![Page 1: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/1.jpg)
Identifikacija ljudi na osnovu bioloških tragova
Oliver Stojković, PhDsudskomedicinski genetičar
DNK laboratorija Instituta za sudsku medicinu, Medicinski fakultet
![Page 2: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/2.jpg)
O čemu ćemo danasrazgovarati
◼Osnove forenzičke genetike
◼ Istorijat razvoja tehnologije
◼Tehnologija DNK analize:(State of the art)
◼ Interpretacija rezultata
![Page 3: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/3.jpg)
Forenzička primena DNK analiza
◼ Kriminalistika (ubistva, silovanja, pljačke)
◼ Sporni paternitet (Iv Montan, Keba)
◼ Istorijske dileme(Tomas Jefferson, carska porodica Romanov, Despot Stefan Lazarević)
◼ Nestala lica (ICMP)◼ Identifikacija žrtava masovnih
nesreća (RTS, Bliznakinje u Njujorku)
◼ Vojne ogrlice (“Dog Tags”)◼ DNK registri osuđenika (Zakon o
nacionalnom DNK registru)
![Page 4: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/4.jpg)
Rođenje forenzičke genetike22. Nov. 1983. Lynda Mann pronađena mrtva
FSS: Napasnik ima A krvnu grupu (kao i 10 % populacije)
31. Jul 1986. Dawn Ashworth ubijena
FSS: Napasnik takođe ima A krvnu grupu
Richard Buckland uhapšen (i priznao)
Ali ima krvnu grupu 0!
Sir Alec Jeffreys sprovodi DNK analize
Buckland je bio NEVIN
Svi muškarci iz Leicestershire su tipizirani, ni
jedan profil se ne poklapa sa tragovima
Kafanske priče mogu biti opasne: Ian Kelly
priznao da je dao krv umesto Collina
Pitchforka
![Page 5: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/5.jpg)
Slučaj Helge Čevari
![Page 6: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/6.jpg)
Sudbina Romanovih
Carska familija Romanov: Velika knjeginja Tatjana, Anastazija, Marija,
Olga, Car Nikolaj II, Carica Aleksandra, Princ Aleksej (1916)
![Page 7: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/7.jpg)
„ Porodica Romanovih je pogubljena bez buržoaskih formalnosti, u skladu sa
našim novim demokratskim principima “ (“Moskovska vremena”, 1918).
Tela u grobnici
1. Demidova,
2. Dr. Botkin,
2. Olga,
4. Nikolai,
5. Maria,
6. Tatiana,
7, Alexandra,
8. Karitonov,
9. Trup
Ali: Aleksej i Anastasia
nedostaju
![Page 8: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/8.jpg)
Bivši srpski predsednik Ivan Stambolić, pronađen mrtav u šumi na Fruškoj Gori
![Page 9: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/9.jpg)
Odakle biološki tragovi
◼ Lokardov princip transfera:
– Kad god dva objekta dođu u kontakt, dolazi do razmene materije između njih
– Kada dve osobe (ili osoba i objekat) dođu u kontakt dolazi do transfera biološke materije
![Page 10: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/10.jpg)
Gde se mogu naći biološki tragovi
![Page 11: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/11.jpg)
Odakle biološki tragovi na mestu zločina?
◼ Od počinioca
◼ Od žrtve
◼ Od ostalih učesnika
◼ Od slučajnih prolaznika
◼ Od osoba koje su tu boravile ranije
◼ Od osoba koje su tu došle kasnije
![Page 12: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/12.jpg)
Biološki trag sa mesta zločinaili
Referentni uzorakBiologija
Izolovanje DNK
DNK kvantifikacija
PCR amplifikacija višestrukih STR markera
Tehnologija
Separacija i detekcija PCR produkata
Genotipizacija
GenetikaPoređenje genotipa sa drugim referentnim
genotipovima
Ukoliko se poklope genotipovi, utvrđivanje učestalosti
genotipa u populaciji
Prezentacija nalaza
Koraci u obradi DNK uzorka
![Page 13: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/13.jpg)
Malo bazične genetike
✓ DNK nasleđujemo po pola od svakog roditelja
✓Naša DNK je identična u svim tkivima
✓DNK se ne menja tokom života(ni nakon smrti)
![Page 14: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/14.jpg)
Svi smo genetički jedinstveni
◼ Humani genom je dugačak 3.2 milijarde nukleotida
◼ 99.9% DNK je identična među ljudima
◼ Malo matematike0.1% od 3 mldrd ≈ nekoliko miliona nukleotida
![Page 15: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/15.jpg)
Geni su smešteni u hromozomima
1013 ćelija7 pikograma DNK po ćeliji
![Page 16: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/16.jpg)
Humani genom23 para hromozoma + mtDNA
Polni hromozomi
mtDNA
16,569 bp
MitohondrijskaDNK
Hromozomi se nalaze u jedru
I u mitohondrijama postoji DNK
Autozomi u po dve kopije po ćeliji
![Page 17: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/17.jpg)
DNK ulazi u sastav hromozoma
![Page 18: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/18.jpg)
DNK: gradja molekula
◼ Nukleotidi – Dezoksiriboza
– Fosfatna grupa
– Azotna baza:◼ Adenin
◼ Timin
◼ Guanin
◼ Citozin
◼ A-T
◼ G-C
![Page 19: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/19.jpg)
DNK: polimorfizmi
Polimorfizam sekvence
adenin
timin
guanin
citozin
![Page 20: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/20.jpg)
DNK polimorfizmi: nastavak
UzastopnoPonovljene Sekvence2-7 bp=STR10-100=VNTRPolimorfizam broja ponovaka
![Page 21: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/21.jpg)
FBI CODIS DNA Database
Combined DNA Index System
◼ Povezivanje serijskih zločina
◼ Slučajevi sa počiniocima-povratnicima
◼ Započelo oktobra1998
◼ Povezuje svih 50 država
◼ Zahteva 13 STR markera
![Page 22: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/22.jpg)
13 CODIS standardnih STR lokusa i njihove pozicije na hromozomima
CSF1PO
D5S818
D21S11
TH01
TPOX
D13S317
D7S820
D16S539 D18S51
D8S1179
D3S1358
FGA
VWA
AMEL
AMEL
![Page 23: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/23.jpg)
Nije cela DNK informativna
Podaci
• Cela DNK =7pg=4x3,2 milijarde nukleotida
• Ciljni region 300 nukleotida (desetomilioniti deo)=7x10-18 grama
Problem
• Donja granica detektabilnosti: milijarditi deo grama
Rešenje
• umnožavanje genetičke informacije pre analize: kloniranje, PCR
![Page 24: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/24.jpg)
◼ U svakom ciklusu, broj kopija se udvostručuje
◼ Za 28-35 ciklusa DNK se amplifikuje milion do milijardu puta
PCR- molekularno fotokopiranje
![Page 25: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/25.jpg)
Multiplex PCR
◼ Simultano umnožavanje većeg broja gena (kraće vreme)
◼ Osetljivost velika (manje od 1 ng)(manje uzorka)
◼ Mogućnost analize mešanih i degradovanih uzoraka
![Page 26: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/26.jpg)
Fragmenti DNK generisani PCRomse razdvajaju elektroforetski
![Page 28: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/28.jpg)
Kapilarni sekvenatori
ABI 310
1 kapilara
30 uzoraka na dan
ABI 3100
16 kapilara
500 uzoraka/dan
ABI 3730xl96 kapilara
8000 uzoraka/dan
![Page 29: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/29.jpg)
Sirovi podaci iz elektroforeze
![Page 30: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/30.jpg)
PP16 Promega
CSF1PO
D5S818
D21S11
TH01
TPOX
D13S317
D7S820
D16S539 D18S51
D8S1179
D3S1358
FGA
VWA
AMEL
AMEL
D3S1358
TH01
D21S11
Amel
AmelD18S51
D5S818
D13S317
D7S820
D16S539
CSF1PO
vWAD8S1179
TPOX
Penta E
Penta D
FGA
![Page 31: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/31.jpg)
![Page 32: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/32.jpg)
Poređenjem sa ladderom dobija se DNK profil
![Page 33: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/33.jpg)
1 ng DNK
0,5 ng DNK
0,25 ng DNK
0,125 ng DNK
0,06 ng DNK
0,03 ng DNK
![Page 34: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/34.jpg)
![Page 35: Oliver Stojković, PhD · 2020. 12. 11. · DNK DNK kvantifikacija PCR amplifikacija višestrukih STR markera Tehnologija Separacija i detekcija PCR produkata Genotipizacija Genetika](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022053122/60a890c771562f5fa75057d5/html5/thumbnails/35.jpg)
PCR amplifikacija
Elektroforeza
Upoređivanje
Zaključivanje
Korišćenje forenzički validiranih hemikalija
Utvrđivanje dužine amplifikovanih fragmenata
Imenovanje alela
Sa referentnim uzorkom ili
bazom
Frekvencionistički i probabilistički pristup
Genotipizacija
Izolacija DNK
Dobijanje velike količine čiste DNK