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Nuevos Avances en la clasificación de leucemias y linfomas: Análisis de muestras especiales para el diagnóstico de meningitis neoplásica mediante
citometría de flujo (CMF)
SANDRA QUIJANO GÓMEZ MSc. PhD. V Simposio Andino de Laboratorio y Medicina
2013
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Meningitis neoplásica
- Pacientes con Cáncer: 5% DeAngelis LM. J Neuro Oncol 1998 Chamberlain M. J. Neuro Oncol 2005
* Tumores sólidos: 4-15%
Chamberlain M. Neurologist. 2006
* Leucemias/Linfomas: 5-15%
*Complicación asociada a peor pronóstico
Haioun C . Ann Oncol 2000 Hollender. Ann Oncol 2002 Montoto S. Hematol Oncol Clin North Am 2005. Hegde U. Blood 2005. Bromberg J. Neurology 2007.
- Manifestación en pacientes sin evidencia de enfermedad sistémica (18% y 13%) o durante periodos de remisión (35% y 27%).
- Frecuencia variable:
Enfermedad sistémica avanzada (90%)
- Niños con LLA: recurrencia en SNC en >50%. Reducción con profilaxis.
Alhluwalia M et al. Cancer 2012.
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AFECTACIÓN SECUNDARIA DE SNC EN LNH-B AGRESIVOS Y LEUCEMIAS (5-15%)
LNH-B Agresivos Leucemias agudas Referencias
Frecuencia 2-27% - Linfoma de Burkitt: 30-60%
- Linfoma difuso de célula grande: 5-15%
*LNH bajo grado: <5%
3-5% (adultos LLA)
5-10% (adultos con L.A. profilaxis en SNC)
5-40% (recaída)
Surapaneni UR. Cancer 2002.
Recht L. Neurologic Clinics. 2003
Pui CH. Lancet 2008.
Criterios clínicos para predecir riesgo de recaída en SNC
-Subtipo Histológico: LB, LBDCG, LL.
-IPI alto, edad y estadios avanzados, estado general deteriorado.
-Afectación extraganglionar: MO, SP, senos paranasales, testículo, mama, pulmón, etc.
- >2 áreas extraganglionares.
- LDH elevada.
- LNH asociado a HIV
- LLA-L3, LLA-T, LMMA
- Alteraciones genéticas de alto riesgo: t(9;22)
- Expresión de CD56
- Hiperleucocitosis
- Enfermedad extramedular
- Tasa proliferativa elevada (S+G/M: >14%)
- LDH y b2-m elevadas
Chamberlain M. J. Neuro-Oncol. 2005
Igarashi S. J. Clin Oncol. 2005.
Pui CH. Lancet 2008.
Hollender A. Ann. Oncol. 2002.
Hegde U. Blood. 2005.
Bromberg JE. Neutology 2007.
Quijano S. J. Clin Oncol. 2009.
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“Estos patrones de migración son anormales en células tumorales” Son dependientes de las alteraciones genéticas en la célula tumoral
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Biomarcadores en LCR empleados para predecir meningitis neoplásica
Autor Tipo de Tumor Marcadores
Brandsma D. J. Neurol. 2006
Ca. Seno, Ca. Pulmón, Ca. Ovario, Melanoma, LNH.
Glucosa, proteínas, IL-8 (CXCL-8), PARC (CCL18), IP10 (CXCL10), CXCL12
van de Langerijt Neurology. 2006.
Ca. Pulmón Melanoma
Índices LCR/Suero VEGF/tPA/uPA/TGFb
Friedberg Cancer. 1998.
Melanoma, Ca. Seno, Carcinoma pulmonar de células pequeñas
MMP2 MMP9
Parámetros estándar de infiltración tumoral en LCR (Chamberlain M 2006)
Frecuencia
Recuento de leucocitos >4/mm3 57-65%
Concentración de proteínas >50 mg/dL 73-86%
Concentración de glucosa <60mg/dL 31-55%
Citología positiva 45-73%
VARIACION EN LA SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE ESTOS MARCADORES
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Rastreo diagnóstico de meningitis neoplásica
Presentación clínica (síntomas y signos neurológicos relacionados con infiltración meníngea) >90%
Técnicas de imagen (TAC, RMN, PET)
40-60%
Punción lumbar (Citología del LCR:20-
60% de falsos negativos)
Chamberlain et al. Semin Oncol 2009
Quijano S et al. J Clin Oncol 2009
Limitación: escasa sensibilidad y/o especificidad DIAGNÓSTICO SUBÓPTIMO:
NECESIDAD DE TECNICAS ALTERNATIVAS
Enting RH. Cancer Treat Res. 2005 Bromberg JE et al. Neurology 2007
Hegde U et al. Blood 2005
Schinstine M et al. Cancer 2006
Subira D et al. Am J Clin Pathol 2002
Alhluwalia M et al. Cancer 2012.
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- Bajo número de células - Baja concentración celular - Escasa viabilidad celular - Escaso volumen de muestra - Contaminación con SP
Limitaciones de la CMF en la detección de enfermedad leptomeníngea en LCR
Subira D et al. Am J Clin Pathol 2002
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Número de células en LCR
<5 leucocitos/uL
Meningitis bacteriana
- Recuentos oscilan entre: <100/ul (fases tempranas) hasta 60.000/ul - Predominio de PMN (90-95%)
Recuento normal
Meningitis viral
- Recuentos oscilan entre: 10/ul hasta >1000/ul - Predominio de MNC
Esclerosis Múltiple
- 75% de los casos: recuentos normales - 25%: pleiocitosis
de Graaf MT et al. Cytometry B Clin Cytom 2010.
de Graaf MT et al. Cytometry B Clin Cytom 2011.
Predominio, memoria central
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Volumen de muestra Ideal: 2-5 mL
Algunos reportes: 10-15 mL
Inmediato/antes de la primera hora/ máximo 3 horas
EDTA
Mantener 4°C
Muestras + medio de cultivo + BSA 0.5% ó medio + SFB 10%
Muestras no estabilizadas
Muestras Estabilizadas con
Transfix dilución final 1/10 Hasta 48-72 horas
Recomendaciones técnicas para el estudio de muestras de LCR por CMF
Preserva células entre 5-24 horas
Langerak AW. Leukemia 2012
Quijano S. J Clin Oncol. 2009
Kraan J. Curr Protoc Cytom 2008
de Graaf MT. Cytometry B Clin Cytom 2011
Subira D. Am J Clin Pathol 2002
Enting RH. Cancer Treat Res. 2005
Petzold A. Neurocit Care. 2006
LCR + RPMI + SFB 10%
Mantener a temperatura ambiente (21-23°C) Procesadas máximo
2 horas post-obtención
Tembhare P. Am J Clin Pathol 2012
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ESTABILIZAR LOS LCR antes de
Transportar al laboratorio Dux R et al. J Neurol Sci. 1994
Linfocitos en Buffer FC
Linfocitos en LCR Nativo
Monocitos/granulocitos en LCR nativo
>40% de leucocitos mueren dentro de 2h post-obtención de LCR Fishman RA, 1992
Recomendaciones técnicas para el estudio de muestras de LCR por CMF
Centrifugación (1-4x): pérdida del 16% de las células Recuentos absolutos no reflejarían los recuentos
celulares reales en la muestra
Dux R et al. J Neurol Sci. 1994
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Recomendaciones técnicas para el estudio de muestras de LCR por CMF
Definición de una población celular
Mínimo 13 eventos Combinaciones de 3 fluorescencias
Subira D et al. Am J Clin Pathol 2002
Mínimo 10 eventos Combinaciones de 6 fluorescencias
>25 eventos: positivo
10-25 eventos: sospechoso
<10 eventos: negativo
Quijano S et al. J Clin Oncol. 2009
de Graaf MT. Cytometry B Clin Cytom 2011
“Sensibilidad para definir el número mínimo de eventos depende del número
de parámetros evaluados” Ideal >4 fluorescencias
Kraan J et al. Curr Protoc Cytom 2008
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El uso de protocolos convencionales para el estudio inmunofenotípico de muestras
de SP, MO y tejido linfoide resulta subóptimo para el
estudio de muestras de LCR.
El manejo de muestras de LCR requiere unas condiciones especiales de almacenamiento,
transporte, preparación y marcaje.
Kraan J et al. Current Protocols Cytometry 2008
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Alhluwalia M et al. Cancer 2012.
ESTUDIO DE MENINGITIS NEOPLASICA: CMF versus CITOLOGIA
La mayoría de estudios incluyen pacientes de nuevo diagnóstico
29 hospitales en España
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ESTUDIO DE MENINGITIS NEOPLASICA POR CMF
Revisión de la literatura en el periodo 2005-2011: -Útil para la identificación y cuantificación de células tumorales de leucemia y LNH en LCR -La CMF tiene mayor sensibilidad que la citología convencional (CC) - Pacientes CC- y CMF+: son generalmente asintomáticos, tienen bajos recuentos celulares y bajos porcentajes de células tumorales en LCR
Alhluwalia M et al. Cancer 2012.
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ESTUDIO DE MENINGITIS NEOPLASICA POR CMF
- Síntomas clínicos asociados a infiltración de SNC:
- CMF+/CC+: 95% - CMF+/CC-: 58% (p<0.05)
- Pleiocitosis en LCR: - CMF+/CC+: 84% - CMF+/CC-: 25% (p<0.05)
- CMF es útil para la detección temprana de células tumorales en LCR antes de la aparición de síntomas clínicos.
Bromberg J et al. Neurology 2007.
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ESTUDIO DE MENINGITIS NEOPLASICA POR CMF
CMF CITOLOGIA
Sensibilidad 96% 73%
Especificidad 97% 94%
Valor predictivo positivo 96% 88%
Valor predictivo negativo 97% 76%
Alhluwalia M et al. Cancer 2012.
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ESTUDIO DE MENINGITIS NEOPLASICA POR CMF
- CMF es útil en casos en los que la CC es reportada como “sospechosa” o “atípica”.
-Necesaria la combinación de marcadores (>4 fluorescencias) -Se requieren futuros Consensos para definir paneles de anticuerpos, procesamiento técnico de la muestras, definir aplicabilidad clínica de la CMF. Recomendación: Usar las dos técnicas.
Alhluwalia M et al. Cancer 2012. National Comprehensive Cancer Network. http: www.nccn.org
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• LNH-B agresivos de nuevo diagnóstico, con
• Infiltración extranodal (testículo, mama, senos paranasales, MO, etc) y/o
• Niveles séricos elevados de LDH
CRITERIOS DE INCLUSIÓN (n=123)
• Estudio de CMF: a nivel centralizado.
• Estudio de citología: en el centro de origen.
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a. Fase pre-analítica
1.Muestras de LCR estabilizadas (Transfix, Immunostep SL)
Canonico B et al. J Immunol Methods 2004 Quijano et al. J. Clin Oncol. 2009
Previene pérdida celular por periodos Superiores a 24-48horas (MO y SP)
LCR: mantiene celularidad >10d a 2-8°C
2. Centrifugar (1x) y concentrar (300 mL) de la muestra
b. Fase analítica
EDTA
Kraan J, Orfao A, Quijano S et al. Current Protocols Cytometry 2008
(Quijano S et al. J Clin Oncol. 2009)
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Marcaje celular de 1/3 de la muestra
Adicionar esferas PerfectCOUNT (Cytognos SL) y Medir (Citómetro de flujo)
FITC PE PERCPCy5.5 PECy7 APC APCCy7
CD8-sIgl CD56-sIgk CD4-CD19 CD3 CD20 CD45
Negativo
Marcar de nuevo las 2/3 partes restantes
de muestra
Positivo
Panel adaptado al fenotipo del LNH-B
ANÁLISIS DE MUESTRAS DE LCR MEDIANTE CMF
Anticuerpo específico Conjugado con fluorocromo
Antígeno de superficie
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DETECCIÓN DE INFILTRACIÓN DE SNC EN LNH-B AGRESIVO:
CMF versus Citología (n=123)
100%
75%
50%
25%
0% CMF Citología
RESULTADOS
CMF Citología P Infiltración
de LCR 27/123 (22%) 7/123 (6%) <0,0001
Positivos Negativos
Quijano S et al. J. Clin. Oncol. 2009; 27(9): 1462-9
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FRECUENCIA DE CÉLULAS B NEOPLÁSICAS EN MUESTRAS DE LCR INFILTRADAS POR CMF
Punto de corte CC: >20% y >1 célula B neoplásica/mL
(Quijano S et al. J Clin Oncol. 2009)
Otros trabajos el punto de corte para la CC es de mínimo 5% de células neoplásicas.
CMF detecta rango de 0.1%-99% de células neoplásicas
(Levin N et al. J Neurooncol. 2008)
*p<0,001 *p<0,001
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MUESTRA DE LCR REACTIVA DE UN PACIENTE CON LBDCG
Células T Monocitos Quijano S et al. J Clin Oncol. 2009
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ENFERMEDAD LEPTOMENÍNGEA EN UN PACIENTE CON LBDCG (LF-t) Y
BAJO NIVEL DE INFILTRACIÓN DE LCR
Células T Células B patológicas (6%)
Quijano S et al. J Clin Oncol. 2009
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ENFERMEDAD LEPTOMENÍNGEA EN UN PACIENTE CON LBDCG (LF-t) e INFILTRACIÓN ELEVADA DEL LCR
Células T Células NK Monocitos Células B patológicas (78%)
Quijano S et al. J Clin Oncol. 2009
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Seguimiento: 105/123 (85%) 20 meses (rango 10-33 meses)
European J. Hematology 2010; 85 (4): 821-8.
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Seguimiento: 105/123 (85%) 20 meses (rango 10-33 meses)
2.4%
13%
28.5%
p<0,05
Sancho JM, Orfao A; Quijano S. European J. Hematology 2010; 85 (4): 821-8.
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ANALISIS DE SUPERVIVENCIA TOTAL DURANTE EL SEGUIMIENTO
Sancho JM, Orfao A; Quijano S. European J. Hematology 2010; 85 (4): 821-8.
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Aplicación de protocolo estandarizado de LCR por CMF en otras neoplasias:
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“Sreening” de linfoma en muestras de LCR y humor vítreo (LNH oculo-cerebrales)
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Langerak AW et al. Leukemia 2012.
CD45: marcador pan-leucocitario
11 anticuerpos en 8 fluorescencias + Forward Scatter + Side Scatter
CD45 CD3 CD4 CD8
Linfocitos T CD45 CD19 CD20 Kappa Lambda
Linfocitos B
CD45 CD56
Células NK
CD45 CD38 CD19
Células plasmáticas
CD45 CD14
Monocitos
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EDTA
Validación del tubo SST en muestras de LCR y biopsias vítreas:
Recolección de las muestras en tubos con Transfix
(Tubes&Transfix,Immunostep SL, Salamanca)
ó
Tubos con medio de cultivo + BSA 0.5% ó medio + SFB 10%
Langerak AW et al. Leukemia 2012.
Pellet celular
+ PBS +
BSA 0.5%
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Langerak AW et al. Leukemia 2012.
Linfocitos T
Linfocitos B
Kappa+
Lambda+
T CD8+
T CD4+
Kappa+
Lambda+
T CD8+
T CD4+
Linfocitos T
Linfocitos B
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-Analizan 114 muestras de LCR con tumores hematológicos: 10 muestras (LNH agresivos) con eventos atípicos en FSC vs SSC, CD45-, CD235a- - Estos pacientes fueron tratados con Citarabina liposomal (citarabina libre es detectable por más de 14 días después de la administración, liposomas miden 3-30 um)
linfocitos Cytometry B Clin Cytom. 2012 liposomas
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Linfocitos T patológicos CD3+/CD8+dim Sangre periférica
LCR
1. Análisis del fenotipo y repertorio TCRVb en SP 2. Selección de marcadores en LCR 3. La presencia de abundantes linfocitos T reactivos
en LCR podría dificultar el análisis de Células T clonales
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GRACIAS