[98] Als ein Teilgebiet ist diese
Problematik in den Grundstzen der Green Chemsitry angesiedelt. Nachhaltige Chemie
ist aber weitaus mehr als nur die Vermeidung von organischen Lsemitteln und giftigen
einem Hchstma
r ein M um
mit der Verb fizien
t, als grnen Ch hne
Ionische Flssigkeiten
Unter ionischen Flssigkeiten versteht
teh n und deren Schmelz
Salzschmelzen ab. Der Grund fr diese klare A
Anwendbarkeit als Ersatz fr organische Lsemittel vorliegt. Whrend man bei
Salzschmelzen an hochschmelzende, hochviskose und sehr korrosive Medien denkt, sind
iten bereits bei niedrigen Temperaturen Flssig und niedrig viskos. Die
reicht bis in das Jahr 1914 zurck.
-
Einleitung 19
organische Synthese eingesetzt wurden erschienen allerdings erst Ende der achziger Jahre.[108,
109] Seitdem hat die Anzahl nen, bei denen ionische Flssigkeiten verwendet
wurden, sprunghaft zugenommen (siehe Abbildung 1.7).[110]
an Publikatio
Abbildung 1.7 Anzahl an Publikationen, die den Begriff ionic liquid im Titel, Abstract oder in den Schlsselworten hatten[110]
Ionische Flssigkeiten werden in der Regel im ersten Schritt durch Quaternisierung eines
Amins oder eines Phosphans hergestellt. Zunchst wird dabei hauptschlich eines der in
Abbildung 1.8 dargestellten Kationen erzeugt.
N+
N R1R2
N+
R
R1
P+
R1
N+
R3R2
R3R2 R4R4
Imidazolium-Ion Pyridinium-Ion Ammonium Ion Phosphonium-Ion Kationen in ionischen Flssigkeiten
igenschaft des Kations und der Lage des Schmelzpunktes bestehen kann. Tabelle 1.4 Schmelzpunkt unterschiedlicher Chloride
Salz Schmelzpunkt
Abbildung 1.8 Wichtige Arten von
Sollte das gewnschte Anion der Ionischen Flssigkeit nicht bereits aus dem Alkylierungs-
reagenz resultieren, muss nach der Alkylierungsreaktion noch ein Anionenaustausch erfolgen.
Zentrales Kriterium bei der Beurteilung einer ionischen Flssigkeit ist wie bereits erwhnt der
Schmelzpunkt. Tabelle 1.4 zeigt eindrucksvoll welcher Zusammenhang zwischen Struktur
bzw. chemischer E
NaCl 803
KCl 772
R1 125 = R2 = Me NN R1 = Me; R2 = Et a 87
+ R1R2
Cl R1 = Me; R2 = n-Bu b 65 a [EMIM]: 1-Ethyl-3-methylimidazolium-Ion; b [BMIM]: 1-Butyl-3-methylimidazolium-Ion
-
Einleitung 20
Als Grnde fr niedrige Schmelzpunkte werden in der Literatur dabei folgende Kriterien als
besonders wichtig hervorgehoben:[106]
niedrige Symmetrie
geringe intermolekulare Wechselwirkung
gute Ladungsverteilung
Aber auch die Art des Anions hat Einfluss auf die Eigenschaften von ionischen Flssigkeiten,
wie man aus der Lage der Schmelzpunkte in Tabelle 1.5 entnehmen kann. Tabelle 1.5 Einfluss verschiedener Anionen auf den Schmelzpunkt von Imidazolimsalzen
Imidazoliumsalz Schmelzpunkt
[EMIM] Cl 87
[EMIM] NO3 38
[EMIM] AlCl4 7
[EMIM] BF4 6
[EMIM] (CF3SO2)2N a -3
[EMIM] CF3CO2 -14 a (CF3SO2)2N-: Bis-trifilic-amide (engl.) [BTA]
Ionische Flssigkeiten besitzen keinen messbaren Dampfruck und sind deshalb aus
verfahrenstechnischer Sicht von groem Interesse. Auf Grund dieser Tatsache knnen
Produkte destillativ aus der Reaktionslsung abgetrennt werden ohne dass Probleme der
Azeotropbildung von Produkt und Lsemittel auftreten. Auerdem bilden ionische Flssig-
keiten auf Grund dieser Tatsache keine explosionsfhigen Gas/Luftgemische, wie es die
meisten organischen Lsemittel tun und knnen deshalb als besonders sicher im Bezug auf
den Explosionsschutz eingestuft werden.
Bislang gibt es nur einen industriellen Prozess, in dem ionische Flssigkeiten eingesetzt
werden.[111] Allerdings wird die ionische Flssigkeit hier nicht als Lsemittel verwendet,[106,
112] sondern fllt als Nebenprodukt nach Protonierung einer Hilfsbase als flssige Salzfracht
an, die sich leichter durch flssig/flssig Extraktion abtrennen lsst als ein Feststoff durch
Filtration.
1.4.2 berkritisches Kohlendioxid
Als berkritische Fluide bezeichnet man Reinstoffe oder Gemische, deren Temperatur
oberhalb der kritischen Temperatur (Tc) und des kritischen Drucks (pc) liegen.[113]
Phasendiagramm eines reine bildung 1.9) wird hierdurch
Im
n Stoffes (pT-Diagramm, siehe Ab
-
Einleitung 21
eine einseitig rechtwinkelige Zustandsflche aufgespannt, deren Eckpunkt dem kritischen
Punkt entspricht.
zwei definiertePhasen
einePhase
undefinierterMeniskus
zwei definiertePhasen
einePhase
undefinierterMeniskus
Abbildung 1.9 Phasendiagramm (pT-Diagramm) des reinen Kohlendioxids mit entsprechenenden Photos des jeweiligen [114]
In der Abbildung 1.9 sind neben dem pT-Diagramm auch drei Photos eines mit CO2 befllten
Fenstera f dem ersten Photo, das bei einer Temperatur von 17 C
nschaften von Flssigkeiten, Gasen und berkritischen Fluiden zeigt, dass
berkritische Fluide hufig die Vorteile von Gasen und Flssigkeiten vereinen. Trotz Flssig-
Phasenzustandes
utoklaven dargestellt. Au
aufgenommen wurde, koexistieren eine Gas- und Flssigphase. Die flssige Phase besitzt eine
Dichte von ca. 0.80 g/ml, die Gasphase ca. 0.14 g/ml (Mittelwert = 0.47 g/ml ~ kritische
Dichte). Eine Erwrmung dieses Systems fhrt zu einer Stoffmengenzunahme der flssigen
Phase unter deren Dichteverringerung. Entgegengesetztes gilt fr die Gasphase. Durch die
Erwrmung steigt der Menniskus des Flssigkeitsspiegel an und wird immer weniger definiert
je nher man dem kritischen Punkt kommt. Gleichzeitig wird die Dichte der Gasphase weiter
erhht und die der Flssigkeit weiter abgesenkt. Bei dem Erreichen der kritischen Temperatur
(31.0 C) besitzen beide Phasen identische Dichten und gehen in eine homogene Phase - die
berkritische Phase - ber (gelb unterlegtes Gebiet im Phasendiagramm, Abbildung 1.9). Ein
Vergleich der Eige
-
Einleitung 22
keits-hnlichen Dichten, Wrmeleitfhigkeiten und spezifischen Wrmekapazitten besitzen
sie eine sehr geringe Oberflchenspannung, eine geringe dynamische Viskositt und hohe
Diffusionsraten. Ferner ist ihre unbegrenzte Mischbarkeit mit gasfrmigen Reaktanden zu
nthesechemie sind
insbesondere solche berkritischen Fluide als L sungsmittel von Bedeutung, deren kritische
Konst gute
nennen, die es erlaubt, deren Konzentrationen am Reaktionsort durch Homogenisierung
erheblich zu erhhen, wodurch potentiell Reaktionsgeschwindigkeiten gesteigert werden
knnen. Aus dem Blickwinkel der Prozess-Sicherheit ermglicht dies aber auch die effektive
Verdnnung brennbarer oder explosionsgefhrlicher Gase. In der Sy
anten in vergleichsweisen milden Regionen liegen (vgl. Abbildung 1.10), die
Lsungseigenschaften zeigen und sich unter Reaktionsbedingungen weder reaktiv noch korro-
siv verhalten.
0
50
100
150
200
250
bar
NH
H2O
-200 -100 0 100 200 300 400
T / C
p /
N2 Ar
O2 CH4 C2H4CHF3
CO2C2H6
SF6
C3H6C3H8
3
n-butann-pentan
Abbildung 1.10 Kritische Daten einiger Reinstoffe
Ferner sollten sie preiswert, gesundheitlich unbedenklich und gefahrlos in die Umwelt
emittierbar sein. Bei einer solchen vergleichenden Betrachtung verschiedener berkritischer
Fluide sticht insbesondere berkritisches CO2 (scCO2) als Reaktionsmedium heraus. Es erfllt
fr viele Applikationen alle genannten Voraussetzungen.[114, 115] Die fr die Mehrzahl der
organischen Lsemittel geltende schdliche Emissions- und Immissionswirkung trifft auf
berkritisches CO2 nicht zu, da es bei kontrolliertem Eintrag in die Umwelt weder hu-
mantoxikologische noch kotoxikologische Wirkung zeigt. Aus der Perspektive der Treib-
hausproblematik ist zu bemerken, dass durch die Verwendung von komprimiertem CO2 als
Reaktionsmedium der anthropogen erbrachte Eintrag in die Umwelt nicht erhht wird, da die
kostengnstig isolierbaren Kapazitten an CO2, die insbesondere bei der Wasserstoff- und
Ammoniaksynthese anfallen, bisher nur zu einem geringen Mae genutzt werden.
-
Einleitung 23
Die rckstandslose Verdampfbarkeit prdestiniert scCO2 darber hinaus fr die Herstellung
rungsmitteladditiven und mikroelektronischen Bauteilen.
alternativen
Flssigkeiten und
n ist die Verwendung Letzterer zur
Brennecke et al. im Fachjournal Nature ein Konzept vor, mit dem in ionischer
lssigkeit gelste Substanzen, ohne Verwendung von organischen Lsemitteln, effizient
xtrahiert werden knnen.[118]
ie Forscher konnten in der ionischen Flssigkeit [BMIM] [PF6] gelstes Naphthalin in
semittelfreier Form und ohne nachweisbare Kreuzkontamination nach Extraktion mit scCO2
erhalten (siehe Abbildung 1.11). Nach der Extraktion und Entspannen auf Normaldruck
konnte die ionische Flssigkeit in reiner Form wieder gewonnen werden.
von Kosmetika, Pharmaka, Nah
Darber hinaus existieren erste Textilreinigungsprozesse, die auf diesem
Reaktionsmedium basieren und somit den Einsatz perchlorierter organischer Lsungsmittel
umgehen.[97, 114, 116] Die Entkoffeinierung von grnen Kaffeebohnen (vor dem Rstprozess)
unter Verwendung von scCO2 wurde von Zosel bereits in den sechziger Jahren mittels
Destraktion (Kombination aus Destillation und Extraktion) am Max-Planck-Institut fr
Kohlenforschung entwickelt.[117] Nach diesem Verfahren werden heutzutage weltweit mit
etwa 100.000 Tonnen pro Jahr mehr als 50% des entkoffeinierten Kaffees hergestellt.
1.4.3 Besonderheiten des Zweiphasensystems ionische berkritisches CO2
Wie in Kapitel 1.4.1 erwhnt, knnen ionische Flssigkeiten als Ersatzstoffe fr flchtige
organische Lsemittel in vielen Reaktionen eingesetzt werden. Trotz allem ist es oft schwierig
die Produkte aus der ionischen Flssigkeit zu isolieren. Einige ionische Flssigkeiten sind
nicht wassermischbar, was eine Extraktion der Produkte mit Wasser erlaubt, gleichzeitig aber
die Substanzbreite auf polare und hydrolysestabile Verbindungen einschrnkt. Prinzipiell
knnen die Produkte auch aus der ionischen Phase durch Destillation entfernt werden, was
aber wegen Thermolabilitt teilweise nicht mglich ist. Extraktionen mit organischen
Lsemitteln fhren oft zu Kreuzkontaminationen. Danebe
Extraktion der Produkte kaum sinnvoll, da man die Vorteile der ionischen Flssigkeiten
dadurch nivelliert.
1999 stellten
F
e
D
l
-
Einleitung 24
Abbildung 1.11 Extraktion von reinem und in [BMIM] [PF6] gelstem Naphthalin mit scCO2 bei 40 C und 138 bar
Neben diesen Extraktionsergebnissen konnten auch andere interessante Eigenschaften dieses
Zweiphasensystems festgestellt werden. Die ionische Flssigkeit lste sich zwar nicht im
berkritischen CO2, allerdings lsen sich erhebliche Mengen CO2 in der ionischen Flssig-
keit. So wurde beobachtet, dass das Volumen einer ionischen Flssigkeit um bis zu 20 %
zunimmt, wenn sie einem CO2-Druck von 80 bar ausgesetzt wird.[118-120] Diese hohe
Lslichkeit von CO2 in ionischen Flssigkeiten fhrt zu einer erheblichen Viskosittsab-
senkung und somit zu besserer Diffusion, was letztlich gesteigerten Reaktionsraten zulsst.
-
Aufgabenstellung 25
2 Aufgabenstellung
Die Aufgabenstellung dieser Dissertation gliedert sich in drei Teile:
Thema des ersten Teils war die Untersuchung von Lipasereaktionen in ionischen Flssig-
keiten. Hauptschwerpunkt der Untersuchungen war dabei die Etablierung eines effizienten
Produktseparierungssystems. Die Produkte einer lipasekatalysierten Reaktion sollten nach der
Umsetzung in der ionischen Flssigkeit mittels berkritischem Kohlendioxids, unter
Vermeidung von organischen Lsemitteln, extrahieret werden. Des Weiteren sollte untersucht
werden, ob sich die Produkte einer lipasekatalysierten kinetischen Racematspaltung selektiv
aus der ionischen Flssigkeit extrahieren lassen. Ziel dieser Arbeiten sollte demnach sein eine
effiziente Methode zur Separierung von Enantiomeren zu etablieren.
Die Aufgabe des zweiten und dritten Teils dieser Dissertation war die Weiterfhrung der
Arbeiten von Rggeberg. Zum einen sollten weitere Phosphonsureester fr Co-Kristallisa-
tionsexperimente mit Lipasen synthetisiert werden (Ziel dieser Experimente war die Enantio-
selektivitt verschiedener Lipase Varianten zu erklren). Zum anderen sollte das Phage
Display-Projekt zur Selektion enantioselektiver Enzymmutanten fortgefhrt werden. Hierzu
sollten weitere Phosphonsureester als bergangszustandsanaloga chiraler Carbonsureester
synthetisiert und immobilisiert werden. Diese sollten im Rahmen des EU-Projekts Evocatal
Directed Evolution of Enantioselective Biocatalysts zur Verbesserung des katalytischen
Profils der Bacillus subtilis Lipase A eingesetzt werden.
Weiterhin sollte untersucht werden, ob sich neben dem Phage Display Ansatz andere
Selektionssysteme unter Umstnden besser eignen, um enantioselektive Enzymvarianten zu
selektieren.
-
Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 26
3 Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien
3.1 Biokatalyse in ionischen Flssigkeiten
Wie bereits in Kapitel 1.4.1 angedeutet stellen ionische Flssigkeiten eine interessante
Alternative zu konventionellen, organischen Lsemitteln dar. Sie knnen in einer Vielzahl
von Reaktion eingesetzt werden, zu denen auch enzymkatalysierte Reaktionen zhlen. Die
erste in der Literatur erwhnte Biotransformation in ionischen Flssigkeiten war die Synthese
von Z-Aspartam in [BMIM] [PF6], katalysiert vom Enzym Thermolysin.[121] Kurze Zeit spter
wurde die e ekataly ierte n in ionischen Flssigkeiten erwhnt.[122] Seitdem
Flssigkeiten erschienen, die bereits en Review-Artikeln zusammengefasst
rste lipas s Reaktio
sind in der Literatur eine groe Anzahl von Verffentlichungen ber Biokataylse in ionischen
in mehrer
wurden.[59, 61, 62] In Kapitel 1.4.1 sind einige Vorteile, die die Verwendung von ionischen
Flssigkeiten mit sich bringen, beschrieben, wie z.B. der vernachlssigbare Dampfdruck. Sie
weisen daneben bei der Verwendung in biokatalytischen Reaktionen einige bemerkenswerte
Eigenschaften auf. Ionische Flssigkeiten auf der Basis von alkyliertem Methylimidazol sind
polare Lsemittel und besitzen auf der Reichardts Polarittsskala Werte, die mit Methanol
und DMF vergleichbar sind (siehe Abbildung 3.1).[123] Obwohl polare organische Lsemittel
Enzyme deaktivieren, wobei als Ursache der Entzug von Wasser vom Enzym durch das
polare Lsemittel vermutet wird[124], tun dies ionische Flssigkeiten nicht, was die mgliche
Substratpalette deutlich vergrert.[60, 125]
-
Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 27
Abbildung 3.1 Umstze von Pseudomonas cepacia Lipase katalysierten Reaktionen in Abhngigkeit der Lsem
(ETN = Reichardts normalisierte Skala fr Lsemittelpolaritt; Wasser = 1, TMS = 0))[62]
In allen, bis zum Beginn dieser Dissertation, publizierten Verffentlichungen
katalyse in ionischen Flssigkeiten wurde von nachhaltiger Chemie gesproc
Reaktionen nicht in organischen Lsemitteln durchgefhrt wurden. In diesen P
wurde allerdings nicht erwhnt, dass diese zur Aufarbeitung verwendet wurden
einer Ausnahme wurden die Produkte destillativ separiert [126]). Die Verwe
organischen Lsemitteln zur Extraktion der Produkte ist kaum sinnvoll, da man d
in ionischen Flssigkeiten durchfhrt um gerade diese zu vermeiden. Man
festhalten, dass fast alle, bis zum Beginn dieser Dissertation, verffentlichten en
Reaktionen in ionischen Flssigkeiten nicht als nachhaltige Verfahren bezeic
knnen.
Wie in Kapitel 2 beschrieben sollte im Rahmen dieser Dissertation untersucht w
mglich wre, Lipasenreakt chzufhren, dab
ass Biokatalyse in berkritischem Kohlendioxid schon s
80er Jahre bekannt ist.[127, 128] In vielen Publikationen wurde dabei oft
Hauptproblem [129] um einen von der geringen Stabilitt von Enzym
und zum anderen von der beschrnkten Substratlslichkeit und damit eingeschr
an durchfhrbaren T
ionen in ionischen Flssigkeiten dur
Stabilitt von Lipasen in ionischen Flssigkeiten auszunutzen und die Pr
berkritischem Kohlendioxid in einem nachhaltigem Verfahren zu extrahiere
dieser Stelle angemerkt, d
en berichtet. Z
ransformationen. ittelpolarit
ber
hen, da
ublikatio
(lediglic
ndung
ie Reak
kann
zymatisc
hnet we
erden, o
ei die h
eit Mitte
von z
e in sc
nkten B
odukte
n. Es se
n
t
Bio-
die
nen
h in
von
tion
also
hen
rden
b es
ohe
der
wei
CO2
reite
mit
i an
-
Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 28
Um einen ersten Eindruck von der Praktikabilitt von ionischen Flssigkeiten als Lsemittel
fr lipasekatalysierte Umsetzungen zu erhalten, wurde zu Beginn eine Versuchsreihe von
kinetischen Racematspaltungen in verschiedenen ionischen Flssigkeiten und zum Vergleich
im Standardlsemittel Isooctan durchgefhrt. Dabei wurde der racemische Alkohol
2-Octanol mit Vinylacetat und Candida antarctica Lipase B als Katalysator in den ionischen
Flssigkeiten [BMIM] [BTA], [BMIM] [PF6], [BMIM] [BF4] und Isooctan analog Schema
3.14 acetyliert.
+ OO
OH
+ O
O
CaL BLM
- CH3CHO
OH
(rac)-3 4 (S 3 Schema 3.1 Kinetische Racematspaltung von (rac)-2-Octanol mit Vinylacetat als A g e B
als Katalysator
Tabelle 3.1 zeigt die Ergebnisse der Versuchsreihe. D Bi
Lsemitteln eine hohe und vergleichbare Aktivitt. Im Gegensatz die Ergebnisse
der chiralen Analysen relativ stark. Beim Vergleich der ionischen Flssigkeiten untereinander
fllt auf, dass das jeweilige Anion der ionischen Flssigkeit hohen Einfluss auf die Enantio-
diskriminierung hat. In [BMIM] [BTA] ist sie am besten und in [BMIM] [PF6] am
beeinflusst.
Erstaunlicherweise zeigt das eingesetzte Lyop at eine deutlich hhere Aktivitt als das
Sol-Gel-Immobilisat und das Novo SP 435, im Gegensatz zu organischen Lsemitteln, in
)- (R)-5 cylierun smittel und Candida antarctica Lipas
er okatalysator zeigt in allen
dazu streuen
schlechtesten, wenn man den Umsatz nach 18 Stunden und die Enantiomerenberschsse bei
ca. 50 % Umsatz vergleicht. Eine genaue Erklrung fr diesen Effekt kann zum jetzigen
Zeitpunkt noch nicht gegeben werden. Anschlieend wurde untersucht, ob die Trgerung des
Biokatalysators die Aktivitt und Enantioselektivitt fr diese Reaktion
hilis
denen Immobilisate hhere Aktivitt zeigen.[130]
-
Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 29
Tabelle 3.1 Ergebnisse der kinetischen Racematspaltung von 2-Octanol in verschiedenen Lsemitteln und CaL B-Katalysatoren
Umsatz [%] Eintrag
Nr. Lsemittel Biokatalysator
ee (3)a
[%]
ee (5)a
[%]
Aktivitt d
[molmin-1g-1] 15 min 18 h 68 h
1
b Isooctan CaL B Lyophilisat > 99.5 88.6 - 53.0 82.2 -
2b [BMIM][PF ] CaL B Lyophilisat 94.9 89.8 - 51.4 100 -
3
6
b [BMIM][BF ] CaL B Lyophilisat > 99.5 85.7 - 53.9 70.8 -
4
4
b [BMIM][BTA] CaL B Lyophilisat 99.2 98.7 - 50.1 65.2 -
5c [BMIM][BTA] CaL B Lyophilisat 98.4 97.8 5800 41.6 - 57.0
6c [BMIM][BTA] Novo SP 435 > 99.5 98.2 1190 11.8 - 50.4
7c [BMIM][BTA] Sol-Gel-Immobilisat > 99.5 96.6 1250 10.4 - 50.9 a gemessen bei ca. 50 % Umsatz; b Biokatalysator = 5 mg, c Biokatalysator = 2.5 mg, d bezogen auf eingesetzte
Menge Biokatalysator
Nach diesen Vorversuchen wurden die ersten Experimente zum eigentlichen Hauptthema
durchgefhrt, die Extraktion der Produkte mittels berkritischem Kohlendioxid. Die
Verwendung komprimierter Gase erfordert neben besonders gewissenhafter Planung und
Ausfhrung der Experimente natrlich spezielle Ausrstung, insbesondere Autoklaven-
technik. Als Standardreaktionsgefe kamen dabei 10-ml Fensterautoklaven aus Edelstahl
(V4A-Edelstahl) zum Einsatz (siehe Abbildung 3.2)
Sichtfenster
6 mm Verschraubung(Anschluss einer Kapillarezum CO Einlass mglich)2
1.6 mm Anschluss mit Ventil(Auslassffnung des
CO2-Gasstroms)
Manometer
1.6 mm Anschluss mit Ventil(Auslassffnung des
CO2-Gasstroms)
Manometer
6 mm Verschraubung(Anschluss einer Kapillarezum CO Einlass mglich)2
Sichtfenster
Abbildung 3.2 Fensterautoklav mit 10 ml Volumen
In einem solchen Autoklaven wurde zunchst 1-Octanol mit Vinylacetat in der ionischen
Flssigkeit [BMIM] [BTA] mit Candida antarctica Lipase B analog Schema 3.14 bei
Normaldruck verestert.
[BMIM][BTA], CaL B
-CH3CHOOH
+ O
O O
O
6 4 7 Schema 3.2 Acetylierung von 1-Octanol in [BMIM] [BTA] mit Vinylacetat als Acylierungsmittel und CaL B als Biokatalysator
-
Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 30
Die Reaktion verlief glatt ohne Bildung von Nebenprodukten. Das Produkt und Acetaldehyd
konnten lsemittelfrei ohne nachweisbare Kontamination mit ionischer Flssigkeit extrahiert
werden. Schema 3.3 zeigt dabei den verwendeten Aufbau fr die Extraktion der Produkte. Die
Isolierung erfolgte durch Ei p iertem CO2 mittels einer Kapillare in die
ionisch
Reaktor ber Kopf und wurde schlielich i beheizten Nadelventil auf Atmosphren-
nleiten von kom rim
e Phase. Das komprimierte CO2 verlie nach Passieren der ionischen Phase den
n einem
druck entspannt, woraufhin das Produkt aus dem Gasstrom ausfiel und in einer Khlfalle
aufgefangen wurde.
R C O 2
M IL/ E
P T
C P
K F
N V G
C O 2
M NV KF G
Magnetrhrplatte Nadelventil Khlfalle Gasuhr
CP PT R IL/E
Kompressor Druck- und Temperaturkontrolle Reaktor (Abbildung 3.2) ionische Flssigkeit und Enzyme
Schema 3.3 Schema des apparativen Aufbaus
Die hohe katalytische Aktivitt und quantitativer der Umsatz wurden ebenfalls in drei
weiteren Zyklen beobachtet, wobei die Ausbeute mit jedem Zyklus zunahm und schlielich
98 % betrug (siehe Abbildung 3.3). Dies stimmt mit den Beobachtungen von Brennecke, bei
der Extraktion von Naphthalin aus [BMIM] [PF6], berein (siehe Kapitel 1.4.3).
1 23
4
Ausbeute
Umsatz0
20
40
Zyklus Nr.
60
80
100
[%]
Ausbeute Umsatz Abbildung 3.3 Recyclisierung des in Schema 3.2 dargestellten IL/Enzymansatzes
-
Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 31
Ebenfalls vollstndiger Umsatz konnte beobac t werden, wenn unmittelbar nach der Sub-
heit von CO in der ionischen Flssigkeit keinen Einfluss auf die Reaktion hat.
hren von Zosel mittels
berkritischem CO2 im groen Mastab betrieben wird, dass Hochdruckextraktionen mit
scCO2 durchaus mglich und rentabel sein knnen.[113, 117] Um Reaktionen aber mglichst
wirtschaftlich in berkritischem CO2 durchzufhren, ist es wichtig hohe Raumzeitausbeuten
fr die verwendeten Reaktoren zu erreichen, da dann die Reaktorkosten vernachlssigbar
werden. Raumzeitausbeuten sind generell in kontinuierlich arbeitenden Reaktoren hher als in
vergleichbaren diskontinuierlichen Reaktoren.[131] Aufgrund der gefundenen hohen
katalytischen Aktivitt der Lipase bei der Acylierung von 1-Octanol in ionischer Flssigkeit
und der konstant hohen Aktivitt ber vier Reaktionszyklen wurde versucht diese Reaktion in
einem kontinuierlich arbeitenden Reaktor durchzufhren. Dabei wurde ein 10 ml Fenster-
autoklav als kontinuierlich betriebener Rhrkessel verwendet. Es wurde eine Substratlsung,
bestehend aus 1-Octanol und Vinylacetat (molares Verhltnis: 1 : 2), mittels einer HPLC-
Pum In
Abbildung 3.4 erkennt man, dass der Umsatz ber 24 Stunden konstant hoch ist. Die mittlere
hte
stratzugabe direkt CO2 aufgepresst wurde. Damit konnte gezeigt werden, dass die Anwesen-
2
Wie bereits erwhnt erfordern Reaktionen in berkritischem Kohlendioxid Hochdruck-
apparaturen. Es ist einleuchtend, dass die Kosten fr Hochdruckreaktoren deutlich hher sind
als fr Normal- bzw. Niederdruckreaktionsgefe. Andererseits verdeutlicht die Tatsache,
dass die Entkoffeinierung von Rohkaffee nach dem Verfa
pe in den scCO2-Strom eingebracht, die dann die ionische Phase im Reaktor passierte.
Aktivitt liegt dabei bei 2400 molmin-1g-1. Zum Vergleich wurde eine zweite Versuchs-
reihe ohne ionische Flssigkeit und ansonsten identischen Bedingungen durchgefhrt. Man
erkennt, dass der Umsatz ohne ionische Flssigkeit im Mittel um 10 % geringer ist.
-
Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 32
0
80
100
40Um
satz
[%] 60
20
0 5 10 15 20 25Zeit [h]
mit ionischer Flssigkeit ohne ionische Flssigkeit
Abbildung 3.4 Vergleich des Umsatzverhaltens fr die in Schema 3.2 dargestellten Reaktion in An- und Abwesenheit von ionischer
nd
amamoto fr diese simple direkte Kondensation im Science
Magazin verffentlicht, was fr die Aktualitt des Themas und die prparative Bedeutung fr
solche Reaktionen spricht.[132] Bei Verwendung solcher Substrate ist die richtige Wahl der
Reaktionsbedingungen im Zweiphasensystem ionische Flssigkeit/scCO2 entscheidend. Als
erste Reaktion dieses Typs wurde die in Sc a 3.4 dargestellte Veresterung von Isoamyl-
a r
Hauptbestandteil des Bananenaromas ist.
Flssigkeit im kontinuierlichem Betrieb
Neben aktivierten Vinylestern lassen sich aber auch direkte Kondensationen von Suren u
Alkoholen zum entsprechenden Ester durchfhren. Solche direkten Veresterungen sind
hinlnglich bekannt und scheinen auf den ersten Blick simple und standardisierte Reaktionen
darzustellen. Dennoch wurde erst krzlich ein neues Katalysatorsystem und ein spezieller
apparativer Aufbau von Y
hem
lkohol mit Hexansure zum entsprechenden Isoamylhexanoat untersucht, das de
OH + OH
O CaL B
O
O+ H2O
[BMIM][BTA]8 9 10 11
Schem lichen
g 3.5). Vergleicht man dazu die Ergebnisse, der ansonsten identisch durchgefhrten
a 3.4 Lipasekatalysierte direkte Kondensation von Hexansure und Isoamylalkohol in [BMIM] [BTA] im kontinuier
Betrieb
Bei der Wahl von Standardbedingungen, d.h. Durchfhrung der Reaktion bei niedriger
Temperatur (T = 45 C), kommt die Reaktion nach 24 Stunden nahezu zum Erliegen (siehe
Abbildun
Versuchsreihe bei 70 C, so sieht man, dass der Umsatz sogar ber einen Zeitraum von
75 Stunden konstant hoch ist. Der Grund fr das bessere Umsatzverhalten bei 70 C ist die
Tatsache, dass Wasser bei 70 C auf Grund eines hohen Dampfdruckes bei dieser Temperatur
-
Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 33
deutlicher besser lslich in scCO2 ist als bei 45 C. Auf dieses Phnomen wird detaillierter in
Kapitel 3.2 eingegangen.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Um
satz
[%]
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Zeit [h]
75 C 45 C
Abbildung 3.5 Einfluss der Temperatur bei der direkten Kondensation von Isoamylalkohol und Hexansure
Bei dieser Reaktion wurde der Alkohol zwecks Gleichgewichtsverschiebung im dreifachen
berschuss eingesetzt. Es sind aber auch Reaktionen bei 1 : 1 Stchiometrie mglich. Zum
Beispiel kann 1-Octanol mit Oktansure oder Ethanol und Hexansure in [EMIM][BTA] und
Candida antarctica Lipase B verestert werden. Zwar sind die Umstze auf Grund der
ungnstigeren Gleichgewichtslage nicht so hoch, dafr aber ebenfalls ber einen langen
Zeitraum konstant. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3.6 graphisch dargestellt.
0
10
20
30
40
0 0
Zeit [h]
50
Um
satz
[%]
60
70
80
90
100
10 2 30 40 50
1-Octanol nsur+ Okta e Ethanol u
ngzeitstabilitt von Candida antarctica Lipase B bei der direkten Kondensation von 1-Octanol mit Oktansure und
+ Hexans re
Abbildung 3.6 La
Ethanol mit Hexansure in der ionischen Flssigkeit [EMIM] [BTA]
-
Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 34
Fr die direkte Kondensation von 1-Octanol und Oktansure wurde noch eine weitere
Versuchsreihe angeschlossen. Dabei sollte untersucht werden, ob sich das Gleichgewicht
dieser Reaktion durch richtige Wahl der Extraktionsbedingungen verschieben lsst. Dazu
wurde der in Schema 3.5 dargestellte apparative Aufb u gewhlt. a
CO2
R1CO2
M
PT
CPPR
KF-1
GPT
EH
IL/E
R2
S/
HP
P
NV
tanoat und Wasser) im berkritischen CO2 gleich gut lsen sollten (vgl. Vorver-
such). Im Abscheider (R2) wurde mit 80 bar und 90 C eine deutlich niedrige CO2-Dichte bei
hoher Temperatur gewhlt. Bei diesen Bedingungen ist die Lslichkeit einer Verbindung stark
vom Dampfdruck abhngig und der Einfluss der Polaritt vernachlssigbar. Zu Beginn des
Versuches wurden im Abscheider 100 ml einer 1 : 1 Mischung der beiden Edukte vorgelegt.
Dieses Gemisch wurde mittels einer modifizierten HPLC-Pumpe in den vom Kompressor
ommenden CO2-Strom eingebracht. Nachdem der CO2-Strom den Reaktor R1 passiert hatte,
gelangte er nach Druckm 2
Schema 3.5 Apparativer Aufbau zur Verschiebung des Gleichgewichtes bei der direkten Kondensation non 1-Octanol und
Oktansure
Der Aufbau bestand prinzipiell aus zwei Einheiten. Einem Reaktor (R1) und einem Abschei-
der (R2), die ber einen Druckminderer (PR) miteinander verbunden sind. Im Reaktor R1,
einem 10 ml Autoklav mit Rhrkern, in dem sich 10 mg Candida antarctica Lipase B als
Lyophilisat in 2 ml der ionischen Flssigkeit [EMIM] [BTA] befanden, wurde mit 150 bar
und 60 C eine CO2-Dichte gewhlt, bei der sich die beiden Produkte der Reaktion
(1-Octylok
k
inderung in den Abscheider, indem sich sofort aus dem CO -Strom
eine Flssigkeit (S/P) abschied, die mittels der HPLC-Pumpe recyclisiert wurde. Der CO2-
Strom hingegen, in dem sich keine organische Komponente dafr aber Wasser lsen sollte,
wurde mittels eines Nadelventils auf Atmosphrendruck entspannt. Abbildung 3.7 zeigt das
-
Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 35
Umsatzverhalten der Reaktion bei Verwendung der Apparatur (Probennahme am Boden des
Abscheiders nach definierten Zeiten).
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
Zeit [h]
Um
satz
[%]
direkte Kondensation von 1-Octanol und Oktansure
Abbildung 3.7 Umsatzverhalten der direkten Kondensation von 1-Octanol und Oktansure bei Verwendung der in Schema 3.5
dargestellten Apparatur
Man erkennt, dass sich der Umsatz, gegenber dem in Abbildung 3.6 dargestellten Ergebnis,
deutlich steigern lsst. Allerdings konnte bei diesem Versuch nicht gezeigt werden, dass sich
auf diese Weise das Gleichgewicht verschieben lsst, denn es wurde neben dem Wasser auch
der Alkohol in deutlichen Mengen extrahiert. Nach Abbruch der Versuchsreihe war das
stchiometrische Verhltnis des Restgehaltes von Alkohol zu Sure im Abscheider daher
nicht mehr 1 : 1 sondern 1 : 2.5.
3.2 Kinetische Racematspaltung in ionischer Flssigkeit/scCO2
Neben achiralen Veresterungen lieen sich auch kinetische Racematspaltungen lipase-
katalysiert in ionischer Flssigkeit/scCO2 durchfhren. Zunchst wurde die in Schema 3.6
dargestellte Acetylierung von 1-Phenylethanol mit Candida antarctica Lipase B als
Biokatalysator untersucht.
OH
+ OO
[BMIM] [BTA], CaL B
- CH3CHOO
O
+ OH
(rac)-12 4 (R)-13 (S)-12 Schema 3.6 Kinetische Racematspaltung von (rac)-1-Phenylethanol mit Vinylacetat als Acylierungsmittel und Candida antarctica
Lipase B als Katalysator im ionischen Lsemittel [BMIM] [BTA]
Die Lipase zeigt im ionischen Lsemittel ber vier Reaktionszyklen eine hohe Enantio-
selektivitt, Aktivitt und Stabilitt (siehe Abbildung 3.8).
-
Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 36
1 2 34
(S)
(R)- cetat
-1-Phenylethanol
1-Phenylethyla0102030405060
8090
ee [%]
Zyklus Nr.
Abbildung 3.8 Ergebnisse der in Schema 3.6 dargestellten kinetischen Racematspaltung von (rac)-1-Phenylethanol
Die Produkte konnten nach beendeter Reaktion mit scCO2 aus der ionischen Flssigkeit
extrahiert werden und fielen i ie r i sig im li-
sierte Lipase konnte ohne Verlust an Aktivitt oder Abfall der Enantioselektivitt recyclisiert
erden.
biokatalytischen
Reaktion eine Komponente selektiv aus der io schen Flssigkeit extrahiert werden knnte.
Um d hrt,
anschlieend wurde aber nicht wie zuvor bei hoher Dichte extrahiert, sondern die CO -Dichte
100
70
lsemittelfre an. D in de onischen Fls keit mobi
w
Allerdings hat man bei kinetischen Racematspaltungen nach durchgefhrter Reaktion erst ein
Teil der notwendigen Arbeit zur Enantiomerentrennung durchgefhrt, denn Edukt und
Produkt mssen anschlieend voneinander separiert werden. Im oben geschilderten Fall
wrde eine ideale Prozessfhrung vorliegen, wenn nach der durchgefhrten
ni
ies zu untersuchen, wurde die in Schema 3.6 dargestellte Reaktion erneut durchgef
2
variiert. Die Variation der CO2-Dichte kann, wie in Kapitel 1.4.2 bereits gesagt, prinzipiell
auf zwei verschiedene Weisen erfolgen. Zum einen kann die Dichte durch Erhhen der
Temperatur oder durch Herabsetzten des Druckes gesenkt werden. In Abbildung 3.9 ist der
Zusammenhang zwischen Druck, Temperatur und CO -Dichte dargestellt.2
-
Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 37
-13 C
107 C87 C67 C47 C27 C
7 C
A
B
p / bar
C
A nl (CO2) = B ng (CO2)
/ g
ml-1
17
27 37Tc47 57 67 77
17
27C
O2 (
l + g
)
CO
2 (l) CO2 (SCF)
(CO2, SCF) = 0.70 g / ml:
Abbildung 3.9 Die Dichte von reinem CO2 als Funktion des Drucks und der Temperatur[133]
Die Extraktion wurde bei einer Temperatur von 60 C durchgefhrt und der CO2-Druck
schrittweise erhht. Tabelle 3.2 zeigt die Ergebnisse dieser selektiven Extraktion die durch
Verwendung unterschiedlicher CO2-Dichten erzielt werden kann. Tabelle 3.2 Extraktion der Produkte der in Schema 3.6 dargestellten Reaktion bei 60 C und unterschiedlichen CO2-Drcken
Khlfalle Zeit Druck Auswaage Selektivitt ee (R)-13 ee (S)-12
Nr. [h] [bar] [g] [%] [%] [%]
1 2 70 0.06 58.8 (13) 99.3 98.9
2 4 90 0.29 56.7 (13) 99.2 99.3
3 7.3 150 0.06 72.5 (12) > 99.5 > 99.5
Zunchst wurde das Acetat auf Grund der geringeren Polaritt und der guten Lslichkeit von
Acetaten in scCO2 im Extrakt angereichert. Im spteren Verlauf der Extraktion erhlt man
schlielich den Alkohol.[134, 135] Diese Abhngigkeit der Lslichkeit von der Polaritt ist
hinlnglich bekannt und konnte bereits zuvor fr eine Reihe von verschieden polaren
Substanzen demonstriert werden (siehe Abbildung 3.10).
-
Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 38
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
0,1
1E-4
1E-3
0,01x
i gel
ste
Sub
stan
z
p / bar
15SH
15
15OH
15OH
O
H
Abbildung 3.10 Lslichkeit verschiedener funktioneller Gruppen berkritischem CO bei 47 C als Funktion des Drucks[136]
Allerdings von 59 %
tweder bedeutend besser oder schlechter CO2-lslich wrde als der
kor
Die re Polaritt, den Dampfdruck,
Coh bestimmt.[113] Bei
am beeinflusst
ampfdruck ber den Einfluss
ag
in 2
sind die in Tabelle 3.2 dargestellten Ergebnisse mit einer Selektivitt
eher mig. hnlich schlechte Ergebnisse wurden bei Verwendung von 1-(2-Naphthyl)
ethanol statt des 1-Phenylethanols erzielt. Auf Grund dieser schlechten Selektivitten bei der
Extraktion des Alkohols wurde eine neue Strategie entwickelt, um prparativ sinnvolle
Separierungsselektivitten bei gleichzeitig hohen Enantiomerenberschssen zu erhalten.
Eine nahe liegende Taktik war den zu bildenden Ester durch molecular engineering so zu
whlen, dass er en
respondierende Alkohol.
Lslichkeit einer Substanz in CO2 wird besonders durch ih
esive Energie und die Anwesenheit von speziellen CO2-philer Gruppen
der Variation der Extraktionseigenschaften des Esters wurde sich fr die nderung des
D pfdruckes entschieden, da dieser direkt durch die Kettenlnge des Acylrestes
wird. Wenn die Acylkette lang genug ist, sollte der niedrige D
der Polaritt berwiegen und der Ester sollte CO2 unlslicher werden. Erfreulicherweise l
mit Laurinsurevinylester, das als Copolymer fr die Olefinpolimerisation als Bulkchemikalie
hergestellt wird, ein gnstiges Acylierungsmittel mit langer Acylkette vor. Die diesem
Konzept einer Inversselektive Extraktion zu Grunde liegende Reaktion wrde also wie folgt
aussehen:
-
Enzymreaktionen in unkonventionellen Medien 39
R1 R2
OH
H(CH2)11
O
OR1 R2
OH
R1 R2
O
O
++
ionische FlssigkeitLipase
selektive Extraktion mit scCO2
-CH3CHO
Schema 3.7 Lipase