Download - Patch-Clamp by Menegaz Danusa Ph.D
PowerPoint Presentation
Danusa Menegaz, Ph.D CCB/BQM/UFSCPatch-Clamp Technique
Universidade Federal de Santa CatarinaDepartamento de Bioqumica e Eletrofisiologia
NUBIOCEL (Ncleo de Bioeletricidade Celular)
1660 (Jam Swammerdam) estmulo eltrico; fio de prata; contrao muscular em sapos;1790 (Luigi Galvani) canais inicos e impulso nervoso entre neurnio motor e msculo em rs;1850 (Hermann Helmholtz) velocidade de propagao do impulso nervoso em milisegundos;1952 (Hodkin; Huxley), primeiro registro com eletrodos intracelulares - potencial de ao em neurnio de lula gigante 0.5 mm; prmio nobel em 1963;1976 (Neher; Sakmann), descoberta patch-clamp, single-channel, prmio nobel em 1991;
Histria da eletrofisiologia ao Patch-Clamp
Patch-Clamp Voltage-clamp (mV) e Current-clamp (pA)
Permite a investigao de um nico canal inico ou de mltiplos canais inicos numa clula individual;
Possibilita que a voltagem seja fixada para registro das correntes (pA) e que a corrente seja fixada para registro da voltagem (mV) (potencial de ao);
O princpio do mtodo isolar uma parte da membrana eletricamente do meio extracelular e registrar o fluxo de correntes atravs dos canais com o uso de um microeletrodo de alta condutncia;
Canais inicos esto envolvidos em diversas funes fisiolgicas como sinais neuronais, contrao muscular, ritmo cardaco, secreo hormonal e regulao do volume celular;
Porque?
Para qu?
Como?
Onde?
Eletrofisiologia Patch-Clamp
Transporte atravs da membrana plasmtica
Tipos de canais Inicos e fatores de ativao
Potencial de ao em clulas excitveis
Pulso de corrente (current-clamp) para medio da voltagem (potencial de ao)
Doenas envolvendo Canais inicos
Dor fsica e emocional
Mudanas patolgicas na frequncia de potenciais de ao eltricos em neurnios
http://www.thelancet.com/cms/attachment/2001010892/2003793423/gr3.jpgBloqueador de canais de Ca++ em neurnios pr-sinpticos
Role of Cannabinoids in PainManagement
Kv Atividade Eltrica da Clula -pancretica do pncreas e DIABETES
Gradiente eletroqumico
Preparao de solues fisiolgicas para prtica experimental
Meio extracelular Meio intracelular
Osmolaridade das solues experimentais
OSMMETRO
Equipamentos para tcnica de patch-clamp
Plataforma:Mesas anti-vibratrias;
Mecnica e ptica:Microscpio;Micromanipuladores;Pipetas;Sistema de Perfuso;
Eletrnica:Gaiolas de Faraday;Amplificadores;Digitalizao e Aquisio de Dados;Rudo;
Patch-Clamp Set-Up
Clulas Isoladas Fatias de Tecidos
Circuito Eltrico
Microeletrodo - Estirador de Pipetas
Passos para atingir a configurao cell-attached para medio de single-channel
Configuraes da tcnica de Patch-Clamp
Modelos de Single-channelModelos de Whole-cell
Pulso de voltagem (Voltage-clamp) para medio das correntes Canais de K+ e Cl-Canais de Na+ e Ca++
Canais de Sdio e Potssio solues experimentais para anular correntes interferentes
Canal de K+Canal de Na+
Kv Atividade Eltrica da Clula -pancretica do pncreas e DIABETES
Gradiente eletroqumico
(A)(C)(B)100 pA25 ms200 pA25 msControl (1)Wash-out (3)Glucose (2)TEA (4)Control (1)Wash-out (3)TEA (4)DTEBS (2)Ilhotas pancreticas
Clulas beta-pancreticas real-time videos
Clulas HEK293 transfectadas com canais BK Configurao Whole-cell (voltage-clamp)
Guanosina 100 M
200 pA100 ms
ATP 1 mMControlWash out TEA 20 mM
100 pA50 ms
Efluxo de K+ estimulados por ATP em clulas de Sertoli
Eletroporao em clulas de Sertoli Pulso de 1000 uA durante 20 ms
Muito Obrigada