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O que são genes HOX/Homeobox/Homeóticos?
Codificam FATORES DE TRANSCRIÇÃO que causam
HOMEosisHOMEO: similar
Sis: transformação
Propriedades das Proteínas Homeóticas
1. São fatores de transcrição com um domínio ligante a DNA (domínio homeobox ou homeótico)
2. O domínio homeobox tem cerca de 60 aminoácidos conservados
E. B. Lewis, Nature 276, 1978, 565.
2. As proteínas Homeobox estão agrupadas no genoma, i.e. são genes vizinhos
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3.Os genes homeobox/homeóticos definem os segmentos corporais
Mutações homeóticas trocam segmentos corporais
Ultrabithorax
Antennapedia
4. A ordem dos genes homeóticos no cromossomo corresponde à ordem temporal e espacial em que são expressos -> colinearidade
Mudanças no
número de
genes
Mudanças no
padrão de
Expressão
Mudanças
no genes-
alvo
COMO QUE AS DIVERSIDADES DE PLANO CORPORAL PODEM SER GERADAS?
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Mudanças no
número de
genes
Mudanças no
padrão de
Expressão
Mudanças
no genes-
alvo
COMO QUE AS DIVERSIDADES DE PLANO CORPORAL PODEM SER GERADAS?
1. QUESTÕES LEVANTADAS: a evolução dos próprios Hox
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Ferrier and Holland, 2001Nat Rev Genet 2001 Jan;2(1):33-8.
1. QUESTÕES LEVANTADAS: a evolução dos Hox no contexto da evolução de planos corporais
FILOGENIAEvolução da sequência
SINTENIAPosição cromossomal
** Evento de duplicação
O problema da classificação filogenética baseada em homologia de sequência é a evolução funcional
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O problema da classificação por sintenia são as inversões... A validação da classificação é realizada por testes funcionais
inter-espécies
Mudanças no
número de
genes
Mudanças no
padrão de
Expressão
Mudanças
no genes-
alvo
COMO QUE AS DIVERSIDADES DE PLANO CORPORAL PODEM SER GERADAS?
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Mudanças no
número de
genes
Mudanças no
padrão de
Expressão
Mudanças
no genes-
alvo
COMO QUE AS DIVERSIDADES DE PLANO CORPORAL PODEM SER GERADAS?
O que gera a diferença de asas em Diptera e Lepidoptera?
Normal
T1T1T2
AntpDeleção para Ubx
T2
Antp
Anterior Posterior
T1T1T2
AntpT3
Ubx
Segmentos torácicos
A mutação/ inativação de Ultrabithorax (ubx) extende o limite posterior do segmento torácico
OU, a ausência de Ubx permite crescimento de asas
O que pode ter acontecido em borboletas?
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A mutação/ inativação de Ultrabithorax (ubx) extende o limite posterior do segmento torácico
O que pode ter acontecido em borboletas para que tenham2 asas?
(a) Ausência de Ubx em ambos segmentos torácicos(b) Presença de Ubx em ambos segmentos torácicos(c) Ubx apenas no primeiro segmento torácico(d) Ubx apenas no segundo segmento torático
Como você verificaria a sua hipótese?
(a) Imunofluorescência para Ubx em embriões de borboleta(b) Imunufluorescência para Ubx em borboletas eclodidas(c) qPCR do embrião para Ubx(d) Hibridação in situ para Ubx no embrião
Como você verificaria a sua hipótese?
(a) Imunofluorescência para Ubx em embriões de borboleta(b) Imunufluorescência para Ubx em borboletas eclodidas(c) qPCR do embrião para Ubx(d) Hibridação in situ para Ubx no embrião
Ubx
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A mutação/ inativação de Ultrabithorax (ubx) extende o limite posterior do segmento torácico
O que pode ter acontecido em borboletas para que tenham2 asas?
(a) Ausência de Ubx em ambos segmentos torácicos(b) Presença de Ubx em ambos segmentos torácicos(c) Ubx apenas no primeiro segmento torácico(d) Ubx apenas no segundo segmento torático
Ubx DSRF ASC Wg
Genes-alvo de Ubx na asa
Sean Carroll
A diferença entre as asas está nos genes-alvo regulados por Ubx
Sean Carroll
A diferença entre as asas está nos genes-alvo regulados por Ubx
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ACAGTGA CCTGAGC
HOX
TFTF
TF
Os genes HOX coordenam a expressão de outros fatores de transcrição
ACAGTGA CCTGAGC
HOX
TF
COMO QUE A FUNÇÃO DE UM FATOR DE TRANSCRIÇÃO PODE VARIAR?
1) Alteração na sequencia proteica do fator de transcrição
2) Alteração na região genômica-alvo reconhecida
A diferença estrutural entre o Ubx de Onychophora e de Drosophila afeta a sua capacidade de regulação gênica –GENES ALVOS DIFERENTES
a) O Ubx de Onychophora não transforma torácico em abdominal
b) O Ubx de Onycophora não reprime apêndices torácios (Distal-less)
O domínio repressor de Ubx de insetos surgiu como repetições de ALAninas.
Gallant e Carroll, Nature 2002
Grenier, 2000
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Mas e o Crustáceo (artemia) que tem múltiplos apêndices locomotores?
a) O Ubx de Artemia transforma torácico em abdominalb) O Ubx de Artemia não reprime apêndices torácicos
Espécie Conversão de Toracico para
Abdominal
Repressão de apêndices torácicos
Drosophila SIM SIM
Artemia SIM NÃO
Onychophora NÃO NÃO
A deleção de uma região C-terminal de ArtUbx aumenta a capacidade de repressão de ArtUbx
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A deleção de uma região C-terminal de ArtUbx aumenta a capacidade de repressão de ArtUbxA fusão desta região C-terminal com o DrosUbx reduz a capacidade de repressão da DrosUbx
?a) 5%b) 75%c) 15%d) 100%
E se mantiver a região C-terminal de ArtUbx e adicionar ALAninas nesta região?
O Ubx de crustácoes tem um domínio na região C-terminal que “ameniza” a capacidade repressora
Espécie Conversão de Toracico para
Abdominal
Repressão de apêndices torácicos
Drosophila SIM SIM
Artemia SIM NÃO
Onychophora NÃO NÃO
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COMO QUE A FUNÇÃO DE UM FATOR DE TRANSCRIÇÃO PODE VARIAR?
1) Alteração na proteína
2) Alteração na região genômica-alvo
Hox 6
Hox 10
Hox 6 induzem costelas
e Hox10 reprimem
Myf5/Myf6
Enhancer H1
Hox 6 induzem costelas através de Myf5/Myf6 e Hox10 reprimem expressão de Myf5/Myf6
Myf5/Myf6HOX10
Enhancer H1
Hox 6 induzem costelas através de Myf5/Myf6 e Hox10 reprimem expressão de Myf5/Myf6 ao se ligar no enhancerH1
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Myf5/Myf6HOX10
Enhancer H1
Hox 6 induzem costelas através de Myf5/Myf6 e Hox10 reprimem expressão de Myf5/Myf6 ao se ligar no enhancerH1
A análise comparativa da região H1 de camundongos e cobras revela um nucleotídeo de diferença
Esta diferença está presente em diversas cobras e membros da Paenungulata
Vértebras
torácicas
Paenungulata >19
Esta diferença está presente em diversas cobras e membros da Paenungulata
231 vértebras torácicas
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Myf5/Myf6HOX10
Enhancer H1
Hox 6 induzem costelas através de Myf5/Myf6 e Hox10 reprimem expressão de Myf5/Myf6 ao se ligar no enhancer H1
Myf5/Myf6
HOX10
Enhancer H1
Hox 6 induzem costelas através de Myf5/Myf6 e Hox10 não reprimem expressão de Myf5/Myf6
Mudanças no
número de
genes
Mudanças no
padrão de
Expressão
Mudanças
no genes-
alvo
COMO QUE AS DIVERSIDADES DE PLANO CORPORAL PODEM SER GERADAS?
COMO ISTO PODE GERAR DIVERSIDADE?
O LIMITE ANTERIOR DO DOMÍNIO DE EXPRESSÃO DE UM
CONJUNTO DE HOX DETERMINA O FIM DOS SEGMENTOS ANTERIORES A ESTES
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A combinação de perfis de expressão gênicas resulta na diferenciação dos segmentos corporais
O que determina o número de pataslocomotoras vs. Maxilipídeos?
maxilepídeo Pata locomotora
T1
T1 T2 T3
T1 T2 T3 T4
Mysidium
Perielimenes
Triops
(Averof e Patel, 1997)
Mysidium
T1
T1
T1
T2
T2
T2
T3
T3
T3
Tórax
Perielimenes
Os segmentos torácicos variam na expressão de Ubx+Abd
Averof, 1997
T4
Ubx+abd
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T1
T1 T2 T3
T1 T2 T3 T4
O primeiro segmento a desenvolver uma pata locomotora é a que expressa Ubx+Abd
A segmentação da espécie varia de acordo com a expressão de Ubx e abdA
Hox13 determina o final da extensão axial (crescimento céfalo-caudal)Eé expresso em níveis reduzidos na cobra
COMO É REGULADO A EXPRESSÃO DE GENES HOX?
molecularmente
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HOX
COMO É REGULADA A EXPRESSÃO DOS PRÓPRIOS HOX?
Tradução Degradação do RNAm
REGULAÇÃO A NÍVEL DE TRANSCRIÇÃO
GCR= Região de controle globalEnhancer Inicial(contém elementos sensíveis a Ac. Retinoico)
O modelo atual para controle da transcrição no grupamento Hox:
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( (Modificações epigenéticas determinam a expressão gênica
Jacqueline Deschamps* and Johan van Nes 2005
As modificações epigenéticas resultam em mudanças estruturais na cromatina
)Ocorre mudanças epigenéticas consistentes com a colinearilidade de expressão dos Hox
Montavon e Doboule, 2013
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A diferenciação celular gera/é gerada por áreas de interação de Domínios Topologicamente Associados (TAD) que mudam
A evolução no desenvolvimento pode ser mediada por elementos novos em um TAD
QUE FATORES DE TRANSCRIÇÃO SE LIGAM AOS ENHANCERS QUE CONTROLAM A TRANSCRIÇÃO DE HOX?
O fator de transcrição Oct4 e a proteína extracelular Gdf11* regulariam a expressão de regiões diferentes dos grupamentos Hox
*possivelmente pelo fator de transcrição Smad
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Oct4 e Gdf11* atuam em domínios genômicos topologicamente associados (TADs) distintos
*possivelmente pelo fator de transcrição Smad
Ou seja, Ocg4 e Gdf11 estaria hierarquicamente acima de Hox
PORQUÊ AS COBRAS NÃO TÊM PERNAS?
Hoxc6
Hoxc8
Hoxc8 DETERMINA A REGIÃO DO FLANCO
PORQUÊ SEU PADRÃO DE EXPRESSÃO VARIOU NA
EVOLUÇÃO?
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O HOXC8 em aves tem um domínio de expressão mais curto
Belting et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998)
Comparação do Enhancer Imediato de camudongo e galinha
O Enhancer imediato de Camudongo confere ao gene LacZ (sob seu controle) uma expressão mais anterior
COMPARAÇÃO DO CONTROLE ESPACIAL DE ENCHANCER IMEDIATO DE CAMUDONGO X AVES
PNAS 100 (26): 15666-9, 2003Anand et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Dec 23;100(26):15666-9.
Comparação do Enhancer Inicial de Hoxc8 entre diferentes espécies
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HOX
COMO É REGULADA A EXPRESSÃO DOS PRÓPRIOS HOX?miRNA e RNA antisenso
Nature Review Genetics. Outubro 2002
O miRNA é gerado pela transcrição de uma região não-codificante e interfere na expressão do gene-alvo
Nature Reviews Molecular Cell Biology 5, 827-835 (October 2004
O Anelamento de miRNA a região 3´não-traduzida do RNAm pode interferir na sua tradução
O RNAm para Ubx tem regiões passíveis de regulação por miRNA
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No estádio 10:1)o miRNA e o Ubx estão em células diferentes 2)3´UTR do Ubx tem poucos sítios para miRNA
No estádio 15:1) o miRNA e o Ubx estão nas mesma células2)E o Ubx contém um 3´UTR com mais sítios para miRNA PORTANTO o miRNA pode modular a tradução de Ubx
Nature Review Genetics, Outubro 2008
Existem sítios para regulação por miRNA nos Hox de vertebrados também A região genômica de Hox contém sequências precursoras de miRNA
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ELEMENTOS DE REGULAÇÃO PÓS-TRANSCRICIONAL DE HOX:miRNARNA antisenso
HOX
COMO É REGULADA A EXPRESSÃO DOS PRÓPRIOS HOX?Ribossomos
Ribossomos são constituídos de rRNA+ proteínas
A proteína Ribosomal RPL38:
1)tem expressão restrita em alguns segmentos
2)Controla a expressão de alguns genes Hox
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Camudongos Heterozigotos para a deleção da proteína ribossomal RPL38 apresentam transformações homeóticas
Modificado deThe Shape of Life Rudolf A. Raff
•Modificação de enhancers dos Hox•Sítios-alvo de microRNA•Disponibilidade de proteína ribossomal (!)
Duplicação genômica
ANCESTRAL
Hox novos Hox conservados
Padrão modificado Padrão conservado
•Modificação de sítios-alvo reconhecidos por Hox
•Modificação de domínios proteicos