UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
ESTUDO DA ATIVIDADE FARMACOLÓGICA DOS GLICOSÍDEOS ISOLADOS
DA Herissantia crispa L. (Brizicky) e Sidastrum paniculatum L. (Fryxell)
Malvaceae.
PAULO ROBERTO CAVALCANTI CARVALHO
RECIFE
2009
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
ESTUDO DA ATIVIDADE FARMACOLÓGICA DOS GLICOSÍDEOS ISOLADOS
DA Herissantia crispa L. (Brizicky) e Sidastrum paniculatum L. (Fryxell)
Malvaceae.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas, na área de Fisiologia, Farmacologia e Química Medicinal.
Orientadora: Profa Dra Silene Carneiro do Nascimento Co-orientadora: Profa Dra Teresinha Gonçalves da Silva
RECIFE 2009
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Carvalho, Paulo Roberto Cavalcanti Estudo da atividade farmacológica dos glicosídeos isolados
da Herissantia crispa L. (Brizicky) e Sidastrum paniculatum
(Fryxell) Malvaceae / Paulo Roberto Cavalcanti Carvalho .
Recife : O Autor, 2009.
95 folhas : il., fig., tab., quadros
Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB.
Ciências Biológicas, 2009.
Inclui bibliografia 1. Ciências biológicas - Farmacologia. 2. Fisiologia –
Química biológica. 3. Glicosídeos isolados – Atividade farmacológica I. Título.
615.012 CDU (2.ed.) UFPE 615.9 CDD (22.ed.) BC - 2009 - 018
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DEDICATÓRIA
Aos meus pais Djalma Carvalho e Cecília Maria Cavalcanti Carvalho pelo apoio e forças que sempre estiveram me dando para superar meus limites e vencer mais uma etapa de minha vida profissional.
A minha esposa Marizélia Maciel Carvalho e
minhas filhas Anna Letícia Maciel Carvalho e Larissa Lavínia Maciel Carvalho pelos momentos perdidos de convívio durante a construção desta tese.
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“A vida não é um corredor reto e tranqüilo que nós percorremos livres e sem empecilhos, mas um labirinto de passagens, pelas quais nós devemos procurar nosso caminho, perdidos e confusos, de vez em quando presos em um beco sem saída. Porém, se tivermos fé, uma porta sempre será aberta para nós, não talvez aquela sobre a qual nós mesmos nunca pensamos, mas aquela que definitivamente se revelará boa para nós.” (A.J.Cronin)
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AGRADECIMENTOS
A Deus pela força física e espiritual que estava ao meu lado durante esta
etapa da minha vida.
A Profa Dra Silene Carneiro do Nascimento pela orientação desse trabalho,
pelos conhecimentos transmitidos e pela enorme influência na minha vida
científica e acadêmica.
A Profa Dra Teresinha Gonçalves da Silva, minha enorme gratidão pela
preciosa orientação e confiança em meu trabalho.
A Profa Dra Maria de Fátima Vanderlei Souza do Laboratório de Tecnologia
Farmacêutica da Universidade Federal da Paraíba pelo fornecimento dos
produtos que foram estudados nesta tese.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação de Ciências Biológicas,
pela paciência e dedicação nas disciplinas.
A Profa Dra Maria Teresa Jansen de Almeida Catanho pela colaboração
prestada para a realização dos testes de atividade biológica.
A Profa Dra Paloma Lyz Medeiros pelo apoio e colaboração na
interpretação dos exames histopatológicos.
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A Maria Susete Mendonça, Maria D. Rodrigues e Maria Suely R. Cavalcanti
pelo apoio, contribuição e amizade.
Ao professor Jorge Rocha de Carvalho e professores do Departamento de
Educação Física da UFPE pelo apoio, ajuda e atenção dedicada.
Aos amigos Jaciana Aguiar, Tiago Lins e Lins e Lina pelas valiosas ajudas
e ensinamentos neste trabalho.
Aos amigos e colegas de turma do Doutorado. Aos colegas do Laboratório de Bioensaios para Pesquisa de Fármacos do
Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco.
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SUMÁRIO
1- Introdução 11 2- Objetivos 14 2.1- Geral 14 2.2- Específicos 14 3- Revisão de Literatura 17 3.1- Câncer 17 3.2- Inflamação 21 3.3- Dor 27 3.4- Plantas medicinais como fonte de novos fármacos 30 3.5- Família Malvácea: Características da Família Malvácea 35 3.6- Aspectos quimiotaxonômicos, etnobotânicos e etnofarmacológicos da família Malvácea 39 3.7- Considerações botânicas sobre o gênero Herissantia 44 3.8- Herissantia crispa L. (Brizicky) 45 3.9- Sidastrum paniculatum L. (Fryxell) 46 4- Referências 54 5- Artigo 1 69 6- Artigo 2 79 7- Conclusão 96
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LISTA DE FIGURAS
1- Figura 1. Distribuição de espécies de Malvácea no Mundo 36
2- Figura 2. Caracteres morfológicos mais evidentes em espécies de Malváceas 38 3- Figura 3. Herissantia crispa L. (Brizicky) 45 4- Artigo 1: Figura 1– Efeitos drogas sobre tumores Sarcoma 180 e Carcinoma de Ehrlich 73 6- Artigo 1: Figura 2 - Fotomicrografias de órgãos (fígado e rins) e tumor (Sarcoma 180) de camundongos sob ação do tilirosídeo 74
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LISTA DE TABELAS
1- Artigo 1: Tabela 1. Atividade citotoxica de substâncias isoladas da Herissantia crispa frente às células KB, NCI-H292 e HEp-2 72 2- Artigo 2: Tabela 2. Atividade citotóxica de substâncias isoladas de Sidatrum paniculatum frente às linhagens KB, NCI-H292 e HEp2 90 3- Artigo 2: Tabela 3 – Atividade Antiinflamatória
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RESUMO A busca por novas terapias para a cura do câncer, tratamentos do processo inflamatório e da dor, são ainda objetos de intensas investigações. Acredita-se que os produtos naturais em geral são importantes fontes de substâncias químicas biologicamente ativas com potencial e aplicabilidade terapêutica, sendo estas uma fonte de diversidade em termos de estrutura, propriedades físico-químicas e atividades biológicas. Sendo assim o presente trabalho teve como objetivo realizar o estudo citotóxico e farmacológico (atividade antitumoral, antiinflamatória e analgésica) de glicosídeos isolados das espécies Herissantia crispa L. Brizicky e Sidastrum paniculatum L. Fryxell (Malvaceae). As plantas foram coletadas na Pedra da boca, no município de Araruma – PB, e destas foram isoladas quatro substâncias identificadas como 3,7-di-O-α-L-raminosideo (diraminosídeo), 3-O-β-D-(6”-E-P-cumaroil)glicosídeo (tilirosídeo) e as misturas glicosilada e não glicosilada do β-sitosterol e estigmasterol. Os produtos foram testados quanto a atividade antitumoral sobre linhagens células neoplásicas (in vitro) e tumores murinos (in vivo). Para o estudo in vitro, fora utilizados células das linhagens NCI-H292 (carcinoma de pulmão humano), HEp-2 (carcinoma epidermóide de laringe humana) e KB (carcinoma epidermóide de boca), através do método do MTT. Na avaliação da citotoxicidade o diraminosídeo e o tilirosídeo não apresentaram resultados significativos em relação ao controle. Nos experimentos in vivo, os produtos foram testados em animais portadores do Sarcoma 180, onde o tilirosídeo, as misturas glicosilada e não glicosilada apresentaram resultado bastante promissores. O tilirosídeo foi testado frente ao e Carcinoma de Ehrlich e também inibiu significativamente o crescimento tumoral.O diraminosídeo não inibiu o crescimento tumoral. Na avaliação histopatólogica dos tumores e órgãos do grupo controle e grupos tratados, observou-se que os animais tratados com o tilirosídeo apresentaram leves alterações renais. No teste de air pouch induzido por carragenina e contorções abdominais induzidas por ácido acético o tilirosídeo, diraminosídeo e a mistura de esteróides glicosilados apresentaram atividade antiinflamatória e analgésica promissoras. Os resultados obtidos demonstraram que os produtos testados apresentam atividades antitumoral, antiinflamatória e antinociceptiva, justificando a continuidade de estudos aprofundados para investigação do mecanismo de ação. Palavras-Chave: Atividade Biológica; Produto Natural; Glicosídeos isolados.
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ABSTRACT The search for new therapies to cure the cancer, treatment of the inflammatory process and pain, are still objects of intensive investigations. It is believed that the natural products in general are important sources of biologically active chemicals with therapeutic potential and applicability, which are a source of diversity in structure, physicochemical properties and biological activities. Therefore this study aimed to carry out the study and cytotoxic drug (antitumor activity, anti-inflammatory and analgesic) of glycosides isolated from species Herissantia crispa L. Brizicky and Sidastrum paniculatum L. Fryxell (Malvaceae). Plants were collected at the mouth of the Pedra, municipality of Araruma - CP, and these were isolated four substances identified as 3,7-di-O-α-L-raminosideo (diraminosídeo), 3-O-β-D-( 6 "-EP-cumaroil) glycoside (tilirosídeo) and mixtures of glycosylated and non -sitosterol and stigmasterol. The products were tested forβglycosylated antitumor activity on tumor cells (in vitro) and murine tumors (in vivo). To study in vitro, was used for cell lines NCI-H292 (human lung carcinoma), HEp-2 (squamous cell carcinoma of human larynx) and KB (carcinoma of the pharynx) by the method of MTT. In the evaluation of the cytotoxicity diraminosídeo and tilirosídeo showed no significant results and the control. In experiments in vivo, the products were tested in animals bearing the sarcoma 180, where the tilirosídeo, mixtures glycosylated and non glycosylated showed very promising results. The diraminosídeo did not inhibit tumor growth. The tilirosídeo and was tested against the Ehrlich carcinoma and also significantly inhibited tumor growth. In the histopathological evaluation of tumors and organs of the control group and treated groups, it was observed that animals treated with tilirosídeo had mild renal changes. The testing of air pouch induced by carrageenan and contorções abdominal induced by acetic acid to tilirosídeo, diraminosídeo mixture of steroidal glycosides and showed promising analgesic and antiinflammatory activity. The results showed that the products tested have antitumor activity, anti-inflammatory and antinociceptive, justifying the continuation of studies to investigate the mechanism of action. Words-Key: Biological activities; Natural Products; Glycosides isolated.
Estudo da atividade farmacológica dos... 11
1- INTRODUÇÃO
As plantas medicinais são utilizadas pela humanidade desde tempos
imemoriais. A busca por alívio e cura de doenças pela ingestão de ervas e folha
talvez tenha sido uma das formas mais importantes de utilização dos produtos
naturais na vida do homem, e estas sempre exerceram um verdadeiro fascínio ao
longo de toda a história da humanidade em muitas pessoas sensíveis à influência
da natureza. A história do desenvolvimento das civilizações Oriental e Ocidental é
rica em exemplos da utilização de recursos naturais na medicina, no controle de
pragas e nos mecanismos de defesa, merecendo destaque à civilização Egípcia,
Greco-romana e Chinesa (CECHINEL-FILHO; YUNES, 2001; VIEGAS et al,
2006).
Entre as primeiras civilizações como os sumérios e os povos babilônicos,
as plantas como a canela e o coentro já eram utilizadas para fins medicinais na
forma de infuso, vinho e emplastro. Desde as civilizações mais antigas as
pessoas confiam nas plantas como arsenal profilático ou terapêutico na
recuperação e manutenção da saúde (ANDRADE et al., 2007).
Hoje se tem certeza que os produtos naturais em geral são importantes
fontes de novas substâncias químicas biologicamente ativas com potencial e
aplicabilidade terapêutica, sendo estas uma fonte de diversidade em termos de
estrutura e de propriedades físico-químicas e biológicas (VEIGA-JÚNIOR;
PINTO,2005; ANDRADE et al., 2007).
O emprego de plantas medicinais hoje em dia ainda é uma das fontes mais
interessantes e exploradas para o desenvolvimento de novas drogas
quimioterápicas, antiinflamatórias e analgésicas (RATES, 2001), onde estas
Carvalho, P. R. C.
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11Estudo da atividade farmacológica dos...
podem representar uma alternativa menos tóxica aos medicamentos comerciais.
Além disso, sua utilização tem papel vital para sanar as necessidades básicas de
saúde nos países em desenvolvimento. Isto gera grande interesse na realização
de screening dessas plantas, para avaliar seu potencial medicinal, comparando os
resultados de estudos científicos com os propagados pela medicina popular
(AWAD et al., 2001).
O presente trabalho tem por objetivo contribuir para a pesquisa científica no
que se refere à investigação farmacológica de produtos isolados da Herissantia
crispa L. (Brizicky) e Sidastrum paniculatum L. (Fryxell) Malvaceae, em modelos in
vitro e in vivo, na perspectiva de encontrar novos agentes terapêuticos.
Carvalho, P. R. C.
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13Estudo da atividade farmacológica dos...
2. OBJETIVOS:
2.1. GERAL
• Realizar o estudo citotóxico, farmacológico (atividades antitumoral,
antiinflamatória e analgésica) de glicosídeos isolados da espécie
Herissantia crispa L. (Brizicky) e Sidastrum paniculatum L. (Fryxell)
Malvaceae.
2.2. ESPECÍFICOS
• Avaliar a atividade citotóxica dos glicosídeos isolados da Herissantia crispa
L. Brizicky e Sidastrum paniculatum L. Fryxell (Malvaceae) em linhagens
celulares NCI-H292 (carcinoma de pulmão), HEp-2 (carcinoma de laringe) e
KB (carcinoma epidermóide de boca);
• Avaliar a atividade antitumoral dos glicosídeos tilirosídeo, diraminosídeo,
da mistura β-sistosterol+estigmasterol glicosilados e não glicosilado em
tumor sólido Sarcoma 180 e Carcinoma de Ehrlich;
• Avaliar a atividade antiinflamatória dos glicosídeos isolados das espécies
de Malvaceae através dos testes de Air pouch induzido por carragenina;
• Avaliar o efeito analgésico dos glicosídeos das espécies de malvaceae
através do teste de contorção abdominal;
Carvalho, P. R. C.
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14Estudo da atividade farmacológica dos...
• Avaliar a histopatologia de tumores e órgãos de animais tratados com os
glicosídeos isolados das espécies da família Malvaceae.
Carvalho, P. R. C.
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16Estudo da atividade farmacológica dos...
3- REVISÃO DA LITERATURA
3.1. CÂNCER
Durante a vida de um animal as divisões celulares são rigorosamente
controladas, de modo a garantir o bom funcionamento do organismo. Ao longo do
desenvolvimento embrionário e das fases jovens da vida, as divisões celulares
devem sobrepujar a morte das células, para que os diversos órgãos se formem e
cresçam até atingir seu tamanho definitivo. Na fase adulta, o ritmo das divisões
celulares diminui, passando a ocorrer apenas quando há necessidade de repor as
células que morrem naturalmente ou em conseqüência de acidentes. Entretanto,
observa-se que podem ocorrer alterações que danificam o sistema de controle da
divisão celular, levando a célula a crescer e se multiplicar sem necessidade. Caso
essa tendência de multiplicação incontrolada seja transmitida às células-filhas,
surgirá um clone de células com propensão a se expandir indefinidamente dando
origem a um tumor maligno (SNUSTAD; SIMMONS, 2008).
Câncer é o nome dado a um conjunto de mais de100 doenças que têm em
comum o crescimento desordenado (maligno) de células que invadem os tecidos
e órgãos, podendo espalhar-se (metástase) para outras regiões do corpo.
Dividindo-se rapidamente, estas células tendem a ser muito agressivas e
incontroláveis, determinando a formação de tumores (acúmulo de células
cancerosas) ou neoplasias malignas. Tumores malignos podem disseminar-se
para outros locais no corpo, formando tumores secundários, sendo denominado
metástase (estado alterado). Por outro lado quando estas células não invadem os
tecidos vizinhos o tumor é benigno, significa simplesmente uma massa localizada
de células que se multiplicam vagarosamente e se assemelham ao seu tecido
Carvalho, P. R. C.
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17Estudo da atividade farmacológica dos...
original. Hoje o termo tumor é utilizado quase exclusivamente para massas
neoplásicas (KUMAR; COTRAN, 2000; BRASILEIRO FILHO, 2004)
As neoplasias são originadas de apenas uma ou de algumas células
normais que sofrem transformações. O processo de crescimento anormal dos
tumores é o reflexo de complexas anormalidades fisiológicas resultantes da
expressão de genes virais mutantes e/ou de expressão desregulada de genes
normais (COUSSENS; WERB, 2002)
O câncer é uma doença de natureza crônica que possui repercussão de
ordem econômica e social de grande monta. Poucas doenças demonstram ser
tão dependentes de uma etiologia multifatorial como o câncer. No seu diagnóstico
e tratamento são exigidos uma equipe multiprofissional altamente especializada,
de formação e manutenção onerosa, e o emprego de uma tecnologia sofisticada e
dispendiosa para a sua cura (BRASIL, 2003)
A maioria dos casos de câncer (80%) está relacionada à influência do meio
ambiente, no qual encontramos um grande número de fatores de risco. Entende-
se por ambiente o meio em geral (água, terra e ar), o ambiente ocupacional
(indústrias químicas e afins), o ambiente de consumo (alimentos, medicamentos),
o ambiente social e cultural (estilo e hábitos de vida). As mudanças provocadas
no meio ambiente pelo próprio homem, os "hábitos" e o "estilo de vida" adotados
pelas pessoas, podem determinar diferentes tipos de câncer. São raros os casos
de cânceres que se devem exclusivamente a fatores hereditários, familiares e
étnicos, apesar de o fator genético exercer um importante papel na oncogênese.
Um exemplo são os indivíduos portadores de retinoblastoma que, em 10% dos
casos, apresentam história familiar deste tumor. Alguns tipos de câncer de mama,
estômago e intestino parecem ter um forte componente familiar, embora não se
Carvalho, P. R. C.
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18Estudo da atividade farmacológica dos...
possa afastar a hipótese de exposição dos membros da família a uma causa
comum. Determinados grupos étnicos parecem estar protegidos de certos tipos
de câncer: a leucemia linfocítica é rara em orientais, e o sarcoma de Ewing é
muito raro em negros (INCA, 2007).
O câncer ainda é um grande problema de saúde pública em paises
desenvolvidos e em desenvolvimento, sendo responsável por mais de seis
milhões de óbitos a cada ano, representando cerca de 12% de todas as causas
de morte no mundo. Embora as maiores taxas de incidência de câncer sejam
encontradas em países desenvolvidos, dos dez milhões de casos novos anuais
de câncer, cinco milhões e meio são diagnosticados nos países em
desenvolvimento (INCA, 2003).
Pode parecer paradoxal, mas uma das causas de grande incidência do
câncer é o aumento da expectativa de vida do homem, que ao longo de sua
existência, as células humanas são expostas a agentes mutagênicos e sofrem
erros de duplicação, resultando em alterações sutis e progressivas na seqüência
de DNA. Quanto maior o número de divisões da célula, maiores as chances de
ocorrência de alterações no seu DNA. Eventualmente, uma dessas mutações no
DNA (mutações somáticas) pode alterar a função de um gene crítico, fornecendo
uma vantagem no crescimento e na multiplicação da célula na qual ocorreu a
mutação, levando a uma expansão do clone derivado dessa célula. Essa
multiplicação aumentada pode acelerar a taxa de mutações que ocorrem em
diversas regiões do genoma, levando, em última instância, ao surgimento de
clones celulares capazes de invadir, proliferar e colonizar diversas regiões do
corpo formando metásteses (HAHN; WEINBERG, 2002).
Carvalho, P. R. C.
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19Estudo da atividade farmacológica dos...
Quatro funções tendem a ser desreguladas em uma neoplasia: primeiro, os
controles normais de proliferação celular são ineficazes; segundo, o programa de
diferenciação pode estar comprometido, ou seja, as células tumorais podem estar
bloqueadas em um determinado estágio de diferenciação ou podem estar
diferenciadas em um tipo celular inapropriado ou anormal; terceiro, a organização
cromossômica e genética pode estar desestabilizada tal o número de variantes
celulares que surgem com freqüência elevada (algumas variantes podem
aumentar a mobilidade ou a produção de enzimas que permitem a invasão e a
metástase); e o quarto, o programa de morte celular (apoptose) pode estar
desregulado (PONDER, 2001).
As células alteradas passam então a se comportarem de forma anormal,
com constante multiplicação celular exigindo uma alta carga metabólica para se
manterem. Seguindo este acúmulo numeroso de células, estas sofrem mudanças
e disseminam para os tecidos vizinhos, caracterizando um processo metastático
(DE ALMEIDA et al., 2005).
Acredita-se que as causas do câncer seriam uma mistura de componentes
ambientais e alterações genéticas. Os incríveis avanços na biologia molecular e
genética esclarecem os elementos básicos do câncer. A compreensão sobre
esses eventos será de suma importância no controle do câncer e que devem
levar a terapias melhores, e possivelmente à prevenção ou cura da doença
(PAWELEC, 2004).
Existem hoje quatro tratamentos classicamente adotados contra o câncer
que são a quimioterapia, a radioterapia, a terapia genética (realizada através de
genes supressores de tumor, onde estes são inseridos num vírus que os carrega
para dentro dos núcleos das células cancerosas, onde irão produzir proteínas que
Carvalho, P. R. C.
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20Estudo da atividade farmacológica dos...
regulam a proliferação) e a cirurgia (remoção do tecido e seus arredores) que
apresentam inúmeras desvantagens, como a desfiguração do paciente, com
prejuízos à sua auto-estima, inúmeros efeitos colaterais (quimioterapia e
radioterapia), além de uma perspectiva de cura nem sempre eficaz. Em virtude
disso, tratamentos alternativos estão sendo constantemente propostos na área de
oncologia, dentre os quais se inclui a terapia com o uso de imunoduladores, com
o objetivo de fortalecer o sistema de defesa natural do organismo, livrando o
hospedeiro do câncer (WASSER, 2002; SNUSTAD; SIMMONS, 2008).
Nas ultimas décadas têm-se observado relevantes mudanças na relação
médico e paciente, visto que este solicita ao seu médico que sejam prescritos
tratamentos alternativos para a cura do seu mal. Por outro lado, se o paciente não
for atendido em sua solicitação, ele próprio ou com ajuda de familiares, amigos ou
vizinhos, buscam outras terapêuticas, como é o caso da fitoterapia. Estima-se que
mais de 60% de todos os pacientes usam métodos alternativos de tratamento no
curso de sua doença (INCA, 2006).
3.2. INFLAMAÇÃO
Segundo Natathan, 2002 e Hardman et al., 2003, a inflamação é uma
resposta normal do organismo a lesões teciduais, sendo este um processo
complexo e formado por uma rede intrincada de diferentes mediadores que, uma
vez desencadeada pelo agente agressor (que podem ser infecciosos, alérgicos,
traumáticos ou auto-imune) a resposta inflamatória será sempre repetitiva e
composta por cinco etapas principais como ativação enzimática, liberação de
mediadores, extravasamento de fluido com formação de edema, migração celular
e lesões teciduais, seguidas de reparação tecidual.
Carvalho, P. R. C.
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21Estudo da atividade farmacológica dos...
A exacerbação da inflamação é fundamentalmente uma resposta protetora
cujo objetivo final é livrar o organismo da causa inicial da lesão celular e das
conseqüências dessa lesão (COLLINS, 2000). Consistindo na primeira linha de
defesa do organismo, localizar a região afetada, eliminar o agente agressor e
remover os tecidos lesionados, preparando a região acometida para a reparação.
Sem a inflamação, as infecções se desenvolveriam descontroladamente, as
feridas nunca cicatrizariam e o processo destrutivo nos órgãos atacados seria
permanente. Entretanto, em algumas situações e doenças, a resposta inflamatória
torna-se exagerada, persistindo sem qualquer benefício aparente (SILVA;
CARVALHO, 2004; SIQUEIRA; DANTAS, 2000).
Este mecanismo já é bem esclarecido, pois as alergias e doenças nos
quais os indivíduos desenvolvem respostas imunológicas desreguladas contra
antígenos ambientais encontrados freqüentemente, e as doenças auto-imunes,
nas quais as respostas imunológicas se desenvolvem contra auto-antígenos
normalmente tolerados, são desordens nas quais a inflamação é causa
fundamental da lesão tecidual. Estudos demonstram o papel importante
desempenhado pela inflamação em uma variedade de doenças humanas que não
são doenças primariamente do sistema imunológico. Elas incluem câncer,
aterosclerose, doença cardíaca isquêmica e algumas doenças
neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer. Além disso, a inflamação
prolongada e a fibrose que a acompanha são responsáveis pela maior parte das
alterações patológicas vistas em muitas doenças infecciosas crônicas,
metabólicas e outras. Já que essas são as principais desordens que afligem a
humanidade, não é de surpreender que a resposta inflamatória, normalmente
Carvalho, P. R. C.
. . .
22Estudo da atividade farmacológica dos...
protetora, seja chamada de “assassino silencioso” (KUMAR, ABBAS; FAUSTO,
2005).
A inflamação inclui atividades conjuntas e freqüentemente opostas de
vários tipos de células e dezenas de mediadores protéicos e lipídicos (KUMAR,
ABBAS; FAUSTO, 2005). O processo inflamatório apresenta, inicialmente,
mudanças no fluxo sanguíneo local e acumulação de várias células inflamatórias
(neutrófilos, células dendríticas, monócitos, mastócitos e linfócitos), sendo
denominada inflamação aguda ou reação inflamatória aguda. Seus sinais já foram
descritos há aproximadamente 2000 anos, como rubor (vermelhidão), dor, calor
(hipertermia) e tumor (edema). O rubor e a hipertermia da inflamação aguda são
resultados da dilatação dos vasos e aumento do fluxo sangüíneo na região
inflamada, o edema é provocado pelo acúmulo de exsudato e a dor resulta de
uma combinação de fatores incluindo a pressão nas terminações pelo edema e de
um efeito de determinados fatores químicos liberados durantes a resposta
inflamatória. A perda da função, total ou parcial, na área inflamada resulta em
edema e dor marcantes (HARDMAN et al., 2003).
Esta reação inflamatória consiste em dois componentes: uma reação inata,
do sistema imune que engloba os eventos que ocorrem localmente no interior dos
tecidos; e uma resposta imune adquirida e especifica, tornando a resposta de
defesa a um microorganismo invasor mais eficaz (TLASKALOVA et al., 2005).
Os eventos que ocorrem localmente no interior dos tecidos podem ser
divididos em vasculares e celulares. Os eventos vasculares compreendem a
vasodilatação, com conseqüente aumento do fluxo sanguíneo local, o aumento da
permeabilidade vascular e a exsudação plasmática. Tais eventos são importantes
na medida em que promovem um aumento local da concentração de mediadores
Carvalho, P. R. C.
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23Estudo da atividade farmacológica dos...
de origem plasmática, entre eles os componentes do sistema complemento, da
coagulação, do sistema fibrinolítico e das cininas. Concomitantemente, são
desencadeados os eventos celulares, onde há saída de leucócitos circulantes da
luz do vaso e a migração destas células para o sítio inflamatório. Esse fenômeno
segue algumas fases como captura, rolamento dos leucócitos pelo endotélio,
adesão firme e transmigração (WAHL et al; 1996; SILVA et al; 2007). Todas estas
etapas do processo de migração leucocitária são dependentes da expressão,
pelos leucócitos e pelas células endoteliais, de moléculas de adesão e de
mediadores quimiotáticos (WEBER, 2003).
A mobilização adequada dos leucócitos circulantes para o sítio inflamado é
fundamental para a defesa do organismo, já que estas células podem desenvolver
suas ações fagocíticas e destruição de agentes patogênicos, levando à resolução
do processo. Os leucócitos circulantes migram seletivamente e em número
significativo para o tecido inflamado no decorrer do processo. Em uma resposta
inflamatória aguda, e logo nos estágios iniciais, há acúmulo predominante de
neutrófilos, enquanto que as células mononucleares são observadas mais
tardiamente durante a fase aguda, bem como nos processos crônicos. A migração
de eosinófilos também pode ocorrer em processos inflamatórios, estando
principalmente associada a processos alérgicos e infecções parasitárias. Algumas
das células já estão presentes no tecido afetado tais como: células endoteliais,
células mesoteliais, mastócitos, eosinófilos, macrófagos e alguns linfócitos
(BROCHE; TELLADO, 2001).
Posteriormente, patógenos, debris celulares e células inflamatórias
precisam ser removidas e a integridade e funcionamento normal do tecido
restaurado. Quando esse delicado balanço entre inflamação e restauração
Carvalho, P. R. C.
. . .
24Estudo da atividade farmacológica dos...
tecidual é quebrado, ocorrerá o desenvolvimento de doenças inflamatórias
crônicas e auto-imunes, tais como doenças inflamatórias intestinais, artrite ou
asma (SZÉLES; TOROSIK; NAGY, 2007).
O processo inflamatório pode iniciar-se a partir de traumas no tecido,
presença de complexos imunes, produtos derivados de bactérias, vírus ou
parasitos (CUNHA et al., 2004), e depende de mediadores celulares liberados por
células como neutrófilos, monócitos, macrófagos, eosinófilos, mastócitos e
mediadores químicos. Os mediadores químicos têm diferentes origens no
organismo e exercem funções diversas na cascata inflamatória, podendo ser
provenientes de células (histamina, serotonina, enzimas lisossomiais,
prostaglandinas, leucotrienos, fatores ativadores de plaquetas, citocinas e óxido
nítrico) e/ou mediadores provenientes do plasma (o complemento, as cininas
bradicininas e os fatores de coagulação e fibrinólise). Os primeiros mediadores
químicos a se manifestarem no processo inflamatório são histamina e serotonina.
(CUZZOCREA, 2005; WANG; ALJAROUDI; NEWBY, 2005; SARKAR; FISHER,
2006).
Dentre os mediadores inflamatórios, a histamina e a serotonina destacam-
se por realizar a desgranulação de mastócitos, responsáveis pela vasodilatação e
aumento da permeabilidade vascular (GONZALEZ-REY et al, 2007).
A bradicina se destaca entre os mediadores químicos envolvidos no
processo inflamatório, promovendo vasodilatação, extravasamento plasmático e
aderência de neutrófilos (CALIXTO et al., 2004). Além destes, mediadores
peptídicos, como as neurocininas e o peptídio relacionado ao gene da calcitonina
(CGRP) também exercem um importante papel no processo inflamatório
(OKAJIMAS; HARADA, 2006).
Carvalho, P. R. C.
. . .
25Estudo da atividade farmacológica dos...
Os efeitos dos mediadores do tipo prostaglandinas (PGs) e leucotrienos
(LTs) resultam em incrementos de quimiotaxias e fagocitoses dos leucócitos
polimorfonucleares (PMNs), e conseqüentemente a eliminação dos agentes
agressores. A ativação de macrófagos permite o estabelecimento de uma
resposta imune específica mediante a cooperação com os subgrupos de linfócitos
T auxiliares (Th). O meio ambiente pode condicionar uma resposta do tipo Th1 ou
Th2 de acordo com as características do agente agressor (SÁNCHEZ-RAMÍREZ
e TALAMÁS-ROHANA, 2002).
Assim, verifica-se que a inflamação manifesta-se clinicamente como um
fenômeno estereotipado e independente da natureza do agente agressor,
mediado por vários fatores, podendo ocorrer somente pequenas variações em
determinadas situações, dependentes do tecido ou órgão afetado, e da
coexistência de estados patológicos, que alterariam a capacidade do organismo
de mobilizar as fontes de defesa (SILVA, 2004).
A terapia antiinflamatória atual baseia-se na necessidade de controlar os
sinais cardinais da inflamação. A maioria dos antiinflamatórios estudados são
bloqueadores das vias principais de mediadores pró-inflamatórios que estão
envolvidos na iniciação de uma resposta inflamatória aguda. Assim, a maioria dos
antiinflamatórios bloqueia vias bioquímicas e/ou sinalizadores de mecanismos
pró-inflamatórios (SERHAN et al., 2003).
Dentre os medicamentos mais comuns estão os antiinflamatórios não-esteroidais
(AINEs) sendo a classe de medicamentos mais amplamente utilizada entre todos
os agentes terapêuticos. Com freqüência, são prescritos para queixas músculo-
esqueléticas e são freqüentemente tomados sem prescrição para dores menores,
uma vez que estes medicamentos possuem três tipos principais de efeitos: efeitos
Carvalho, P. R. C.
. . .
26Estudo da atividade farmacológica dos...
antiinflamatórios, efeito analgésico, e efeito antipirético (RANG, DALE; RITTER,
2001a.b).
3.3. DOR
A dor é conceituada como uma experiência sensorial e emocional
desagradável, tendo como causa um dano tecidual real ou potencial. A percepção
da dor envolve dois componentes, nocicepção que é o estímulo doloroso
propriamente dito, e a reação emocional à dor. A dor alerta o indivíduo sobre a
ocorrência de alguma forma de lesão orgânica instalada ou em vias de se instalar,
esta não envolve apenas a transdução da informação gerada pelo estímulo
nocivo, mas também o processamento cognitivo e emocional pelo cérebro
(CUNHA et al; 2004).
A percepção dolorosa a um determinado estímulo tem como ação biológica
alertar o organismo sobre o perigo no ambiente, incluindo a resposta
comportamental de proteger o organismo contra a possível lesão (DEVOR, 2006).
Em condições normais, a informação sensorial é captada por estruturas do
sistema nervoso periférico (SNP) e transmitida ao sistema nervoso central (SNC).
Nestas estruturas, neurotransmissores diferentes realizam a função bioquímica de
transmitir a dor (DAUDT et al., 1998).
A dor de acordo com a sua duração pode ser aguda ou crônica, onde a dor
crônica pode perpetuar por meses ou anos, e se caracteriza em relação à
persistência e alterações adaptativas, o que muitas vezes dificulta o tratamento; a
dor aguda está associada com uma lesão tecidual recente, ativação de
nociceptores e pode desaparecer até mesmo antes da cura do dano tecidual
(BESSON, 1999; PARK; VASKO, 2005).
Carvalho, P. R. C.
. . .
27Estudo da atividade farmacológica dos...
A origem da dor ainda é bastante variada, incluindo trauma, desordens
metabólicas e vasculares, infecções virais ou bacterianas, entre outros fatores. A
dor neuropática causa o dano neural, o qual é seguido de alterações que também
são comuns a diversos tipos de dor (DEVOR, 2006). No sistema nervoso
periférico, as principais conseqüências da lesão de nervos são alterações na
excitabilidade e no fenótipo das fibras aferentes primárias, sendo estes
fenômenos agentes contribuintes para as alterações que ocorrem no sistema
nervoso central, que incluem excitabilidade aumentada, inibição diminuída e
reestruturação organizacional das células (WOOLF, 2004).
Uma propriedade essencial dos tecidos animais consiste na capacidade de
responder defensivamente a estímulos lesivos. Essa propriedade é discernível de
algum modo, na maioria das espécies e manifesta-se de maneira cada vez mais
complexa, à medida que aumenta a especialização biológica (YAGIELA; NEIDE;
DOWD, 2000; CUZZOCREA, 2005).
A dor tem seu início nas áreas periféricas como a pele e órgãos internos,
isto é, fora do cérebro e da medula espinhal. Sendo assim, neste contexto, dar
uma topada ou encostar a mão em uma chapa quente são eventos que ativam os
neurônios que reagem como estímulos danosos, como temperaturas ou pressão
mecânica extrema e substâncias produzidas pelo organismo em respostas a uma
lesão ou inflamação (BASBAUM; JULIUS, 2006).
A sensação dolorosa é comumente acompanhada de alterações sensoriais
e de substâncias algiogênicas que são liberadas dos mastócitos e leucócitos, bem
como vasos sanguíneos e células traumatizadas, sendo responsável pela
hiperalgesia termomecânica (sensibilidade aumentada para um estímulo
doloroso), pela vasodilatação observada em lesões traumáticas, inflamatórias e
Carvalho, P. R. C.
. . .
28Estudo da atividade farmacológica dos...
isquêmicas e alodinia (dor provocada por um estimulo previamente não nocivo)
(CUNHA, 2004).
O fenômeno sensitivo doloroso é a transformação dos estímulos
ambientais em potenciais de ação que das fibras periféricas e são transferidos
para o Sistema Nervoso Central. Os receptores nociceptivos são representados
pelas terminações nervosas livres presentes nas fibras mielínicas A-δ e
amelínicas C (ANDRADE-FILHO, 2001).
Os nociceptores possuem duas extremidades, onde uma detecta
sensações e projeta-se para as regiões periféricas inervando pequenas porções
de tecido e a segunda extremidade estende-se até o interior do corno medular
espinhal dorsal. O corpo celular dos nociceptores fica entre esses dois
segmentos, quando o agente nocivo é detectado pela extremidade periférica na
pele ou algum outro órgão, um impulso elétrico é disparado e propagado por toda
a fibra nervosa até atingir uma região da medula espinhal (BASBAUN; JULIUS,
2006).
Os nociceptores que constituem os receptores farmacológicos dos axônios
de células nervosas desencadeiam a condução elétrica, levando a informação
dolorosa de sua origem periférica à medula espinhal por via específica. No
cérebro, a informação é identificada e se transforma em sensação de dor. Entre
os receptores periféricos e o cérebro, existem duas vias mediadoras dos
estímulos dolorosos: a neoespinotalâmica e a paleoespinotalâmica (LÜLLMANN
et al., 2001).
A via neoespinotalâmica (Trato espinotalâmico lateral) é a principal via que
medeia a sensibilidade dolorosa e térmica, envolvendo uma cadeia de três
neurônios. Através desta via, sensações térmicas são trazidas dos membros e do
Carvalho, P. R. C.
. . .
29Estudo da atividade farmacológica dos...
tronco do lado oposto, sendo que esta via informa a sensação de dor rápida e
bem localizada (somatotopia) (ROCHA, 2005); e a via paleoespinotalâmica (Trato
espinotalâmico retículo), ao contrário da via neoespinotalâmico, não tem
organização somatotópica. Assim, ela é responsável por um tipo de dor pouco
localizada, a dor profunda do tipo crônico, correspondendo a chamada dor em
queimação, ao contrário da via neoespinotalâmica, que veicula dores localizadas
do tipo dor em pontada (LÜLLMANN et al., 2000).
Neurônios sensoriais lesionados, ou fibras próximas a eles, podem
desenvolver alterações na sua excitabilidade, suficientes para gerar potenciais de
ação ectópica, podendo estes resultar na desmielinização e ou no aumento da
expressão de canais de sódio e diminuição da expressão de canais de potássio
(LIU; MICHAELIS; DEVOR, 2000).
3.4. Plantas Medicinais como Fonte de Novos Fármacos.
A fitoterapia é uma terapia milenar que se caracteriza pelo tratamento com
o uso de plantas medicinais e suas diferentes formas farmacêuticas, sem a
utilização de princípios ativos isolados. Pode-se afirmar que 2000 anos antes do
aparecimento dos primeiros médicos gregos, já existia uma medicina egípcia
organizada, onde o tratamento de várias enfermidades era feito
predominantemente com plantas medicinais. Os recursos terapêuticos disponíveis
até o século XIX eram exclusivamente oriundos de plantas medicinais e extratos
vegetais. No século XX, surgiu a tendência de se isolar os princípios ativos
(PUPO; GALLO, 2007).
Ao longo dos séculos, produtos de origem vegetal constituíram as bases
para tratamento de diferentes doenças. Desde a Declaração de Alma-Ata, em
Carvalho, P. R. C.
. . .
30Estudo da atividade farmacológica dos...
1978, a Organização Mundial de saúde (OMS) tem expressado a sua posição a
respeito da necessidade de valorizar a utilização de plantas medicinais no âmbito
sanitário, tendo em conta que 80% da população mundial utilizam essas plantas
ou preparações destas no que se refere à atenção primaria à saúde (BRASIL,
2006a.b).
Embora o uso de plantas na cura de enfermidades seja um dos meios mais
antigos de tratamento, o conhecimento sobre as plantas medicinais representa,
muitas vezes, apenas informações de seu uso popular por comunidades e grupos
étnicos. Sob este aspecto, é importante ressaltar que o sucesso das
investigações na área de princípios ativos naturais depende, principalmente, do
grau de interação entre a Botânica, a Química, a Fitoquímica e a Farmacologia
pré-clinica e clínica (GARCIA-GONZÁLES, 2000), para a identificação de uma
nova estrutura química, que possa representar um novo candidato a fármaco,
elegendo-se o melhor alvo-farmacológico para a aplicação terapêutica (MACIEL;
PINTO; VEIGA-JÚNIOR, 2002).
Esta interação apresenta-se dividida em etapas onde, na botânica está
envolvida a seleção e identificação do material a ser avaliado. A etapa fitoquímica
compreende o isolamento, elucidação estrutural e a identificação dos constituintes
mais importantes da planta. Este conhecimento, quando associado ao
monitoramento da atividade biológica, permite a análise e a caracterização da
fração ou substância dotada de atividade terapêutica e/ou tóxica. A etapa
farmacológica pré-clinica engloba estudos farmacodinâmicos, farmacocinéticos e
toxicológicos do extrato total da planta a ser estudado, realizados in vivo e/ou in
vitro. Um dos passos iniciais destes estudos é a investigação dos efeitos
farmacológicos da substância isolada de uma planta em modelos experimentais
Carvalho, P. R. C.
. . .
31Estudo da atividade farmacológica dos...
relevantes e relacionada às ações farmacológicas sugeridas pela análise popular
(ELIZABETSKY; SOUZA, 2004).
A fitoterapia tem apresentado um importante papel na terapia anticâncer e
os mecanismos de interação entre fitocompostos e células neoplásicas vem
sendo extensivamente estudado (MUKHERJEE, 2001). Vários laboratórios se
encontram envolvidos na tarefa de buscar novos agentes terapêuticos
antineoplásicos a partir de fontes naturais (BARACAT, FERNANDES, SILVA,
2000).
A natureza, ao longo dos anos, tem fornecido muitos produtos efetivos
contra o câncer que até hoje são amplamente utilizados na clínica, a exemplo
disto pode-se citar a grande ação dos extratos de plantas de gênero Taxus de
onde se obteve a substância conhecida como Taxol (paclitaxel) e Docetaxel. Além
destes compostos, a Vincristina e Vinblastina extraídos de Cataranthus roseus
são efetivos contra tumores no fígado, rins, cérebro, mama e próstata
(MUKHERJEE; CHATTERJEE, 2001; CECHINEL; YUNES, 2001).
A literatura mostra que além das efetivas drogas contra o câncer, os
produtos naturais são considerados agentes quimiopreventivos, especialmente os
flavonóides (LAPA et al., 2004).
Apesar do grande desenvolvimento da síntese orgânica e dos processos
biotecnológicos, cerca de 25% dos medicamentos prescritos nos países
industrializados são originados de plantas, oriundos de nada mais de que 90
espécies. No entanto, durante os últimos 20 anos, os fármacos de origem natural
que aparecem no mercado são quase que na totalidade, oriundos de pesquisas
científicas de países como China, Coréia e Japão, sendo que a contribuição dos
outros países é bem menor (CALIXTO; OTUKI; SANTOS, 2003).
Carvalho, P. R. C.
. . .
32Estudo da atividade farmacológica dos...
O mercado mundial atual de fitofármacos e fitoterápicos são de ordem de 9
a 11 bilhões de dólares por ano, sendo que mais de 13.000 plantas são
mundialmente usadas como fármacos ou fonte de fármacos (FOGLIO et al, 2006).
Outras estimativas revelam que o mercado mundial de produtos farmacêuticos
movimenta 320 bilhões de dólares por ano, dos quais 20 bilhões são originados
de substâncias ativas derivadas de plantas (ROBBERS; SPEEDIE; TYLER,
1997), sendo importante salientar que cerca de 49% das drogas ou análogos
semi-sinteticos ou ainda compostos sintéticos, desenvolvidas entre 1981 a 2001
foram obtidos a partir de produtos naturais (VIEGAS; BOLZANI, 2006)
No Brasil, o crescimento do mercado de fitoterápicos é de 15% ao ano,
enquanto o crescimento anual do mercado de medicamentos sintéticos gira em
torno de 3 a 4% (ABIFISA, 2006). O panorama brasileiro mostra que 84% de
todos os fármacos são importados e que 78% da produção brasileira ocorrem por
multinacionais, revelando assim a necessidade de buscar alternativas para
superar a dependência externa, principalmente quando confrontamos com altos
preços praticados no Brasil em comparação àqueles praticados nos países
desenvolvidos (BERMUDEZ, 2002). É nesse contexto, que as plantas medicinais
adquirem importância como agentes terapêuticos e, por isso, sua segurança e
eficácia devem ser analisadas para que os mesmos sejam registrados no
Ministério da Saúde para posterior comercialização.
No Brasil, recentemente, foi criado o Decreto nº 5.813 de 22 de junho de
2006, que aprova a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, com o
objetivo de garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso racional de
plantas medicinais e fitoterápicos, através principalmente da promoção do uso
sustentável da biodiversidade, do desenvolvimento da cadeia produtiva e do
Carvalho, P. R. C.
. . .
33Estudo da atividade farmacológica dos...
fortalecimento da indústria farmacêutica nacional, estimulando a produção de
fitoterápicos em escala industrial e incrementando suas exportações o que pode
ajudar a superar a dependência externa (BRASIL, 2006b).
O levantamento acurado do uso popular de uma planta pode servir de base
para a busca sistemática de novos fármacos. Entretanto, o uso popular e
tradicional de plantas não é suficiente para validar eticamente o seu uso como
medicamentos eficazes e seguros (LAPA et al., 2004), sendo necessária à
abordagem etnofarmacológica como estratégia para investigação de plantas
medicinais, que consiste em combinar informações adquiridas junto a
comunidades que façam uso da flora local com estudos químico-farmacológicos
realizados em laboratórios especializados (BAIS et al., 2006).
A descoberta de novos compostos é motivada pela busca de substâncias
mais ativas e menos tóxicas, que possam ser utilizadas no tratamento de diversas
patologias, ou em substituição àquelas já existentes. Dentro da perspectiva de se
estudar plantas medicinais, o Brasil se encontra em posição privilegiada, pois é o
país com a maior diversidade vegetal do mundo, contando com mais de 55.000
espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000 (GUERRA;
NODARI, 2003).
As plantas medicinais contêm propriedades diversas de acordo com os
seus princípios ativos, estes princípios não são estáveis e não se distribuem de
maneira homogênea na planta. Estas substâncias podem se concentrar nas
raízes, rizomas, talos, caules, folhas, sementes ou flores. Seu teor também varia
de acordo com a época do ano, solo e clima onde a planta se desenvolve. Quanto
à concentração das substâncias, também ocorrem diferenças com plantas que
convivem lado a lado (DA CUNHA, 2003).
Carvalho, P. R. C.
. . .
34Estudo da atividade farmacológica dos...
3. 5. Família Malvacea: Características da Família Malvacea
A família Malvacea foi classificada por Cronquist (1981) e pertence à ordem
Malvales, sendo constituída por 243 gêneros e 4225 espécies.
No Brasil estima-se que esta se apresenta com cerca de 40 gêneros e 400
espécies (STEVENS, 2003). É constituída por plantas de hábitos variados, como
ervas subarbustos, arbustos e árvores, podendo ocorrer isoladas ou em
populações maiores, em áreas úmidas, alagadas e semi-áridas (BARACHO,
1998).
Ocorrem por quase todas as partes do mundo sendo mais abundantes nas
regiões tropicais, principalmente na América do Sul (HEYWOOD, 1993).
Figura 01.
Carvalho, P. R. C.
. . .
35Estudo da atividade farmacológica dos...
Figura 01 Distribuição de espécies de Malvácea no Mundo. (Região
mais escura)
Os representantes da família Malvácea possuem ramos cilíndricos, às vezes
aplanados, eretos, prostrados ou decumbentes, raramente aculeados, tricomas
simples ou estrelados.
Suas folhas são pecioladas, alternas, inteiras ou lobadas, raramente glabras,
às vezes com nectários na face dorsal; estipuladas. Suas inflorescências são
solitárias, fasciculadas nas axilas das folhas ou em racemos, panículas e algumas
vezes em espigas, com cimas escorpióides, raramente em umbelas.
São plantas que possuem flores e em geral são grandes e vistosas,
actinomorfas, cíclicas, hermafroditas, muitas vezes triclamídeas pelo
desenvolvimento de um cálice externo, com pétalas geralmente soldadas na
base, podendo estar presente ou ausente; os cálices são gamossépalos, 5
sépalas; 5 pétalas ungüiculadas, adnatas a base do tubo estaminal; possui cinco
numerosos estames monadelfos, com os filetes apresentando partes livres
Carvalho, P. R. C.
. . .
36Estudo da atividade farmacológica dos...
diversamente distribuídas ao longo do tubo, com anteras reniformes,
biesporangiadas, monotecas, rimosas; o ovário supero, 3-muitos lóculos, 1-muitos
óvulos; estiletes livres entre si ou parcialmente concrescidos e depois liberando-
se em tantos ramos quantos forem os carpelos ou em dobro do número deles;
estigmas capitados ou decorrentes. O androceu possui estames muito
numerosos, sempre com filetes parcialmente soldados, que formam um longo
tubo (andróforo, coluna) envolvendo o gineceu. As anteras apresentam-se sempre
com uma só teca. O pólen é espinhoso. O ovário é trilocular e cada loja possui
dois óvulos. Seus frutos são baciformes, capsulares ou, ainda, esquizocárpicos
com frutículos apendiculados, podendo ser transportados tanto pelo pêlo dos
animais como pelo homem (BOVINI; CARVALHO-OKANO; VIEIRA, 2001).
Figura 02.
Carvalho, P. R. C.
. . .
37Estudo da atividade farmacológica dos...
Figura 02 – Caracteres morfológicos mais evidentes em espécies de Malváceas (1-flor; 2-petala mostrando sua soldadura na base; 3-estames soldados formando um único tubo (androforo); 4-antera mostrando uma única teca; 5-grao de polen; 6-ovario, podendo ser penta ou plurilocular, 6a; 7-fruto; 7a-fruto aberto). Fonte: Joly, 1976.
Stevens, 2003, apresenta os gêneros mais numerosos que compõem esta
família: os Hisbiscus (300), Sida (200), Pavonia (150), Abutilon (100), Nototriche
(100), Cristaria (75) e Gossypium (40).
Carvalho, P. R. C.
. . .
38Estudo da atividade farmacológica dos...
3.6. Aspectos quimiotaxonômicos, etnobotânicos e etnofarmacológicos da
família Malvaceae
Quanto aos aspectos etnobotânicos, etnofarmacológicos e
quimiotaxonomia, a família Malvácea mostrou-se bastante diversificada, podendo-
se destacar algumas classes de produtos naturais como: esteróides, terpenos,
ácidos fenólicos (SHARMA; AHMAD, 1989; AHMED; KAZMI; MALIK, 1990;
AHMED; KAZMI; MALIK, 1991;), alcalóides (GUNATILAKA et al., 1980), bem
como flavonóides (ELLIGER, 1984; BILLETER; MEIER; STICHER, 1991; SILVA
et al., 2005A) e cumarinas (SILVA et al., 2006; COSTA, 2007), onde inúmeras
substâncias isoladas pertencentes às suas respectivas classes, apresentando
significativa atividade farmacológica segundo várias literaturas.
A família Malváceae possui representantes de considerável valor econômico,
sendo utilizada na ornamentação em todo o mundo, como por exemplo, espécies
dos gêneros Althea (A. officinalis, A. rosea), Hibiscus (H. rosa-sinensis, H.
schizopetalus, H. tiliaceus, H. sabdariffa), Malvaviscus e Abutilon (A. molle, A.
megapotamicum, A. striatum, A. darwinii, A. bedfordianum) (SCHULTZ, 1968),
além de espécies dos gêneros Gossypium (algodão) e Urena (juta) que são
utilizadas na indústria têxtil (BOVINI; CARVALHO; VIEIRA, 2001).
As espécies do gênero Sida, um dos maiores representantes da família
Malváceae, são consideradas “daninhas” e/ou “invasoras” e reconhecê-las é
importante para evitar infestação em culturas e conseqüentemente prejuízos à
economia agrícola (FERREIRA; MACEDO; LACA-BUENDIA, 1984).
Carvalho, P. R. C.
. . .
39Estudo da atividade farmacológica dos...
Brandão et al.; 1985; alertam para o possível interesse econômico da flora
invasora, inclusive de espécies de Sida. Segundo estes autores, essa flora pode
ser utilizada como alimento, medicinal, ornamental ou, ainda, como forrageira.
A Sida rhombifolia L., conhecida como “guanxuma”, “malva”, “relógio”,
“vassoura-do-campo”, “vassoura-relógio”, “mata-pasto” ou “vassourinha”, é
amplamente empregada na medicina caseira, como emoliente, tônica,
estomáquica, febrífuga, calmante, anti-hemorroidal, anti-diarréico e para aliviar
dores ocasionadas por picadas de insetos. Na Índia, a infusão de suas raízes é
utilizada no tratamento do reumatísmo. Sida carpinifolia (L.f.) K. Schum e
Sidastrum micranthum (A. St.-Hill.) Frixell possuem características e propriedades
semelhantes (LORENZI; MATOS, 2002).
Sida rhomboidea Roxb, é uma erva encontrada em pântanos da Índia cujas
raízes e folhas são usadas como tônico, para cura de febres, doenças do coração
e todos os tipos de inflamação. Estudos farmacológicos desta planta indicaram
sua atividade antinociceptiva e antiinflamatória (VENKATESH et al., 1999).
Sida cordifolia L., conhecida como “malva branca” ou “malva branca
sedosa”, é usada para o tratamento de estomatites, asma, congestão nasal,
inflamação da mucosa oral e blenorréia. Os efeitos antiinflamatórios e analgésicos
foram investigados para o extrato aquoso desta planta, mostrando-se bastante
significativos, comprovando assim sua utilização popular (FRANZOTTI et al.,
2000; FRANCO et al., 2005).
Sida spinosa L. é usada no tratamento da asma, em outros distúrbios do
peito e como tônico. As folhas têm sido usadas para tratamento de algumas
Carvalho, P. R. C.
. . .
40Estudo da atividade farmacológica dos...
doenças de pele e como tratamento oral para veneno de cobra. As raízes e folhas
são usadas no tratamento da diarréia e disenteria (DARWISH; REINECKE, 2003).
Sida acuta é usada tradicionalmente por curandeiros para neutralizar o
efeito do veneno da serpente Bothrops atrox, encontrada na América Latina.
Estudos de laboratório in vitro com os extratos desta planta avaliaram este efeito e
os resultados mostraram a capacidade desta espécie em inibir de forma moderada
o efeito hemorrágico provocado pelo veneno de Bothrops, comprovando o seu uso
popular (OTERO et al., 2000). Esta espécie é também usada no tratamento da
malária e outras doenças febris (BANZOUZI et al., 2004).
Várias espécies de Malvaceae possuem uso na medicina popular. Como
exemplos, podemos citar: Malva sylvestris L., conhecida como “malva”, “malva-
alta”, “malva-de-botica”, “malva-grande”, é utilizada desde a antiguidade,
principalmente na Europa, no tratamento de tosses e doenças inflamatórias de
membranas e mucosas. Na Idade Média, Plínio e Dioskorides, já indicavam o seu
sumo para evitar indisposições, tratar queimaduras e picadas de insetos
(BILLETER et al., 1991; LORENZI; MATOS, 2002). Na medicina tradicional
egípcia, a Malva sylvestris L. era utilizada para o tratamento de hemorróidas
(NAWWAR; BUDDRUS, 1981).
Hibiscus sabdariffa L., conhecida como “vinagreira”, “rosela”, “caruru-azedo”,
“caruru-da-guiné”, “azeda-da-guiné”, “quiabo-azedo”, ou “groselheira”, é
amplamente empregada na medicina caseira em quase todo o Brasil. O chá de
suas folhas e raízes é considerado emoliente, estomáquico, anti-escorbútico,
diurético e febrífugo (LORENZI; MATOS, 2002).
Carvalho, P. R. C.
. . .
41Estudo da atividade farmacológica dos...
Hibiscus esculentus, conhecida como quiabo, é usada há muitos anos no
tratamento de desordens gástricas, tais como, dores no estômago e úlceras
pépticas (YESILADA; GURBUZ, 2002). Existem grandes evidências para tal
utilização a partir de estudo farmacológico recente, que avaliou o efeito
gastroprotetor de extratos de Hibiscus esculentus contra lesões induzidas por
etanol, o que foi confirmado através de análise histopatológica (GURBUZ et al.,
2003).
Hibiscus abelmoschus, planta comum em regiões tropicais é muito usada na
medicina popular e na perfumaria. Sua análise por cromatografia gasosa e
cromatografia liquida de alta eficiência mostrou a presença de isômeros de ácidos
graxos de 20 carbonos (NEE; KARTT; POLLARD, 1986).
Gossypium herbaceum, espécie mais citada da família Malvácea é um tipo de
algodoeiro que é o mais cultivado desde os tempos do Império Romano e com
evidências de ter-se originado na Índia devido a suas inúmeras utilidades. Seus
pêlos compridos e sedosos constituem algodão, utilizados na indústria têxtil, suas
sementes contêm 15-30% de um óleo empregado na indústria e na alimentação,
podendo substituir o óleo de oliveira. A torta remanescente das sementes é
empregada para a forragem e adubo, suas raízes e suas cascas são usadas para
fins medicinais (SCHULTZ, 1968).
As folhas do Gossypium hirsutum L., conhecida como “algodoeiro”,
“algodão”, “algodão-herbáceo”, “algodão-mocó”, “algodão-anual”, são utilizadas
pela medicina caseira no Brasil, na forma de chá, para o tratamento de disenteria
e hemorragia uterina. Suas folhas machucadas são empregadas localmente como
cicatrizantes e o chá da raiz é utilizado nos casos de falta de memória,
Carvalho, P. R. C.
. . .
42Estudo da atividade farmacológica dos...
amenorréia, distúrbios da menopausa e impotência sexual. As flores e frutos ainda
verdes são utilizados friccionando-os localmente, em casos de micoses como
frieiras, panos brancos e pretos, além de impingens. O óleo extraído das suas
sementes é empregado como purgativo e vermífugo para áscaris (ascaricida) e,
localmente, como emoliente e no combate de piolhos. O gossipol, principal
constituinte do algodoeiro, é usado na China como anticoncepcional masculino,
por sua propriedade de inibir a espermatogênese (LORENZI; MATOS, 2002).
Outras espécies ainda são cultivadas como a G. barbadense, G. peruvianum, G.
arboreum e alguns híbridos (SCHULTZ, 1968).
Pavonia zeylanica é usada como vermífugo e purgativo por nativos do
Zâmbia (TIWARI; MINOCHA, 1980).
Abutilon indicum possui uso terapêutico como febrífugo, anti-helmíntico,
anti-emético, antiinflamatório, em alterações urinárias e uterinas, hemorróidas e
dores na região lombar (GAIND; CHOPRA, 1976).
No campo alimentício destacam-se as seguintes espécies: Hibiscus
esculentus (quiabo), por seus frutos comestíveis, apreciados como verdura
(SCHULTZ, 1968); Hibiscus sabdariffa (groselha), pelo aproveitamento de suas
brácteas e sépalas empregadas na preparação de geléias, e de suas folhas para
preparar o famoso arroz-de-cuchá, prato típico da cozinha maranhense. Em
algumas regiões, suas raízes são utilizadas para o preparo de aperitivo.
Destacam-se ainda o Gossypium hirsutum e Gossypium herbaceum, por seus
óleos extraídos das sementes que possuem largo uso em culinária (LORENZI;
MATOS, 2002), e a espécie Hibiscus abelmoschus é utilizada na indústria de
Carvalho, P. R. C.
. . .
43Estudo da atividade farmacológica dos...
perfume, onde suas sementes são valorizadas por seu aroma (NEE; CARTT;
POLLARD, 1986).
3.7. Considerações botânicas sobre o gênero Herissantia:
Em 1788 Medicus, propôs e validou Herissantia como um novo gênero,
cujo nome é uma homenagem a Louis Antoine Prospere Herissant, físico,
naturalista e poeta do século XVIII (WAGNER; HERBST; SOHMER, 1999). O
novo gênero foi proposto com base na morfologia dos frutos, com uma descrição
do fruto de Sida crispa, diferenciando-o dos frutos de Abutilon. Entretanto, o autor
não associou o epíteto crispa a Herissantia. As combinações para o gênero foram
realizadas por Brizicky (1968), 180 anos depois, que efetuou três combinações
para Herissantia (H. crispa, H. nemoralis e H. tiubae). Posteriormente, Fryxell
(1973, 1979) descreveu uma nova espécie no México (Herissantia dressleri) e
efetuou uma nova combinação (Herissantia trichoda), baseado em Abutilon
trichodon Rich.
Herissantia é um gênero neotropical, distingue-se do Abutilon, com o qual
possui grande afinidade, pelo hábito subarbustivo e arbustivo, difuso e
escandente, fruto pendular e inflado, com mericarpos reniformes e escariosos
(BRIZICKY, 1968; FRYXELL, 1973). É constituído por seis ou mais espécies
restritas a América tropical (FRYXELL, 1997). A maioria das espécies ocorre no
México, Antilhas e América do Sul.
O gênero Herissantia caracteriza-se pelos frutos inflados, pendentes e
pelos carpídios com as paredes laterais frágeis.
Carvalho, P. R. C.
. . .
44Estudo da atividade farmacológica dos...
3. 8. Herissantia crispa L. (Brizicky)
A Herissantia crispa L. (Brizicky), é de ampla distribuição, dicotiledônea,
anuais ou perenes, subarbustos eretos ou decumbentes, ramos cilíndricos,
pubescentes a velutinos, folhas com laminas ovadas, estípulas filiformes, às
vezes caducas, flores solitárias, axilares pediceladas, epicálice ausente, cálise
cupuliforme, 5-laciniado, 5 pétalas brancas com mácula escura na base, estames
vários partes livres no ápice do tubo estaminal; ovário com tantos lóculos quanto o
número de estigmas, 1-3 óvulos por lóculo; estigmas capitados, frutos
esquizocárpicos, inflados, pendentes; carpídios com faces laterais frágeis,
deiscentes.e sementes 1-3, glabras ou pilosas, é uma erva que é nativa da
Califórnia, ocorrendo desde os Estados Unidos até a Argentina (FRYXELL, 1997).
Figura 03.
Figura 03: Herissantia crispa L. (Brizicky).
Carvalho, P. R. C.
. . .
45Estudo da atividade farmacológica dos...
3.9. Sidastrum paniculatum L. (Fryxell)
A Sidastrum paniculatum é conhecida popularmente como malva-roxa ou
malvavisco, é um arbusto perene, heliófilo e higrófilo, ocorrendo desde altitudes
ao nível do mar até altitudes em torno de 3 metros (BARACHO, 1998).
No Brasil, a região Nordeste é a que apresenta o maior número de
representantes do gênero Sidastrum, sendo provavelmente o centro de
diversidade do gênero no país. A análise fitoquímica de Sidastrum paniculatum
permitiu o isolamento de dois esteróides e dois flavonóides, descritos pela
primeira vez nesta espécie, os quais foram o canferol- 3-O-ß-D-(6’’-E-p-cumaroil)
glicosídeo pode ser considerado como um marcador quimiotaxômico por ter sido
encontrado em outras espécies de Malvaceae (COSTA, 2006; CAVALCANTE,
2006).
Carvalho, P. R. C.
. . .
46Estudo da atividade farmacológica dos...
O quadro 1 apresenta algumas atividades farmacológicas relacionadas com os
representantes da família Malvaceae.
ESPÉCIES
ATIVIDADE
FARMACOLÓGICA
REFERÊNCIAS
Abutilon aritum (Wall. Ex LinK) Sweet,
Carcinogênico
DEWICK, 2002.
Antioxidante
MIR-BABAEV ; SEREDA, 1987
Abutilon indicum (L.) Don.
Antiinflamatório;
Hepatoprotetor
KURMA; MISHRA, 1997.
Antifúngica, Antiúlcera
MA; SCHAFFER, 1953
Gastroprotetora
LING ; JONES, 1995
Hipoglicêmica
NAVARRETE et al., 2007 MCANUFF et al., 2005
Bakeridesia pickelii Moteiro
Anticancerígena (Inibidor do cancer de prostata e
de mama)
AWAD et al., 2005
Carvalho, P. R. C.
. . .
47Estudo da atividade farmacológica dos...
Anti-ofídica (contra veneno de cobra
Bothrops)
DIMAS et al., 2000
Antioxidante
GALOTTA ; BOAVENTURA,
2005
Antibacteriana
TRIANTS et al., 2005
Anti-HIV
MATSUDA et al., 2002
MAHMOOD et al., 1996
Bakeridesia pickelii Moteiro
Antiinflamatório
MOUNNISSAMY et al., 2002.
Gossypium arboreum L.
Antileucêmico, Antioxidante.
ROSENBLOOM, 2006.
Carcinogênico
NAKATANI et al., 1986
Gossypium stuntianum J. H. Willis
Carcinogênico.
DEWICK, 2002
Carvalho, P. R. C.
. . .
48Estudo da atividade farmacológica dos...
Antifúngico
MASSON et al., 2006
Larvicida contra A. aegypti
FURTADO et al., 2005
Antiinflamatório
SARTORI et al., 2003
Gossypium hirsutum L.
Ascaricida,
Anticoncepcional
masculino
LORENZI; MATOS, 2002
Anticonvulsivante , Anti-
bacteriana
SOUSA et al., 2006.
Larvicida contra A.
aegypti
FURTADO et al., 2005.
Hibiscus esculentus L.
Úlceras pépticas
YESILADA; GURBUZ, 2002.
Antioxidante,
Bloqueadora UV
CHICARO et al., 2004
Herissantia tiubae (K. Schum.) Brizicky
Espasmolítico
CAZAROLLI, 2004
Carvalho, P. R. C.
. . .
49Estudo da atividade farmacológica dos...
Antioxidante Hipotensora
PASTENE et al., 2001
Antiinflamatório,
GOHARA; ELMAZAR, 1998
Antinociceptiva
TOKER et al., 2004
Vasorelaxante
SILVA, 2005A, B
Anticancerígena
WANG et al., 2004
Herissantia tiubae (K. Schum.) Brizicky
Antidiabética
CAZAROLLI, 2004
Antiinflamatório AnticancerÍgena
PEREIRA et al., 2006
Anti-hepatotóxica
AWAD et al., 2005
Sida acuta Burm. F.
Hipocolesterolêmico e
sedativo
AGRICULTURAL RESEARCH
SERVICES, 2007
Carvalho, P. R. C.
. . .
50Estudo da atividade farmacológica dos...
Antiinflamatório
AQUINO et al., 1998
Sida veronicaefolia
Lam.
Hipocolesterolêmico
MOGHADASIAM; FROHLICHH,
1999
Analgésico, antiartrítico
MADAUS, 1976
Antibacteriano; antiinflamatório;
antioxidante; antipirético;
HUANG, 1993
Antisséptico
JU et al., 2007
Anticancerígeno
BASILE, 1999
Antibacteriano
KIM et al., 2000
Antialérgico
KIMATA, et al, 2000
Sida galheirensis Ulbr
Antioxidante Antiinflamatório
UEDA, et al., 2002
Sida cordifolia L.
Antioxidante
PIETTA, 2000
Carvalho, P. R. C.
. . .
51Estudo da atividade farmacológica dos...
Antioxidante
LEE, et al., 2000
Sida hermaphrodita ( L.) Rusby
Antifúngico
MING, et al., 2005
Antibacteriano
SAWER, 2005
Antidiabético
BIERER et al., 1998
Sida acuta Burm. F.
Antiasmático
CHATTERJEE, 2003
Sida spinosa L.
Antibacteriano, antiinflamatório e
analgésico Antiasmático
CHATTERJEE, 2003
Sida cordifolia L.
Antiasmático
CHATTERJEE, 2003
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Carvalho, P. R. C.
. . .
67Estudo da atividade farmacológica dos...
ARTIGO 1JOURNAL OF PHARMACY & PHARMACEUTICAL SCIENCES –SUBMETIDO
Carvalho, P. R. C.
. . .
68Estudo da atividade farmacológica dos...
In vitro and in vivo antitumor effects of the flavonol glycosides isolated of Herissantia crispa L.
(Brizicky)
Paulo R. C. Carvalho1, Jaciana S. Aguiar
1, Danielly A. Costa
2, Wemerson N. Matias
2, Yanna
Carolina F. Teles2, Maria de Fátima V. Souza
2, Paloma L. Medeiros
3, Eliete C. Silva
3, Teresinha
Gonçalves-Silva11, Silene C. Nascimento
1.
1
Department of Antibiotics, Federal University of Pernambuco
50670-901, Recife-PE, Brazil, 2Pharmaceutical Technology Laboratory, Federal University of Paraiba, University Campus, 970,
João Pessoa-PB, Brazil
3
Department of Histology and Embryology, Federal University of Pernambuco
50670-901, Recife-PE, Brazil,
ABSTRACT - PURPOSE. This paper describes the cytotoxic and antitumoral activities of the
kaempferol 3-O-(6”-O-E-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside (tiliroside), kaempferol 3,7-di-O-α-L-
rhamnoside (dhiramnoside) and of the mixture a mixture of sitosteryl-3-O-β-D-glucopyranoside
and stigmasteryl-3-O-β-D-glucopyranoside (GM) isolated of the Herissantia crispa. METHODS.
The aerial parts of Herissantia crispa was macerated in ethanol. The ethanol solution was
concentrated under vacuum, dissolved in EtOH:H2O (7:3) and partitioned with n-hexane,
chloroform, ethyl acetate and n-butanol, which after concentration under vacuum supplied to the
respective phases. The chloroform phase after this chromatographic process, 2.0g of the amorphous
substance were isolated and identified as being a mixture of sitosteryl-3-O-β-D-glucopyranoside
and stigmasteryl-3-O-β-D-glucopyranoside (GM). The ethyl acetate phase (10g) supplied 1,5g of
dhiramnoside and 1,2g of tiliroside. Their citotoxicity and anticancer activity were evaluated in
vitro and in vivo. RESULTS. The compounds have not presented cytotoxic activity against NCI-
H292, HEp-2 and KB cells. In the evaluation of the antitumor activity in vivo, dhiramnoside did not
present significant inhibitory activity of the growth of sarcoma 180 in doses tested (50 and
100mg/kg) when compared with the control group. However, tiliroside-treated animals showed a
high inhibition rate in the tumors growth, with a percentage of inhibition of the growth of sarcoma
180 of 52.7 and 60.5 in doses of 50 and 100mg kg-1 of weight, respectively. The mixture of
glycosides (GM) also inhibits significantly the growth of sarcoma 180. The tiliroside inhibit
significantly the growth of the carcinoma of Ehrlich at a dose of 100 mg kg-1. The histophatological
analysis showed that the kidneys of tiliroside-treated animals were only slightly affected, but the
livers had not presented alterations. CONCLUSIONS. In conclusion, among compounds tested,
tiliroside exhibited promising antitumor effects without an expressive toxicity. This activity seemed
to be related to its antioxidant properties and not to the reduction of tumor proliferation rate.
1 Corresponding author: Teresinha Gonçalves-Silva. Universidade Federal de Pernambuco.
Departamento de Antibióticos. R. Prof. Moraes Rego, 1235- Cidade Universitária. Recife-
Pernambuco. Brasil. Phone: +55 31 81 2126 8347; Fax: +55 31 81 2126 8346. E-mail address:
Carvalho, P. R. C.
. . .
69Estudo da atividade farmacológica dos...
INTRODUCTION Natural products are an important source of drugs leads. The study of natural products has
contributed enormously for the development of drugs with important therapeutic applications
currently used in modern medicine, from which, approximately 25% are derived directly or
indirectly from superior plants (1). New developments based on natural products include several
substances of importance, such as forscolin, which presents a promising effect against hypertension
(2), and many anticancer agents, including vindesine, etoposide, vincristine and topotecan (3).
Herissantia is a neotropical genus constituted by five or more species restricted to tropical
America. The majority of the species occurs in Mexico, Antilles and South America. Only
Herissantia crispa is of ample distribution, occurring from the United States until Argentina (4). In
the genus Herissantia, the species Herissantia tiubae has had previous phytochemistry and
pharmacological studies done and the Herissantia crispa has been described few pharmacological
studies (5).
Flavonoids have been identified as either simple or complexes glycosides in plants, and a human
has been estimated to consume approximately 1g flavonoids/day (6). Flavonoids have been
reported to exert multiple biological effects due to their antioxidant and free radical-scavenging
abilities, although results from different studies have demonstrated that flavonoids can act as pro-
oxidant at very high doses. Furthermore, most investigations have reported antibacterial,
antifungal, antiviral, anti-inflammatory, anti-allergic activity and protective roles in heart diseases,
cancer and different pathologies (7).
Tiliroside isolated from Geranium mexicanum, Cuphea pinetorum, Helianthemum glomeratum, and
Rubus coriifolius demonstrated in vivo anti-protozoal activities (8). Tiliroside, the principal
flavonol glycoside isolated from the flowers of Tilia argentea (linden) strongly inhibited serum
GPT and GOT elevations at doses of 25–100 mg/kg (p.o.) in d-GalN/LPS-treated mice, showing
hepatoprotetor effect (9).
The aim of this study was to investigate, in experimental models, in vivo and in vitro of the
tiliroside, dhiramnoside and mixture of sitosteryl-3-O-β-D-glucopyranoside and stigmasteryl-3-O-
β-D-glucopyranoside (GM) isolated from Herissantia crispa. In order to evaluate the cytotoxic
activity against NCI-H292, HEp-2 and KB tumor cells and the antitumor activity in vivo using the
tumor cell of Sarcoma 180 and Carcinoma of Ehrlich.
METHODS
Plant Material
The total plant, Herissantia crispa, was collected in the Pedra da Boca, in the region of Araruna -
PB, in September of 2004 and identified by the Profª Drª Maria de Fátima Agra, of the Nucleus of
Research in Natural Products /LTF/UFPB, being Vouchers were prepared and stored at Herbarium
Prof. Lauro Pires Xavier (CCEN/UFPB) under numeration 6237.
Isolation of the chemical constituents The aerial parts of Herissantia crispa were dried at 40ºC during three days and ground in a
mechanical mill. 5000g of the dust was macerated in ethanol for three days, the process being
repeated until the complete extration of the chemical constituents was achieved. The ethanol
solution was concentrated under vacuum, dissolved in EtOH:H2O (7:3) and partitioned with n-
hexane, chloroform, ethyl acetate and n-butanol, which after concentration under vacuum supplied
to the respective phases and the hydro alcoholic phase. The chloroform phase (6.0g) was
chromatographed in silica gel, eluted in n-hexane, chloroform and methanol, in an increasing
sequence of polarity. After this chromatographic process, 2.0g of the amorphous substance were
isolated, identified as being a mixture of sitosterol 3-O-D-glucopyranoside and stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranoside. The ethyl acetate phase (10g) after chromatography in column of sephadex
eluted with methanol supplied 1,5g of the kaempferol 3,7-di-O-α-L-ramnoside (dhiramnoside) and
Carvalho, P. R. C.
. . .
70Estudo da atividade farmacológica dos...
1,2g of kaempferol 3-O-β-D- (6” - E-p-cumaroil) glucopyranoside (tiliroside). The structures of the
substances were characterized through spectroscopic methods IV, 1D and 2D NMR and 13C (5).
Animals For the tests, were used swiss albino female mice (25–30 g), obtained from the Animal House of
Department of Antibiotics of the Federal University of Pernambuco, Brazil. The animals were
housed in cages with free access to food and water. All animals were kept under 12h light/dark
cycle (lights on at 6:00 am.). The animals were treated according to the ethical principles of animal
experimentation of COBEA (Brazilian College of Animal Experiments) Brazil and the norms of
the National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals. The Animal
Studies Committee of the Federal University of Pernambuco approved the experimental protocols
(number 116/07). Sarcoma 180 and carcinoma of Ehrlich cells are maintained in the peritoneal
cavities of the swiss mice in the Laboratory of Experimental Pharmacology and Cancerology of the
Federal University of Pernambuco.
Cells The cytotoxicity of kaempferol 3,7-di-O-α-L-raminosideo (dhiramnoside), kaempferol 3-O-(6”-O-
E-p-cumaroil)-β-D-glucopyranoside (tiliroside) and mixture of sitosteryl-3-O-β-D-glucopyranoside
and stigmasteryl-3-O-β-D-glucopyranoside (GM) were tested against NCI-H292(carcinoma of
human lungs), HEp-2 (carcinoma epidermoid of human larynx) and KB (carcinoma of the mouth)
all obtained from the Bank of Cells, Rio de Janeiro, Brazil. The cells were grown in DMEM –
Minimum Essencial Medium Eagle modified Dulbecco’s- medium supplemented with 10% fetal
bovine serum, 2 mM glutamine, 100 µg/ml streptomycin, 100 Uml−1 penicillin at 37°C with a 5%
CO2 atmosphere.
Antitumor Activity of kaempferol 3,7-di-O-α-L-ramnoside (dhiramnoside), kaempferol 3-O-
(6”-O-E-p-cumaroil)-β-D-glucopyranoside (tiliroside) and mixture of sitosteryl-3-O-ββββ-D-
glucopyranoside and stigmasteryl-3-O-ββββ-D-glucopyranoside (GM).
Cell Proliferation Assays
The tumor cell growth was quantified by the ability of living cells to reduce the yellow dye 3-(4,5-
dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) to a purple formazan product
(10). A cellular suspension (105 cells/mL) was prepared and distributed in 96-well (225µL/well)
and incubated by 24h at 37°C. After that, tiliroside, dhiramnoside and GM were added. At the end
of incubation (72 h), the plates were centrifuged and the medium was then replaced by fresh
medium (200 µl) containing 25 µl of MTT. Three hours later, the MTT formazan product was
dissolved in 100 µl DMSO, and the absorbance was measured using a multiplate reader (10,11).
The drugs effects were quantified as the percentage of control absorbance of reduced dye at 595
nm. The tested concentrations were 10.0, 5.0, 2.5 and 1.25 µg/mL and the experiments were done
in triplicate.
Assay of Antitumor Activity and Histopathology Study Ten-day-old sarcoma 180 ascites tumor cells and carcinoma of Ehrlich tumor cells (5 × 10
6 cell 200
µl−1) were implanted subcutaneously into the right axillary region of the experimental mice. One
day after inoculation, tiliroside, dhiramnoside and GM (50 and 100 mg kg−1) or doxorubicin (2.0
mg kg−1) was dissolved in saline solution containing 5% tween 80 and administered
intraperitoneally for 7 days. The negative control was injected with vehicle. On day 8, the mice
were killed and the tumors were excised, weighed and fixed in 10% formaldehyde. The inhibition
ratio (%) was calculated by the following formula: inhibition ratio (%) = [(A − B)/A] × 100, where
A is the average tumor weight of the negative control, and B is the tumor weight of the treated
group (12).
Carvalho, P. R. C.
. . .
71Estudo da atividade farmacológica dos...
Histopathology Observations For histology, tissue samples (tumors, livers and kidneys) were fixed in 10% buffered formalin and
paraffin-embedded. Sections of 5 µm were stained with hematoxylin and eosin. The histopathology
analysis was performed using a video-microscope system MOTIC (BA200) with digital camera
MOTICAM (1000 1.3M, Pixel–USB 2.0).
RESULTS
Citotoxy activity
The in vitro activity of tiliroside, dhiramnoside and GM against three human tumor cell lines were
determined. However, all compounds assayed did not show cytotoxicity at the tested concentrations
(Table 1).
Table 1. In vitro Cytotoxicity of the dhiramnoside, tiliroside the mixture of sitosteryl-3-O-ββββ-D-
glucopyranoside and stigmasteryl-3-O-ββββ-D-glucopyranoside (GM) isolated of the Herissantia
crispa on tumor cell lines.
Cells line
CI50 (µg/mL) Compounds
KB NCI-H292 HEp-2
Dhiraminoside >10 >10 >10
GM >10 >10 >10
Tiriloside >10 >10 >10
Antitumoral activity
The effects of dhiramnoside, tiliroside and GM in mice transplanted with the tumor sarcoma 180
are shown in figure 1. On day 8, the average tumor weight in the sarcoma 180 was 1.35± 0.13g in
control mice and 0.64 ± 0.08 g in mice treated with tiliroside at the dose 50 mg kg-1day
-1 and
0.53±0.07g in mice treated with 100 mg kg-1day
-1. The inhibitions were significant for tiliroside in
both doses in relation to the control group (P < 0.05). The mixture of glycosides presented the
average tumor weight in the sarcoma 180 was 0.74±0.05g and 0.34±0.06g at the dose 50 and 100
mg kg-1day
-1, respectively. For dhiramnoside, the average tumor weight was 1.2±0.14 and 1.2±0.13
at the dose 50 and 100 mg kg-1day
-1, respectively (Figure 1A). The control drug doxorubicin
presented average tumor weight 0.61±0.17 in mice transplanted with sarcoma 180 tumor. As
tiliroside was isolated with good yields and presented a promising activity in sarcoma 180, we
selected it so as to continue the studies with the carcinoma of Ehrlich. The average tumor weight in
the carcinoma of Ehrlich was 1.75±0.13g in control mice and 1.49±0.09 g in mice treated with
tiliroside at the dose 50 mg kg-1day
-1 and
0.51±0.07g in mice treated with 100 mg kg
-1day
-1. The
doxorubicin in the dose of 2.0 mg kg-1day
-1 reduced tumor weight by 45,2% (0.74±0.2g), within the
same period (Figure 1).
Carvalho, P. R. C.
. . .
72Estudo da atividade farmacológica dos...
Sarcoma 180
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
Control
Dhiramnoside 50mg/kg
Dhiramnoside 100mg/kg
Tiliroside 50 mg/kg
Tiliroside 100 mg/kg
GM 50 mg/kg
GM 100 mg/kg
Doxorubicin 2mg/kg
Tum
or weight (g)
Control Dhiramnoside 50mg/kgDhiramnoside 100mg/kgTiliroside 50 mg/kgTiliroside 100 mg/kgGM 50 mg/kgGM 100 mg/kgDoxorubicin 2mg/kg
A
*
*
* *
*
Carcinoma of Ehrlich
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Control Tiliroside50mg/kg
Tiliroside100mg/kg
Doxorubicin2mg/kg
Tumor weight (g)
Control
Tiliroside 50mg/kg
Tiliroside 100mg/kg
Doxorubicin 2mg/kg
B
* *
Figure 1. Effect of tiliroside, dhiramnoside and the mixture mixture of sitosteryl-3-O-ββββ-D-
glucopyranoside and stigmasteryl-3-O-ββββ-D-glucopyranoside (GM) in mice transplanted with
sarcoma 180 tumor (A) and carcinoma of Ehrlich (B). Data are presented as mean±SEM of
eight animals. * (P< 0.05) compared with control by ANOVA one-way followed by
Bonferroni.
Histopathology Observations
In the present study it was observed clearly that the animals treated with the tiliroside (100mg Kg-
1) had presented perivascular lymphocyte infiltration around the centrolobular vein and cells of
inflammatory infiltrate spreaded in some areas of the hepatic parenchyma (figure 1D); moreover, it
can also be observed changed in the glomerular morphology such as glomerular swelling
decreasing the urinary space (Figure 2 E), when compared with the respective controls (Figure 2B).
The structural characteristics of sarcoma 180 had disclosed in both tumors, (treated and
control groups), cells with ovoid formats, organized in a mantle with little stroma. In the tumors
treated with the tiliroside (100mg/kg), the histophatologic findings had been, in part, similar to
Carvalho, P. R. C.
. . .
73Estudo da atividade farmacológica dos...
m
m
m
g
*
*
* *
*
g
L
L
DDDD
L
AAAA
BBBB
V
V
EEEE
FFFF CCCC
those finding in the tumors not treated (controls), at which time we also observed adipose
subcutaneous tissue in the treated tumors (Figure 1F) and skeletal striated muscle in the tumors not
treated (Figure 2C).
Figure 2 - Photomicrography of organs (liver and kidneys) and tumor (Sarcoma 180) of mice
swiss. Animals control: A) Liver with centrolobular vein (v) around preserved hepatocytes
and capillaries sinusoides preserved. B) Kidney with glomerelus renals (*) and spaces
(arrows) without any alterations, C) Sarcoma 180 with muscular infiltration (m). Tiliroside-
treated animals: D) To notice areas of perivascular lymphocytic infiltration (L) and spread in
hepatic parenchyma, preserved hepatocytes and capillaries sinusoides. E) Renals glomerelus
(*) with reduction of the urinários spaces (arrows), F) Sarcoma 180 with greasy infiltration
(g). H.E.: 100X.
Carvalho, P. R. C.
. . .
74Estudo da atividade farmacológica dos...
Statistical Analysis Data are presented as mean ± SE. The differences between the experimental groups were compared
by analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni (P < 0.05) using the Origin 8.0 program.
N= 6 animals.
DISCUSSION The species of the Malvaceae family present several pharmacological properties. However, in the
genus Herissantia, only the species Herissantia tiubae has had previous phytochemistry and
pharmacological studies done and the Herissantia crispa has been described few phamacological
studies (5).
Tiliroside, dhiramnoside and GM did not show any significant in vitro cytotoxic effect at the
experimental exposure levels, but tiliroside and GM showed a promising in vivo antitumor effect.
In the preclinical anticancer drug-screening program used in this study, only the lead compounds
that presented IC50 values below 1 µgml−1 were considered as promising (13). All compounds
tested showed IC50 values greater than 10 µgml−1 for all tumor cell lines tested, suggesting that the
in vivo anticancer properties were not related to direct antiproliferative effects. Some compounds
isolated of Hisbiscos taiwanensis of the Malvaceae family had also not presented cytotoxic activity
in lines of human cells H.549 (carcinoma of lung) and NC5-7 (breast carcinoma) until the dose of
20 µg/mL (14). In previous studies, the tiliroside was tested in the tumor cell lines CCRF-CEM,
H33AJ-JA13, HUT-78, H9, NAMALWA, JIYOYE, CCRF-SB, K562, U937, and was active only
in CCRF-CEM and NAMALWA (15).
In the in vivo assays dhiramnoside did not inhibit the growth of sarcoma 180 in dose of 50 mg/kg
and 100mg/kg of weight. However, a significant reduction in the weight of the tumors was
observed for the tiliroside and GM dose of 100mg/kg. The percentage of inhibition of the tumoral
growth for the tiliroside in sarcoma 180 was of 52.7 and 60.5 in the doses of 50 and 100mg/kg of
weight, respectively. The mixture of glycosides also significantly inhibited the growth of sarcoma
180. Nevertheless, the effect of tiliroside and mixture of glycosides seems to be dose-dependent.
As tiliroside was isolated with good yields and presented a promising activity in sarcoma 180
tumor, we selected it so as to continue the studies with the carcinoma of Ehrlich. The tiliroside did
not inhibit the growth of the carcinoma of Ehrlich in the dose of 50 mg/kg, however in the dose of
100mg/kg of weight presented a 70.8% inhibition. This compound also presented results very
promising in the inhibition of the tumoral growth, whose the response it seems to be dose-
dependent. We do not find in literature previous studies of the tiliroside with animals tumors, as
well as this work it is the first description of the antitumor studies with tiliroside isolated from
Herissantia crispa.
Histology alterations observed in the organs analysed (liver and kidneys) under a biologically
active compound, such as tiliroside, identified from the phytochemical analysis of the Herissantia
crispa extract, alerted us as to the hepatic involvement as evidenced by the perivascular
lymphocytic infiltration and spread throughout the parenchyma, as well as the renal involvement
through the changed in the glomerular morphology such as glomerular swelling decreasing the
urinary space. Findings in literature suggest that the area of glomerular filtering could be
responsible for a deficiency in the ability to excrete sodium and water, important factors in the
genesis of primary arterial hypertension (16, 17). Antitumor studies in vivo of the compound
tiliroside and dhiramnoside could not be found in literature, seeing that the hystopathological
results presented represent, however, the first description of the structural constitution of organs
(liver and kidneys) and tumor (sarcoma 180) under a tiliroside activity.
Flavonoids have been identified as either simple or complex glycosides in plants. These poly
phenolic compounds and their sugar derivatives display a remarkable spectrum of biological
activities including antitumor (9). Furthermore, a flavonoid derivative flavopiridol has been found
Carvalho, P. R. C.
. . .
75Estudo da atividade farmacológica dos...
to inhibit cyclin-dependent kinases, induce apoptosis, suppress inflammation, and modulate the
immune response (18). Moreover, flavonoids are potent scavengers of reactive oxygen species and
thus prevent per oxidation of lipids (19). These compounds often exhibit a strong antioxidant
activity, notably due to the presence of hydroxyl groups and aromatic heterocyclic rings that
provide these molecules with hydrophilic and particular stability. Recent studies have also
indicated that flavonoids act as cellular modulators by interaction with enzymes, receptors, and
transcription factors of intracellular signalling cascades: understanding the role of flavonoids as
antioxidants and modulators of cell signalling could explain their potential as anticancer agents and
neurodegeneration inhibitors (20, 21).
In conclusion, among compounds tested, tiliroside exhibited anti tumor effects on experimental
tumors without an expressive toxicity. This activity seemed to be related to its anti-inflammatory
and antioxidant properties and not to the reduction of tumor proliferation rate. Moreover, further
studies are in progress to determine its mechanism of action.
Acknowledgments: This research was supported by CNPq. In addition, a part of this investigation
was supported by UFPE/PROPESQ in the form of fellowship awards. We thank Maria do Desterro
Rodrigues for technical assistance.
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Carvalho, P. R. C.
. . .
78Estudo da atividade farmacológica dos...
STEROIDAL AND PHENOLIC COMPOUNDS FROM Sidastrum Paniculatum
(L.) Fryxell AND EVALUATION OF CITOTOXICITY AND ANTI-
INFLAMMATORY ACTIVITIES
José Marcílio Sobral Cavalcante; Tiago Bezerra de Sá de Souza Nogueira; Anna
Cláudia de Andrade Tomaz; Paulo Roberto Cavalcanti Carvalho; Silene Carneiro
do Nascimento; Teresinha Gonçalves-Silva; Maria de Fátima Vanderlei de
Souza*
Laboratório de Tecnologia Farmacêutica “Prof. Delby Fernandes de Medeiros”,
Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba, Caixa Postal
5009, 58051-970, João Pessoa, PB, Brasil.
Laboratório de Bioensaios para Pesquisa de Fármacos, Departamento de
Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco 50670-901, Recife, PE, Brasil.
*e-mail: [email protected]
Carvalho, P. R. C.
. . .
79Estudo da atividade farmacológica dos...
STEROIDAL AND PHENOLIC COMPOUNDS FROM Sidastrum Paniculatum
(L.) Fryxell AND EVALUATION OF CITOTOXICITY AND ANTI-
INFLAMMATORY ACTIVITIES
Sidastrum paniculatum (L.) Fryxell belongs to the family Malvaceae and is
popularly known as “malva roxa” or “malvavisco”. The phytochemical study of the
hexane, CHCl3 and EtOAc phases from the crude extract of S. paniculatum led to
the isolation of six compounds: a β-sitosterol and stigmasterol mixture, m-
methoxy-p-hydroxy-benzoic acid, m-methoxy-p-hydroxy-benzaldehyde, N-trans-
feruloyltyramine and kaempferol-3-O-β-D-(6’’-E-p-coumaroyl) glucoside. The
structural identification of these compounds was made on the basis of
spectroscopic methods such as IR, NMR 1H and 13C with the add of two-
dimensional techniques (HOMOCOSY, HETCOR, HMQC, HMBC and NOESY),
besides comparison with literature data.
Keywords: Sidastrum paniculatum, Malvaceae, chemical compounds.
Carvalho, P. R. C.
. . .
80Estudo da atividade farmacológica dos...
INTRODUCTION
The species Sidastrum paniculatum (L.) Fryxell is a bush that belongs to the
family Malvaceae and is popularly known as “malva-roxa” or “malvavisco”. In
Brazil, the northeast region is probably the diversity core of the genus Sidastrum
since a great number of species can be found there.1
Previous phytochemical studies on species from Malvaceae have reported
the presence of steroids,2,3,4,5 phenols,3,4,6 flavonoids,3,4,5,7,8 triterpenes,2,6 essential
oils,9 alkaloids,10 sesquiterpenelactones,11 fatty acids,12,13,14,15 and pheophorbide.3
Aiming at contributing to the chemotaxonomic study of the family
Malvaceae and considering the absence of data in literature concerning the
chemical constitution of the genus Sidastrum, the species Sidastrum paniculatum
was submitted to a phytochemical study to isolate and identify its chemical
constituents, through usual chromatographic and spectroscopic methods, besides
comparison with literature data.
EXPERIMENTAL
General procedures
NMR spectra (HOMOCOSY, HETCOR, HMQC, HMBC and NOESY) were
measured in CDCl3, CD3OD and recorded on a Mercury Varian instrument
operating at 200 MHz and 50 MHz for 1H and 13C, respectively. The solvent signal
was used as internal standard. IR spectra were measured on a Perkin-Elmer, FT-
IR-1750 spectrometer in KBr pellets. Chromatography columns were carried out
on silica gel (Merck) and Sephadex LH-20 (Merck). TLC were performed on silica
gel PF254 plates and the spots were visualized under UV light (254 and 366 nm)
and by exposure to the iodine vapor.
Carvalho, P. R. C.
. . .
81Estudo da atividade farmacológica dos...
Plant material
The whole plant of S. paniculatum was collected in Pedra da Boca, in the
city of Araruna, State of Paraíba, on February 2004. The botanical identification
was made by Dr. Maria de Fátima Agra from the Botany section of Núcleo de
Pesquisa de Produtos Naturais of Laboratório de Tecnologia Farmacêutica (LTF)
and a voucher specimen was deposited at the Herbarium Prof. Lauro Pires Xavier
(JPB), Universidade Federal da Paraíba, under the code 6051.
Extraction and isolation
The plant material (10 kg) was subjected to dehydration in an oven in a
temperature of 40ºC for 72 hours; after that, it was grownded in a mechanical mill,
yielding 5.7 kg of a powder which was submitted to maceration with ethanol for
three consecutive days. This process was repeated until the maximum extraction
of the chemical constituents. The obtained ethanol extractive solution was
concentrated in a rotatory evaporator, yielding 500 g of crude ethanol extract
(CEE). The latter was suspended in ethanol:H2O (9:1) and successively partitioned
with hexane, CHCl3, EtOAc and n-butanol. 6.0 g of the hexane extract were
subjected to column chromatography packed with silica gel and eluted with
hexane, CHCl3, EtOAc and methanol. 69 fractions of 20 mL each were collected
and analysed and combined through analytical thin-layer chromatography (TLC).
The sub-fraction 37/42 (1.36 g) was rechromatographed on silica gel column
eluted with hexane, CHCl3 and methanol providing 15 sub-fractions which were
analysed and joined through analytical TLC. The sub-fraction 11/15 showed itself
as crystals, yielding 0.093 g of substance 1. The CHCl3 extract provided a
precipitate and a supernatant. 6.0 g of the latter were submitted to
Carvalho, P. R. C.
. . .
82Estudo da atividade farmacológica dos...
chromatography on a column packed with silica gel and eluted with hexane,
EtOAc and methanol, giving 239 fractions that were analysed and joined through
analytical TLC. 0.81 g of the sub-fraction 5/15 was rechromatographed on silica
gel column utilizing the above eluents, yielding 177 sub-fractions which were
combined and analysed through analytical TLC. The sub-fraction 26/57 (0.05 g)
showed itself as an amorphous solid, defined as substance 2. The sub-fraction
26/102, on the other hand, was rechromatographed following the previous
methodology, providing 96 sub-fractions of which the sub-fraction 43/56 was
recrystallized in chloroform and drops of methanol, yielding 0.025 g of the
substance 3. 0.15 g of the precipitate was submitted to preparative TLC, utilizing a
mixture of hexane:ethyl acetate (1:1) as eluent, resulting on the isolation and
purification of 0.021 g of substance 4. 3.0 g of the ethyl acetate extract were
subjected to chromatography column packed with Sephadex LH-20 and eluted
with methanol, providing 23 sub-fractions that were analysed and combined
through analytical TLC. The sub-fraction 12/16 (0.087 g) was rechromatographed
according to the above methodology, yielding 14 sub-fractions which were
analysed and combined through analytical TLC. The sub-fraction 5/8 (0.032 g)
was defined as substance 5.
Cells
The cytotoxicity of β-sitosterol and stigmasterol mixture was tested against
NCI-H292 (carcinoma of human lungs), HEp-2 (carcinoma epidermoid of human
larynx) and KB (carcinoma of the mouth) all obtained from the Bank of Cells, Rio
de Janeiro, Brazil. The cells were grown in DMEM – Minimum Essencial Medium
Eagle modified Dulbecco’s- medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 2
Carvalho, P. R. C.
. . .
83Estudo da atividade farmacológica dos...
mM glutamine, 100 µg/ml streptomycin, 100 Uml−1 penicillin at 37°C with a 5%
CO2 atmosphere.
Animals
For the tests, were used swiss albino female mice (25–30 g), obtained from
the Animal House of Department of Antibiotics of the Federal University of
Pernambuco, Brazil. The animals were housed in cages with free access to food
and water. All animals were kept under 12h light/dark cycle (lights on at 6:00 am.).
The animals were treated according to the ethical principles of animal
experimentation of COBEA (Brazilian College of Animal Experiments) Brazil and
the norms of the National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory
Animals. The Animal Studies Committee of the Federal University of Pernambuco
approved the experimental protocols (number 116/07). Sarcoma 180 and
carcinoma of Ehrlich cells are maintained in the peritoneal cavities of the swiss
mice in the Laboratory of Experimental Pharmacology and Cancerology of the
Federal University of Pernambuco.
Cell Proliferation Assays
The tumor cell growth was quantified by the ability of living cells to reduce
the yellow dye 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide
(MTT) to a purple formazan product (10). A cellular suspension (105 cells/mL) was
prepared and distributed in 96-well (225µL/well) and incubated by 24h at 37°C.
After that, the β sitosterol and stigmasterol mixture was added. At the end of
incubation (72 h), the plate was centrifuged and the medium was then replaced by
fresh medium (200 µl) containing 25 µl of MTT. Three hours later, the MTT
Carvalho, P. R. C.
. . .
84Estudo da atividade farmacológica dos...
formazan product was dissolved in 100 µl DMSO, and the absorbance was
measured using a multiplate reader27,28. The drugs effects were quantified as the
percentage of control absorbance of reduced dye at 595 nm. The tested
concentrations were 10.0, 5.0, 2.5 and 1.25 µg/mL and the experiments were done
in triplicate.
Statistical analysis
The experiments were analyzed according to the mean ± standard deviation
of the average (DPM) the percentage of inhibition of cell growth using the program
GraphPad Prism.
Anti-inflammatory activity
Air pouches were produced on the dorsal cervical region of mice (25-30 g)
by subcutaneous injection of 2.5 mL on day 0, followed by a second injection of
2,5 ml of sterile air 3 days later. Only day 6, carrageenan solution 1ml of a 1%
(w/v) was injected into the cavity. The compound and indometacin were
administered orally 1h before injection of carrageenan. After 6h, mice were
sacrificed, pouches were washed with 3 mL of saline solution containing 3 mM
EDTA, and number of migrated neutrophils determined, following staining with
Turk’s solution (0,01% crystal violet in 3% acetic cid) and counting performed
using a Neubauer haemocytometer17.
Carvalho, P. R. C.
. . .
85Estudo da atividade farmacológica dos...
RESULTS AND DISCUSSION
The structural assignments of compounds 1-3 and 5 were made based on
the spectral analysis and are in good agreement with those reported in the
literature. Thus, their structures were identified as the mixture of the steroids β-
sitosterol and stigmasterol (1),16 m-methoxy-p-hydroxy-benzoic acid (2),4,17 m-
methoxy-p-hydroxy-benzaldehyde (3)18 and kaempferol 3-O-β-D-(6’’-E-p-
coumaroil) glucopyranoside (5) (tiliroside).3,4,7 All of them are being reported here
for the first time in the genus Sidastrum. Compound 5 (tiliroside) was previously
isolated from Malvaceae species, for example Sida galheirensis,3 Bakeridesia
pickelli,4 Herissantia crispa.5 and Herissantia tiubae.7
The IR spectrum of compound 4 showed a large absorption band at 3300-
3350 cm-1 (N-H bending) and at 1658 cm-1 (C=O bending) suggesting an amide
function. The aromatic skeleton was evidenced by the absorptions between 1600
and 1450 cm-1.19 The 1H NMR spectra showed a pair of doublets at δ 6.68 and δ
6.96 (2H, J = 8.40 Hz), characterizing A,A′, B,B′-type aromatic hydrogens.20 It
showed yet a doublet at δ 6.74 (1H, J = 8.80 Hz) together with a large doublet at δ
6.93 (1H) and a large singlet at δ 6.90 (1H), characterizing ABX-type aromatic
hydrogens.
Those IR and 1H NMR data together with a pair of doublets at δ 6.16 and δ
7.37 (H-8, 7, J = 15.80 Hz) referring to trans olefinic hydrogens 7 and a pair of
triplets at δ 2.67 and δ 3.43 (H-7’, 8’), suggested the presence of the coumaroyl
and tyramine units, respectively. A methoxyl group in one of the aromatic nuclei
was inferred by the signal at δ 3.79.
The 13C NMR spectral data strengthened the information provided by the IR
and 1H NMR spectra, emphasizing the presence of the amide function due to the
Carvalho, P. R. C.
. . .
86Estudo da atividade farmacológica dos...
signal at δ 167.04 (α,β-unsaturated carbonyl) thus reinforcing the coumaroyl unit
because of the α,β-unsaturated carbons (C-8 and C-7) at δ 117.47 and δ 140.89,
respectively, as well as the tyramine unit whose methylene carbons were shown to
be at δ 34.41 (C-7’) and δ 40.89 (C-8’). The absorptions at δ 115.17 and δ 129.53
(2C, C-3’/5’ and C-2’/6’) corroborated the A,A′, B,B′ system, while a methoxyl
group was suggested by the signal at δ 55.56. Non-hydrogenated carbons bound
to oxygen groups were inferred by the signals at δ 147.20, δ 147.60 and δ 155.12.
The homonuclear correlation spectrum COSY showed coupling between δ
2.67 (H-7’) and δ 3.43 (H-8’) of the tyramine portion, and between at δ 6.16 (H-8)
and δ 7.37 (H-7) of the coumaroyl one.
The heteronuclear correlation spectrum HMBC confirmed the suggestion of
the α,β-unsaturated amide strengthening the presence of the coumaroyl and
tyramine units since it showed, respectively, two- and three-bond correlations
(2,3JCH) between C-1’ with H-7’ and H-8’, respectively, and 2JCH and
3JCH
correlations between the carbonyl carbon and H-8 and H-7, respectively (Figure
1).
Figure 1: Correlations observed at the HMBC spectrum of 4
CH
CH2
CH2NHCH1
234
5
67
8
2'
3'
4'
5'6'
7'8'
O
R1
R2
R3
J2J2
J3 J3
Carvalho, P. R. C.
. . .
87Estudo da atividade farmacológica dos...
N H
O H
H O H
O C H 3
O
The homonuclear correlation spectrum NOESY revealed the space coupling
between the methoxyl hydrogens with H-2, thus determining the meta position for
the methoxyl group in the coumaroyil portion of the molecule (Figure 2).
The other assignments of carbons and hydrogens were determined based
on all spectral data (Table 1) and on comparison with the literature ones,3,4,7
permitting to unambiguously identify substance 4 as being the N-trans-
feruloyltyramine (Figure 3), substance already isolated from other vegetal species
21,22,23,24 with studies demonstrating its action against weeds and improvement of
seed germination,25,26 being described for the first time in the family Malvaceae.
Figure 3: Substance 4 (N-trans-feruloyltyramine)
Figure 2: Coupling observed at the NOESY spectrum of 4
NH1
23
4
5
6 7
81'
2'
3'
4'
5'
6'7'
8'
O OH
HO
OCH3
9
Carvalho, P. R. C.
. . .
88Estudo da atividade farmacológica dos...
Table 1: 1H and 13C NMR data (δ, CDCl3, 200 and 50MHz) of compound 4
1H x 13C-HETCOR
1H x 13C-
HMBC
1H x 1H-
COSY
1H x 1H-
NOESY
C δC δH J2 J3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1’
2’/6’
3’/5’
4’
7’
8’
OCH3
126.82
109.70
147.69
147.20
114.91
121.89
140.89
117.47
167.04
129.68
129.53
115.17
155.17
34.41
40.89
55.56
-
6.90(bs)
-
-
6.74(d, J=8.40Hz)
6.93(bd)
7.37(d, J=15.80Hz)
6.16(d, J=15.80Hz)
-
-
6.96(d, J=8.40Hz)
6.68(d, J=8.40Hz)
-
2.67(t, J=6.9Hz)
3.43(t J=6.9Hz)
3.79(s)
-
C-3
-
-
-
-
-
C-9
-
-
C-1’
C-2’/6’,C-4’
-
C-1’, C-8’
C-7’
-
-
C-6, C-7
-
-
C-1
-
C-9
C-1
-
-
C-4’
-
-
C-2’/6’
C-1’
-
-
-
-
-
-
-
H-8
H-7
-
-
-
-
-
H-8’
H-7’
-
-
OCH3, H-8
-
-
-
H-7
H-6
H-2
-
-
-
-
-
-
-
H-2
Carvalho, P. R. C.
. . .
89Estudo da atividade farmacológica dos...
Citotoxy activity
The in vitro activity of mixture β-sitosterol and stigmasterol against three
human tumor cell lines were determined however, the mixture assayed did not
show cytotoxicity at the tested concentrations (table 2).
Table 2. CITOTOXY ACTIVITY OF THE MIXTURE OF Β-SITOSTEROL AND
STIGMASTEROL
Cells lines
CI50 (µg/mL) Product
KB NCI-H292 HEp-2
Mixture of Β-sitosterol
and stigmasterol >10 >10 >10
The mixture of stigmasterol-sitosterolβ isolated from the kind of Sidastrum
paniculatum showed no activity cytotoxic in tumor cell lines of human KB, NCI-
H293 and Hep-2. According to the protocol of the National Cancer Institute (NCI-
USA), for all products from plants are considered active the IC50 should be less
than or equal to 30µg/mL.
The compound tested showed IC50 values greater than 10 µgml−1 for all
tumor cell lines tested. These values figure show that the product has low toxicity
tested cell, which is desirable in the case of anti-inflammatory drugs. It would also
appear that in some compounds isolated from the family Malvaceae Hisbiscos
taiwanensis also showed no activity cytotoxic in strains of human cells H.549
(carcinoma of the lung) and NC5-7 (breast cancer) to the dose of 20µg/mL28.
Carvalho, P. R. C.
. . .
90Estudo da atividade farmacológica dos...
The mixture of β-sitosterol of and stigmasterol showed significant
antiinflammatory activity when compared to the control group, inhibiting cell
migration induced by carrageenan by 30, 56,8 and 81,2% at doses of 10, 30 and
90 mg / kg of weight, respectively (Table 3).
The leukocytes polymorphonuclear of number that migrated to the
peritoneal cavity in the group control was 4,53 ± 0,8 and standard dexamethasone
was 0,90 ± 0,3 x 106 cells per well (p <0,05 for all doses).
TABLE 3. ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA
Product Doses PMN cells ± SD
(x106)/cavity
Inhibition (%)a
90 0,85±0,3 81,2
30 1,96±0,3 56,8
Mixture of ββββ-sitosterol
and stigmasterol
10 3,17±0,6 30,0
Dexametasona 3 0,90±0,3 80,2
Controle - 4,53± 0,8 -
PMNL = polymorphonuclear leucocytes;. PMNL count is expressed as total cell number by volume of exudate. Activity (%) was calculated considering the control group cells counting as 100%. aValues represent average ± standard desviation.
Carvalho, P. R. C.
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95Estudo da atividade farmacológica dos...
7- CONCLUSÃO
Estudo Citotóxico
• Os glicosideos β-sitosterol+estigmasterol glicosilados, diraminosídeo e
tirilosídeo não apresentaram atividade citotóxica frente às linhagens
celulares KB, NCI-H292 e HEp-2.
Atividade Antitumoral
• O glicosideo tirilosídeo apresentou uma inibição significativa frente ao
sarcoma 180 e no carcinoma de Ehrlich, sugerindo, que a atividade seja
dose-dependente, sendo ainda confirmada com a administração de outras
doses;
• O diraminosídeo não inibiu o crescimento do Sarcoma 180;
• A mistura β-sitosterol+estigmasterol também apresentou uma inibição
significativa frente ao sarcoma 180, sugerindo que a atividade seja dose-
dependente.
Carvalho, P. R. C.
. . .
96Estudo da atividade farmacológica dos...
Histopatologia de tumores e órgãos.
• No estudo histológico dos órgãos analisados (fígado e rins) foi verificado
um comprometimento hepático pela evidenciação de infiltração linfocitária
perivascular e espalhada no parênquima, apresentando um
comprometimento renal pela acentuada redução da área de filtração
glomerular;
• No sarcoma 180 foi verificado em ambos os grupos (controle e tratado)
células com formatos ovóides, tecido adiposo subcutâneo e nos tumores
tratados com o tilirosídeo músculo estriado esquelético.
Atividade antiinflamatória
• Os glicosideos tirilosídeo, β-sitosterol+estigmasterol glicosilados e o
diraminosídeo apresentaram uma boa inibição na atividade antiinflamatória
quando comparados a Indometacina;
• Este estudo revelou que os produtos são uma alternativa promissora a ser
explorada para a ação antiinflamatória.
Carvalho, P. R. C.
. . .
97Estudo da atividade farmacológica dos...
Atividade analgésica
• Os glicosideos tirilosídeo, β-sitosterol+estigmasterol glicosilados e o
diraminosídeo apresentaram uma boa inibição na atividade analgésica;
• Este estudo revelou que os produtos são também uma alternativa
promissora a ser explorada para a ação analgésica.