Download - Oferta del Servicio de Proteómica
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Curso Espectrometría de masas, Electrospray Trampa Iónica y
Maldi-TofUNIVERSIDAD FRANCISCO DE VITORIA
Alberto Jorge GarcíaLaboratorio de Proteómica
Centro de Biología Molecular Severo OchoaUniversidad Autónoma de Madrid-CSIC
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Oferta del Servicio de Proteómica
• www2.cbm.uam.es/proteomica• Análisis mediante Espectrometría de
Masas• Identificación sistemática de proteínas
presentes en las bases de datos a partir de geles
• La Síntesis de Péptidos es un servicio independiente
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Proteoma
Proteína
Péptidos
Fragmentos
BASE DEDATOS
BASE DEDATOS
Identificación Proteína
Identificación Péptido
Proteómica:
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Servicio de “Proteómica”
• Digestión manual en gel
• Análisis mediante MALDI-TOF:• Obtención del mapa peptídico e identificación
mediante huella peptídica (PMF)
• Análisis mediante LC-ESI-IT• Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión
dinámica (DE), búsqueda en DB mediante TurboSequest
• Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos determinados: Monitorización de iones sencillos (SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó confirmación mediante predicción teórica de fragmentación
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Requisitos para la preparación de geles
• Reactivos• Manipulación
– Frescos, alto grado de pureza.– Muy cuidadosa, queratinas, recipientes de vidrio– Precauciones en la preparación de la muestra
• Confección del gel– Lo más cercano posible a la entrega de la muestra– STD no preteñidos, no coloreados, no
recombinantes. En cantidades conocidas y MW conocidos
– No admitimos bandas ó spot recortados. Gel completo
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Requisitos para la preparación de geles
• Diseño del gel (monodimensional). Usuario– Minimizar el tamaño del carril para mejorar la
razón proteína:gel– Optimizar la resolución y enriquecer para muestras
muy complejas
• Geles 2 D (bidimensionales)– Incluido en la oferta de Servicio– Es crítica la preparación de la muestra por parte del
usuario (Precipitación con acetona)
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Tinción de geles• Tinción Coomassie
– Coomassie 0.2%/metanol 50%/10%acético. Fresco– Coomassie Coloidal, mayor contraste– No fijar con etanol, se forma acetato de etilo– Sensibilidad: 0.1 mg, Cuantitativo– Prácticamente nunca interfiere con la digestión
• Tinción con plata (no recomendada)– Sensibilidad: 1-10 ng, No es cuantitativa– Alta variedad en los protocolos de tinción– Interfiere con la digestión – Aumenta la necesidad de concentración de proteína,
bajo rendimiento y alto nivel de contaminantes
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Tinción de geles
• Tinción fluorescente (mono ó 2 D)– Sensibilidad: Igual ó mayor a la plata– Variedad de tinciones (SYPRO Ruby, SYPRO
Orange, SYPRO Red, Deep Purple…)– No interfiere con la digestión– La fluorescencia se puede medir en el Typhoon y
recortar las bandas en un transiluminador UV (300 nm)
– Disponible en el Servicio
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Digestión “in situ” de geles
• Procedimiento adaptado de Mann y cols. Con variaciones entre coomassie y plata.
• Control interno de cada gel digiriendo std de pm (descarta problemas atribuibles a la preparación/tinción del gel)
• Control externo con bandas/spots de geles ya procesados (descarta problemas atribuibles al proceso de digestión y preparación de muestra para MS)
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Servicio de “Proteómica”
• Digestión manual en gel
• Análisis mediante MALDI-TOF:• Obtención del mapa peptídico e identificación
mediante huella peptídica (PMF)
• Análisis mediante LC-ESI-IT• Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión
dinámica (DE), búsqueda en DB mediante TurboSequest
• Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos determinados: Monitorización de iones sencillos (SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó confirmación mediante predicción teórica de fragmentación
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Espectro de masas MALDI-TOF
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Resultados búsqueda en Mascot
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Asignación de péptidos en el mapa de MALDI
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Aspecto de un mapa cuando no hay digestión
Las masas provienen de queratinas y autoproteolisisde tripsina
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Mapa típico de digestión de queratinas
Contaminación por queratinasdentro del gel
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Sypro Rubi vs Plata
STD PM
2 1 0.5 0.25 0.1 2 1 0.5 0.25 0.1 2 1 0.5 0.25 0.1
Gel plata Gel SyproGel Syprodespués de
cortar
Picomoles
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Sypro Rubi vs PlataSTD 45 kDa 2 picomoles (88 ng)
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0
2 0 0 0
4 0 0 0
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8 0 0 0
1 0 0 0 0
a .i.
1 2 0 0 1 7 0 0 2 2 0 0 2 7 0 0 m /z
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
2 5 0 0
a .i.
Sypro
Plata
Péptidos de Ovalbúmina
T
TT
17 péptidos
8 péptidos
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Sypro Rubi vs PlataSTD 45 kDa 500 fmoles (22ng)
1 2 0 0 1 7 0 0 2 2 0 0 2 7 0 0 m /z
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
2 5 0 0
3 0 0 0
3 5 0 0
4 0 0 0
4 5 0 0
a .i.
1 2 0 0 1 7 0 0 2 2 0 0 2 7 0 0 m /z
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
2 5 0 0
3 0 0 0
3 5 0 0
a .i.
Sypro
Plata
T
M
TT
T
T T?
Péptidos de Ovalbúmina
10 péptidos
2 péptidos
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Sypro Rubi vs PlataSTD 45 kDa 250 fmoles (11 ng)
1200 1700 2200 2700 m /z
0
500
1000
1500
2000
2500
a.i.
1200 1700 2200 2700 m /z
0
500
1000
1500
2000
2500
a.i.
Sypro
Plata
T
T
M T
Péptidos de Ovalbúmina
T
M
T T
11 péptidos
3 péptidos
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Identificación mediante PMF
• Tres niveles de preparación de muestras:– Sensibilidad normal: método estándar en
placa de acero inoxidable (automatizable)– Alta sensibilidad: método “anchorchip” con
matriz HCCA y cristalización homogénea de Bruker (automatizable)
– Muy alta sensibilidad: método “anchorchip” con matriz DHB y cristalización heterogénea (no automatizable) Siempre trabajamos con este método
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Identificación mediante PMF• Métodos de calibración:
– Externa próxima, para búsquedas en DB con 100-150 ppm. Los espectros se adquieren con esta calibración
– Mediante “zonas prohibidas” (*) para búsquedas con 50-100 ppm. Se aplica a la lista de masas obtenida por calibración externa
– Interna de forma manual, mediante macro ó software (*) para búsquedas con 30-50 ppm
• Motores de búsqueda:– Internet (Mascot, Profound)
* Campillo, Martín and Vázquez
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Identificación mediante PMF
Causas por las que no se identifica una proteína
• Mapa con un nº insuficiente de péptidos• Mezcla de proteínas• Proteína no presente en DB• Alto nivel de contaminación• Modo en el que se genera la lista de masas
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Servicio de “Proteómica”
• Digestión manual en gel
• Análisis mediante MALDI-TOF:• Obtención del mapa peptídico e identificación
mediante huella peptídica (PMF)
• Análisis mediante LC-ESI-IT• Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión
dinámica (DE), búsqueda en DB mediante TurboSequest
• Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos determinados: Monitorización de iones sencillos (SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó confirmación mediante predicción teórica de fragmentación
![Page 24: Oferta del Servicio de Proteómica](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022012823/568130b7550346895d96d4ff/html5/thumbnails/24.jpg)
Identificación de péptidos presentes en DB mediante LC-
MS/MS ESI-IT
• Alta sensibilidad en modo “full scan”: Exclusión dinámica (DE), 100 fmoles para un digerido en solución de estándar de BSA
• Muy alta sensibilidad en modo SIM: “Monitorización de iones sencillos”, 1-10 fmoles para estándar de BSA
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Exclusión Dinámica (Triple-play)RT: 0.00 - 70.06
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100R
ela
tive
A
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60
65
70
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80
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95
100
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lativ
e A
bu
nd
an
ce
824.60
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948.37
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lativ
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947.44
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10
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25
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an
ce
754.41
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975.131292.661027.34 1180.22281.92 1745.601537.62404.43 1621.17
![Page 26: Oferta del Servicio de Proteómica](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022012823/568130b7550346895d96d4ff/html5/thumbnails/26.jpg)
![Page 27: Oferta del Servicio de Proteómica](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022012823/568130b7550346895d96d4ff/html5/thumbnails/27.jpg)
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40
50
60
70
80
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100
Inte
nsi
dad
Rel
ativ
a
736.3
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A
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0
10
20
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40
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655.6
656.2
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z = +2M = 1308.4
B C
400 600 800 1000 1200 1400m/z
0
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50
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Inte
nsi
dad
Rel
ativ
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704.5
1078.3
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295.21021.3463.5 764.3589.5
964.3 1325.0
V
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DMFVGGLSWDTSKK
M
MF
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400
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100
Inte
nsi
dad
Rel
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a
656.1
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378.0204.0 1106.11031.1333.1
541.0
DYVN I L YPQ
769.2
279.0
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Secuenciación de especies individuales en mezclas de péptidos
![Page 28: Oferta del Servicio de Proteómica](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022012823/568130b7550346895d96d4ff/html5/thumbnails/28.jpg)
Análisis mediante Espectrometría de Masas
• Análisis empleando MALDI-TOF– Muestras preparadas por usuario (incluye
portas y matriz)– Muestras preparadas por el Servicio
• Análisis empleando LC-ESI-IT de fracciones de péptidos provenientes de HPLC preparadas por usuario
![Page 29: Oferta del Servicio de Proteómica](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022012823/568130b7550346895d96d4ff/html5/thumbnails/29.jpg)
Equipos disponibles• Un espectrómetro de masas tipo MALDI-TOF, modelo
Autoflex de Bruker, equipado con reflector
• Un espectrómetro de masas de trampa iónica modelo LCQ Classic de Thermo Finnigan, equipado con sistemas de ionización de nanospray y microspray de fabricación propia, acoplado a una HPLC Agilent 1100 con restrictor de flujo inteligente (cedido en mayo 04 por un año)
• Interface “metal needle kit” para el acoplamiento LC-ESI-IT y columna RP de 180 mm, flujos de 1,5 a 2 ml/m
![Page 30: Oferta del Servicio de Proteómica](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022012823/568130b7550346895d96d4ff/html5/thumbnails/30.jpg)
Procedimiento de trabajo
• Recepción y control de muestras– Aviso previo a la entrega de geles– Escaneo del gel, – Confección de ficha de usuario,– Instrucciones del trabajo a realizar
• Análisis– Digestión manual en gel– Obtención del mapa peptídico mediante MALDI-
TOF– Análisis mediante LC-ESI-IT
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Personal del Servicio de Proteómica
• Rosana Rogado:– Laboral contratado temporal (CSIC), Ayudante de
Investigación y Laboratorio• Alberto Jorge:
– Laboral fijo (CSIC), Técnico de Investigación y Laboratorio
• Yolanda Núñez:– Funcionaria. Técnico Especialista de Grado Medio
• Anabel Marina: – Laboral interino (CSIC), Titulado Técnico nivel 2