Download - Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
1/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Indonesia merupakan negara kepulauan yang terletak di zona
khatulistiwa (tropik) dan terkenal mempunyai kekayaan alam dengan
beranekaragam jenis tumbuhan, tetapi potensi ini belum seluruhnya
dimanfaatkan sebagai bahan industri khususnya tumbuhan berkasiat obat.
Masyarakat Indonesia secara turun-temurun telah memanfaatkan berbagai
jenis tumbuhan untuk bahan obat tradisional baik sebagai tindakan
pencegahan maupun pengobatan terhadap berbagai jenis penyakit.
Pemanfaatan tumbuhan obat tradisional akan terus berlangsung terutama
sebagai obat alternatif, hal ini terlihat pada masyarakat daerah yang sulit
dijangkau oleh fasilitas kesehatan modern.(Sulianti et al, 2005).
Penemuan berbagai senyawa obat baru dari bahan alam semakin
memperjelas peran penting metabolit sekunder tanaman sebagai sumber
bahan baku obat. Metabolit sekunder adalah senyawa hasil biogenesis dari
metabolit primer. Umumnya dihasilkan oleh tumbuhan tingkat tinggi, yang
bukan merupakan senyawa penentu kelangsungan hidup secara langsung,
tetapi lebih sebagai hasil mekanisme pertahanan diri organisma. Aktivitas
biologi tanaman dipengaruhi oleh jenis metabolit sekunder yang terkandung
didalamnya. Aktivitas biologi ditentukan pula oleh struktur kimia dari
senyawa. Unit struktur atau gugus molekul mempengaruhi aktivitas biologi
karena berkaitan dengan mekanisme kerja senyawa terhadap reseptor di
dalam tubuh (Lisdawati et al., 2007).
Salah satu pendekatan untuk penenlitian tumbuhan obat adalah
penapisan senyawa kimia yang terkandung dalam tanaman. Cara ini
digunakan untuk mendeteksi senyawa tumbuhan berdasarkan golongannya.
Sebagai informasi awal dalam mengetahui senyawa kimia apa yang
mempunyai aktivitas biologi dari suatu tanaman.
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
2/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 2
Fitokimia atau kimia tumbuhan mempelajari aneka ragam senyawa
organik yang dibentuk dan ditimbun oleh tumbuhan, yaitu mengenai
struktur kimianya, biosintesisnya, penyebarannya secara ilmiah serta fungsi
biologinya. Senyawa kimia sebagai hasil metabolit sekunder atau metabolit
sekumder telah banyak digunakan sebagai zat warna, racun, aroma
makanan, obat-obatan dan sebagainya serta sangat banyak jenis tumbuh-
tumbuhan yang digunakan obat-obatan yang dikenal sebagai obat tradisional
sehingga diperlukan penelitian tentang penggunaan tumbuh-tumbuhan
berkhasiat dan mengetahui senyawa kimia yang berfungsi sebagai obat.
Senyawa-senyawa kimia yang merupakan hasil metabolisme sekunder pada
tumbuhan sangat beragam dan dapat diklasifikasikan dalam beberapa
golongan senyawa bahan alam yaitu terpenoid, steroid, kumarin, flavonoid
dan alkaloid.
Untuk mengetahui kandungan kimia yang berkhasiat obat pada
bahan alam, maka perlu dilakukan analisis kuantitatif/identifikasi terhadap
senyawa senyawa tersebut dengan uji pereaksi kimia dan Kromatografi
Lapis Tipis (KLT).
1.2 Prinsip percobaan
1. Pengujian golongan senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada
tumbuhan segar berdasarkan kelarutannya dengan menggunakan pelarut
yang sesuai dengan kepolarannya kemudian diidentifikasi dengan
pereaksi warna yang spesifik untuk masing-masing senyawa.
2.
Pemisahan senyawa dari tanaman dengan ekstraksi metode dingin, yaitu
dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol.
3. Ekstraksi cair-cair yang didasarkan pada zat terlarut dengan
perbandingan tertentu antar dua pelarut yang tidak saling bercampur.
4. Berdasarkan pada perbedaan distribusi molekul-molekul komponen
diantara dua fase (fase gerak dan fase diam) yang kepolarannya berbeda.
5. Berdasarkan hokum Lambert Beer.
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
3/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 3
6.
Penentuan gugus fungsi dengan menembakkan sinar inframerah kearah
sampel.
1.3 Tujuan percobaan
1.
Mengidentifikasi senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada
Daun Kecubung (Datura metel L.).
2. Mengisolasi senyawa aktif dari daun kecubung.
3.
Melakukan penarikan senyawa metabolit sekunder berdasarkan
kepolaranya dengan cara ekstraksi cair-cair.4.
Mengetahui profil spot dan menganalisis senyawa yang terkandung
dalam ekstrak dengan menggunakan metode Kromatografi lapis Tipis
(KLT).
5.
Melakukan isolasi senyawa dengan menggunakan Kromatografi Lapis
Tipis Preparativ (KLTP).
6. Melihat kemurnian spot dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dua
dimensi
7. Mengetahui struktur kimia senyawa metabolit sekunder yang
terkandung dengan spektrofotemetri infra merah.
8.
Menentukan gugus fungsi yang dimiliki oleh daun kecubung.
9. Mengetahui cara penyarian piperin dari simplisia piperis nigri fructus
yang dilakukan dengan metode rekristalisasi dan mengetahui
kemurnian piperin hasil dari isolasi dengan metode KLT.
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
4/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 4
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Deskripsi Tanaman Kecubung (Datura metel L.)
Kedudukan taksonomi tanaman kecubung menurut Tjitrosoepomo (1994):
Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Subdivisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledoneae
Sub kelas : Sympetalae
Ordo : Solanales
Famili : Solanaceae
Genus :Datura
Spesies :Datura metel L.
Sinonim :Datura fastuosa, Linn. D. alba, Ness. D. fastuosa, Linn.
Var alba C.B.Clarke.Daturae folium, Hindu datura, Datura
sauveolens, Datura stramonium, Hyoscyamus niger, Black
Henbane, Devils Trumpet, Metel, Downy Thorn-Apple.
Nama Lokal : Kecubung (Jawa, Sunda), Kacobhung (Madura), Bemebe
(Madura), Bulutube (Gorontalo), Taruapalo(Seram),
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
5/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 5
Tampong-tampong (Bugis), Kecubu (Halmahera, Ternate),
Padura (Tidore), Karontungan, Tahuntungan (Minahasa).
Kecubung juga terdapat di Cina, Inggris, dan Belanda
Nama Melayu : Kechubung, Terung pengar, Terung pungak
Sifat khas : Pahit, pedas, menghangatkan, dan sangat beracun
Nama simplisia :Datura albaeFlos ; bunga Kecubung
Datura albaeFolium ; daun Kecubung
Kecubung berasal dari Asia dan Afrika, kemudian tersebar meluas
sampai di Amerika (Tjitrosoepomo, 1994). Tanaman ini tumbuh di dataran
rendah sampai ketinggian 800 meter di atas permukaan laut. Tumbuh di
tempat-tempat terbuka, tanah yang mengandung pasir dan tidak begitu
lembab, dengan iklim yang kering (Sugeng, 1989). Menurut Van Steeins
(1997), selain tumbuh liar di ladang-ladang, kecubung sering ditanam di
kebun halaman rumah sebagai tanaman pagar atau tanaman hias yang
berkhasiat obat.
Kecubung termasuk tumbuhan jenis perdu yang mempunyai pokok
batang kayu, keras dan tebal, bercabang banyak, tumbuh dengan tinggi
kurang dari 2 meter. Daun kecubung berwarna hijau berbentuk bulat telur,
tunggal, tipis, dan pada bagian tepinya berlekuk lekuk tajam dan letaknya
berhadap-hadapan. Ujung dan pangkal daun meruncing dan pertulangannya
menyirip (Tampubolon, 1995). Bunga kecubung tunggal menyerupai
terompet dan berwarna putih atau lembayung, panjang bunga lebih kurang
12-18 cm, bunga bergerigi 5-6 dan pendek 3-5 cm. Tangkai bunga sekitar 1-
3 cm, kelopak bunga bertajuk 5 dengan tajuk runcing. Tabung mahkota
berbentuk corong, rusuk kuat, dan tepian bertajuk 5, tajuk di mahkotai oleh
suatu runcingan. Benang sari tertancap pada ujung dari tabung mahkota dan
sebagai bingkai berambut mengecil ke bawah. Bunga mekar di malam hari,
membuka menjelang matahari tenggelam dan menutup pada saat sore hari.
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
6/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 6
Buah kecubung hampir bulat yang salah satu ujungnya didukung
oleh tangkai tandan yang pendek dan melekat kuat. Buah kecubung bagian
luarnya dihiasi duri-duri pendek dan dalamnya berisi biji-biji kecil warna
kuning kecoklatan, diameter buah ini sekitar 4-5 cm. Buah yang masih
muda berwarna hijau muda, sedangkan yang sudah tua berwarna hijau tua.
Bakal buah pada irisan membujur, bagian bawah beruang 4 dan pada
puncak beruang 2. Buah duduk pada dasar bunga yang menebal dan melebar
ditambah sisa-sisa dari kelopak.
Tanaman kecubung yang dijumpai orang, yaitu yang berbunga putih,
ada pula yang berwarna putih dengan tepian mahkota berwarna ungu dan
bunga berwarna ungu. Ada juga kecubung kecil (Datura stramonium L.)
yang berbunga kecil dan berduri hitam pada buahnya (Heyne, 1987).
Kecubung yang berbunga putih sering dianggap paling beracun dibanding
jenis kecubung lainnya yang juga mengandung zat alkaloida
(Tjitrosoepomo, 1994).
2.2
Kandungan Kimia Tanaman Kecubung (Datur a metel L.)
Tanaman kecubung mengandung zat alkaloid yang diketahui
merupakan bahan yang dapat digunakan untuk membius dan juga dapat
digunakan sebagai obat (Kartasapoetra, 1988). Semua bagian tumbuhan
kecubung dari akar, tangkai, daun, buah, bunga dan biji mengandung
senyawa alkaloid yang sudah dikenal sebagai obat bius (Dharma, 1985).
Alkaloid dalam tumbuhan kecubung terbanyak terdapat di dalam
akar dan biji dengan kadar antara 0,4-0,9%, sedangkan dalam daun dan
bunga hanya 0,2-0,3% (Sastrapradja, 1978). Menurut Heyne (1987),
kandungan alkaloid tanaman kecubung dalam masing-masing organ
bervariasi, pada daun muda 0,813 %, daun tua 0,038 % dan bunga 0,2 %.
Alkaloid merupakan senyawa bersifat basa yang mengandung satu
atau lebih atom nitrogen, biasanya dalam gabungan sebagai bagian dari
sistem siklik yang bentuknya bermacam-macam (Heyne, 1987). Sebagian
besar alkaloid merupakan kristal putih yang agak larut dalam air. Alkaloid
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
7/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 7
sering kali beracun bagi manusia dengan bahaya yang mempunyai aktivitas
fisiologi yang menonjol sehingga digunakan secara luas dalam pengobatan
(Salisbury dan Ross, 1995).
Alkaloid dalam tumbuhan kecubung terdiri dari atropin, hiosiamin
dan skopolamin. Struktur kimia masing-masing alkaloid pada tanaman
kecubung
Kandungan hiosiamin dalam daun kecubung ialah sekitar 15% dan 85%
skopolamin.
Atropin bekerja pada sistem saraf perifer, senyawa ini mempunyai
kerja merangsang dan menghambat sistem saraf pusat. Gejala keracunan
yang ditimbulkan pada pemakaian atropin adalah mulut kering, kesulitan
buang air, sakit mata dan sensitif pada cahaya (Anggara, 2003). Menurut
Wijayakusuma (1992), alkaloid atropin merupakan zat yang dapat
menimbulkan efek bius bila masuk ke dalam darah melalui saluran
pernafasan.
Skopolamin merupakan - hiosiamin yang terepoksida (atom O
membentuk segitiga dengan atom C) pada tropanol (Sastrapradja, 1978).Secara farmakologi kegunaan skopolamin berbeda dengan atropin, bahwa
senyawa ini hanya bekerja menekan sistem saraf pusat. Efek perifer
skopolamin dan atropin secara kualitatif memang sama tetapi dilihat dari
segi kuantitatif terdapat perbedaan yang cukup besar, yaitu efek
menghambat sekresi dari skopolamin lebih kuat sedangkan efek menaikkan
frekuensi jantung lebih lemah dari pada antropin (Mustchler, 1991).
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
8/68
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
9/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 9
yang berkaitan erat dengannya. Dalam tumbuhan, aglikon falvonoid
terdapat dalam bentuk struktur, karena flavonoid berupa senyawa fenol,
sehingga akan terjadi perubahan warna jika ditambahkan basa atau
amonia, jadi mudah dideteksi pada kromatogram atau dalam larutan.
Aglikon flavonoid adalah polifenol maka dari itu aglikon
flavonoid mempunyai sifat kimia fenol, yaitu bersifat agak asam
sehingga dapat larut dalam basa. Karena mempunyai sejumlah gugus
hidroksil atau suatu gula, flavonoid merupakan senyawa polar, maka
umumnya flavonoid larut cukup dalam pelarut polar seperti etanol,
metanol, butanol, aseton, air dan lain lain. Adanya gula yang terikat
pada flavonoid lebih mudah larut dalam air dan dengan demikian
campuran pelarut di atas dengan air merupakan pelarut yang lebih baik
untuk glikosida.
Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi
sehingga menunjukkan serapan pita serapan kuat pada daerah spektrum
UV dan spektrum tampak. Akhirnya, flavonoid umumnya terdapat
dalam tumbuhan, terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon
flavonoid yang mana pun mungkin saja terdapat dalam satu tumbuhan
dalam beberapa bentuk kombinasi glikosida. Flavonoid terdapat dalam
semua tumbuhan berpembuluh tetapi beberapa kelas lebih tersebar
daripada yang lainnya, flavon dan flavonol terdapat pada semesta,
sedangkan isoflavon dan biflavonol hanya terdapat pada beberapa suku
tumbuhan.
Struktur inti flavonoid
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
10/68
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
11/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 11
Saponin
Saponin adalah glikosida triterpen dan sterol dan telah terdeteksi
dalam lebih dari 90 suku tumbuhan. Saponin merupakan senyawa aktif
permukaan dan bersifat seperti sabun, serta dapat dideteksi berdasarkan
kemampuannya membentuk busa dan menghemolisis sel darah.
Pencarian saponin dalam tumbuhan telah dirangsang oleh kebutuhan
akan sumber sapogenin yang mudah diperoleh dan dapat diubah
menjadi sterol hewan yang berkhasiat.
Struktur kimia merupakan glikosida, yang bila dihidrolisis akan
menghasilkan bagian glikon (senyawa gula) dan aglikon (senyawa non
gula). Struktur aglikon saponin umumnya merupakan struktur
triterpenoid dan struktur steroid, sehingga ditinjau dari strukturnya,
saponin dapat dipilih atas saponin triterpenoid dan saponin steroid.
Reaksi pengenalan saponin didasarkan pada sifatnya yang mampu
memberikan busa pada pengocokan setelah penambahan sedikit asam
atau pada pendiaman.
2.4 Ekstraksi
Ekstraksi adalah proses penyarian zat-zat berkhasiat atau zat-zat
aktif dan bagian tumbuhan obat, hewan dan beberapa jenis ikan termasuk
biota laut. Zat-zat aktif tersebut terdapat di dalam sel, namun sel tumbuhan
dan hewan memiliki perbedaan begitu pula ketebalannya sehingga
diperlukan metode ekstraksi dan pelarut tertentu untuk mengekstraksinya(Tobo F, dkk, 2001).
Umumnya zat aktif yang terkandung dalam tumbuhan maupun
hewan lebih mudah tarut dalam pelarut organik. Proses terekstraksinya zat
aktif dimulai ketika pelarut organik menembus dinding sel dan masuk ke
dalam rongga set yang mengandung zat aktif, zat aktif akan terlarut
sehingga terjadi perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel
dan pelarut organik di luar sel, maka larutan terpekat akan berdifusi ke luar
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
12/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 12
sel, dan proses ini akan berulang terus sampai terjadi keseimbangan antara
konsentrasi zat aktif di dalam dan di luar sel (Tobo F, dkk, 2001).
Jenis-jenis ekstraksi:
1. Ekstraksi secara maserasi
Maserasi adalah cara penyaringan ynag sedehana. Maserasi
dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari
selama beberapa hari (biasanya 5 hari) pada temperatur kamar dan
terlindung dari cahaya.
Maserasi umumnya dilakukan dengan cara memasukkan
simplisia yang sudah diserbukkan dengan derajat halus tertentu
sebanyak 10 bagian ke dalam bejana maserasi yang di lengkapi dengan
pengaduk mekanik, kemudian ditambahkan 75 bagian cairan penyari,
ditutup dan dibiarkan selama 5 hari pada suhu kamar, terlindung dan
cahaya sambil berulang-ulang diaduk, seteiah 5 hari disaring ke dalam
wadah penampung, kemudian ampasnya diperas dan ditambah cairan
penyani lagi secukupnya dan diaduk kemudian disaning lagi hingga
diperoleh sari sebanyak 100 bagian. Sari yang diperoleh ditutup dan
disimpan pada tempat yang terlindung dan cahaya selama 2
hari,endapan yang diperoleh dipisahkan dan filtratnya dan dipekatkan
(Tobo F, dkk, 2001, Samulsson, 1999).
Metode maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana,
dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan
penyari, selama beberapa hari pada suhu kamar, terlindung dan cahaya.
Metode maserasi digunakan untuk menyari simplisia yang komponen
kimianya mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung
benzoin, tiraks, dan lilin.
Maserasi adalah salah satu jenismetoda ekstraksi dengan sistem
tanpa pemanasan atau dikenal dengan istilah ekstraksi dingin, jadi pada
metoda ini pelarut dan sampel tidak mengalami pemanasan sama sekali.
http://catatankimia.com/catatan/metoda-ekstraksi.htmlhttp://catatankimia.com/catatan/metoda-ekstraksi.html -
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
13/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 13
Sehingga maserasi merupakan teknik ekstraksi yang dapat digunakan
untuk senyawa yang tidak tahan panas ataupun tahan panas.
Namun biasanya maserasi digunakan untuk mengekstrak
senyawa yang tidak tahan panas (termolabil) atau senyawa yang belum
diketahui sifatnya. Karena metoda ini membutuhkan pelarut yang
banyak dan waktu yang lama.
Secara sederhana, maserasi dapat disebut metoda perendaman
karena memang proses ekstraksi dilakukan dengan hanya merendam
sample tanpa mengalami proses lain kecuali pengocokan (bila
diperlukan). Prinsip penarikan (ekstraksi) senyawa dari sample adalah
dengan adanya gerak kinetik dari pelarut, dimana pelarut akan selalu
bergerak pada suhu kamar walaupun tanpa pengocokan. Namun untuk
mempercepat proses biasanya dilakukan pengocokan secara berkala.
Kelebihan Maserasi
Maserasi dapat digunakan untuk jenis senyawa tahan panas
ataupun tidak tahan panas. Selain itu tidak diperlukan alat yang
spesifik, dapat digunakan apa saja untuk proses perendaman.
Kekurangan Maserasi
Maserasi membutuhkan waktu yang lama, biasanya paling cepat
3x24jam, disamping itu membutuhkan pelarut dalam jumlah yang
banyak.
Maserasi dapat dilakukan modifikasi, yaitu:
1.
Digesti
Digesti adalah cara maserasi dengan menggunakan
pemanasan lemah, yaitu pada suhu 400-500C. Cara maserasi ini
hanya dapat dilakukan untuk simplisia yang zat aktifnya tahan
terhadap pemanasan.
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
14/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 14
2.
Maserasi dengan Mesin Pengaduk
Penggunaan mesin pengaduk yang berputar terus-menerus,
waktu proses maserasi dapat dipersingkat menjadi 6 sampai 24 jam.
3. Remaserasi
Cairan penyari dibagi menjadi 2. Seluruh serbuk simplisia
di maserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah dienap
tuangkan dan diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari
yang kedua.
4. Maserasi Melingkar
Maserasi dapat diperbaiki dengan mengusahakan agar
cairan penyari selalu bergerak dan menyebar. Dengan cara ini
penyari selalu mengalir kembali secara berkesinambungan melalui
sebuk simplisia dan melarutkan zat aktifnya.
5.
Maserasi Melingkar Bertingkat
Pada maserasi melingkar, penyarian tidak dapat
dilaksanakan secara sempurna, karena pemindahan massa akan
berhenti bila keseimbangan telah terjadi masalah ini dapat diatasi
dengan maserasi melingkar bertingkat (M.M.B), yang akan
didapatkan :
a. Serbuk simplisia mengalami proses penyarian beberapa kali,
sesuai dengan bejana penampung.
b.
Serbuk simplisia sebelum dikeluarkan dari bejana penyari,
dilakukan penyarian dengan cairan penyari baru.
c. Hasil penyarian sebelum diuapkan digunakan dulu untuk
menyari serbuk simplisia yang baru,hingga memberikan sari
dengan kepekatan yang maksimal.
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
15/68
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
16/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 16
5.
Ekstraksi secara destilasi uap air
Destilasi dilakukan dengan cara mendidihkan sampel dalam
katel atau dengan cara mengalirkan uap jenuh (saturated or
superheated) dari katel pendidih air ke dalam katel penyulingan.
6. Ekstraksi secara infusa
Infus adalah sediaan cair yang dibuat dengan menyari simplisia
nabati dengan air pada suhu 900 C selama 15 menit.
7.
Ekstraksi CairCair
Ekstraksi cair-cair adalah suatu metode ekstraksi yang
menggunakan corong pisah sehingga biasa juga disebut dengan
ekstraksi corong pisah.
Pada ekstraksi cair-cair, zat yang diekstraksi terdapat didalam
campuran yang berbentuk cair. Ekstraksi cair-cair sering juga disebut
ekstraksi pelarut, banyak dilakukan untuk memisahkan zat seperti iod,
atau logam-logam tertentu dalam larutan air. (Yazid,. E,. 2005.)
Ekstraksi cair-cair digunakan sebagai cara untuk memperlakukan
sampel atau clean-up sampel untuk memisahkan analit-analit dari
komponen matrix yang mungkin menggangu pada saat kuantifikasi atau
deteksi analit. Disamping itu, ekstraksi pelarut juga digunakan untuk
memekatkan analit yang ada didalam sampel dalam jumlah kecil
sehingga tidak memungkinkan atau menyulitkan untuk deteksi dan
kuantifikasinya. Salah satu fasenya seringkali berupa air ataupun
pelarut yang sesuai dan fase yang lain pelarut organik seperti kloroform
atau petroleum eter. Senyawa-senyawa yang bersifat polar akan
ditemukan didalam fase air, sedangkan senyawa-senyawa yang bersifat
hidrofobik akan masuk pada pelarut anorganik. Analit yang tereksasi
kedalam pelarut.( Rohman,. A,. 2009).
Hubungan zat terlarut yang terdistribusi diantara dua pelarut
yang tidak saling bercampur dinyatakan pertama kali oleh Walter
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
17/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 17
nernst (1981) yang dikenal dengan hukum distribusi atau partisi jika
solut dilarutkan sekaligus kedalam dua pelarut yang tidak saling
bercampur, maka solut akan terdistribusi diantara kedua pelarut. Pada
saat setimbang perbandingan konsentrasi solut berharga tetap pada suhu
tetap.Hukum Nernst dalam bentuknya yang sederhana hanya berlaku
untuk larutan encer dan keadaan solut sama atau tidak mengalami
perubahan kedua dalam pelarut. Hukum ini tidak berlaku jika solut
yang terdistribusi mengalami asosiasi atau disosiasi pada fase pelarut.
(Yazid,. E,. 2005.)
Ekstraksi cair-cair umumnya dipilih bila pemisahan campuran
dengan cara destilasi tidak mungkin dilakukan contohnya karena
pembentukan azeotrop atau karena kepekaannya terhadap panas) atau
metode yg dihugunakan tidak ekonomis. Pada saat pencampuran terjadi
perpindahan massa, yaitu ekstrak meninggalkan pelarutyang pertarna
(media pembawa) dan masuk ke dalam pelarut kedua (media ekstraksi).
Syarat yang harus dipenuhi dalam ekstraksi cair cair adalah
bahan ekstraksi dan pelarut tidak boleh saling melarut. Agar terjadi
perpindahan masa yang baik pada ekstraksi harus diusahakan agar
terjadi bidang kontak yang luas mungkin di antara kedua cairan
tersebut. Untuk itu dalam proses ekstraksi terutama apabila
menggunakan corong pisah dilakukan pengocokan. Pengocokan
bertujuan agar ekstrak berkontak dengan pelarut. Didalam pengocokan
tidak boleh terlalu kuat, karena akan menyebabkan terbentuknya emulsi
yang tidak dapat lagi atau sukar sekali dipisah.
Untuk mencapai proses ekstraksi cair-cair yang baik, pelarut
yang digunakan harus memenuhi kriteria sebagai berikut (Martunus &
Helwani, 2004;2005):
1.
Kemampuan tinggi melarutkan komponen zat terlarut di dalam
campuran.
2. Kemampuan tinggi untuk diambil kembali.
3.
Perbedaan berat jenis antara ekstrak dan rafinat lebih besar.
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
18/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 18
4.
Pelarut dan larutan yang akan diekstraksi harus tidak mudah campur.
5. Tidak mudah bereaksi dengan zat yang akan diekstraksi.
6. Tidak merusak alat secara korosi.
7.
Tidak mudah terbakar, tidak beracun dan harganya relatif murah.
2.5 Pengertian Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan
campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui
kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisiscepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun
cuplikannya. KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai
selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, atau
preparatif. Kedua, dipakai untuk menjajaki system pelarut dan system
penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi
cair kinerja tinggi.
KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawasenyawa yang
sifatnya hidrofobik seperti lipidalipida dan hidrokarbon yang sukar
dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk
mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari
kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi dan isolasi
senyawa murni skala kecil. Pelarut yang dipilih untuk pengembang
disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis. Bahan lapisan
tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan pereaksi
pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat. Data yang diperoleh dari
KLT adalah nilai Rf yang berguna untuk identifikasi senyawa. Nilai Rf
untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan nilai Rf dari senyawa
standar. Nilai Rf dapat didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh
senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari
titik asal. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0.
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
19/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 19
1. PELAKSANAAN KLT
a. Fase Diam
Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan
penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30
m. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan
semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik
kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya.
Penjerap yang paling sering digunakan adalah silica dan
serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama pada
KLT adalah adsorpsi dan partisi.
b. Fase Gerak
Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi
lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu yang
diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah
campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua
pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga
pemisahan dapat terjadi secara optimal.
c. Aplikasi (Penotolan) Sampel
Untuk memperoleh roprodusibilitas, volume sampel
yang ditotolkan paling sedikit 0,5 l. Jika volume sampel yang
ditotolkan lebih besar dari 2-10 l, maka penotolan harus
dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar
totolan.
d. Pengembangan
Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya
adalah mengembangkan sampel dalam bejana kromatografi
yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase gerak. Tepi
bagian bawah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
20/68
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
21/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 21
f.
Perhitungan Nilai Rf
Gambar 6 : Perbandingan jarak bercak dan jarak tempuh eluen.
Perhitungan nilai Rf didasarkan atas rumus :
Rf= jarak yang ditempuh oleh komponenjarak yang ditempuh oleh pelarut
Nilai Rf dinyatakan hingga angka 1,0 beberapa pustaka
menyatakan nilai Rf yang baik yang menunjukkan pemisahan
yang cukup baik adalah berkisar antara 0,2-0,8.
g. Altertatif Prosedur KLT
Adanya variasi prosedur pengembangan KLT dilakukan
untuk meningkatkan resolusi, sensitifitas, kecepatan,
reprosudibilitas dan selektifitas. Beberapa pengembangan ini
meliputi KLT 2 dimensi, Pengembangan kontinyu dan
Pengembangan gradient.
KLT 2 dimensi atau KLT 2 arah ini bertujuan untuk
meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen
solute mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama,karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam asam-
asam amino. Selain itu, system 2 fase gerak yang sangat
berbeda dapat digunakan secara berurutan pada suatu campuran
sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit
yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda.
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
22/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 22
2. Penggunaan KLT
Penggunaan umum KLT adalah untuk menentukan
banyaknya komponen dalam campuran, identifikasi senyawa,
memantau berjalannya suatu reaksi, menentukan efektivitas
pemurnian, menentukan kondisi yang sesuai untuk kromatografi
kolom, serta memantau kromatografi kolom, melakukan screening
sampel untuk obat. Analisa kualitatif dengan KLT dapat dilakukan
untuk uji identifikasi senyawa baku. Parameter pada KLT yang
digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf. Analisis kuantitatif
dilakukan dengan 2 cara, yaitu mengukur bercak langsung pada
lengpeng dengan menggunakan ukuran luas atau dengan teknik
densitometry dan cara berikutnya dalaha dengan mengerok bercak
lalu menetapkan kadar senyawa yang terdapat dalam bercak dengan
metode analisis yang lain, misalnya dengan metode spektrofotometri.
Dan untuk analisis preparatif, sampel yang ditotolkan dalam
lempeng dengan lapisan yang besar lalu dikembangkan dan dideteksi
dengan cara yang nondekstruktif. Bercak yang mengandung analit
yang dituju selanjutnya dikerok dan dilakukan analisis lanjutan.
2.6 Spektrofotometri
Spektrofotometri adalah ilmu yang mempelajari tentang penggunaan
spektrofotometer. Spektriofotometer adalah alat yang terdiri dari
spektrofotometer dan fotometer. Spektofotometer adalah alat yang
digunakan untuk mengukur energi secara relative jika energi tersebut
ditransmisikan, direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang
gelombang. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spectrum dengan
panjang gelombang tertentu, dan fotometer adalah alat pengukur intensitas
cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi.
Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri
dari spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
23/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 23
spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat
pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Jadi
spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika
energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi
dari panjang gelombang. Kelebihan spektrofotometer dibandingkan
fotometer adalah panjang gelombang dari sinar putih lebih dapat terseleksi
dan ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma, grating ataupun celah
optis. Pada fotometer filter, sinar dengan panjang gelombang yang
diinginkan diperoleh dengan berbagai filter dari berbagai warna yang
mempunyai spesifikasi melewatkan trayek panjang gelombang tertentu.
Pada fotometer filter, tidak mungkin diperoleh panjang gelombang yang
benar-benar monokromatis, melainkan suatu trayek panjang gelombang 30-
40 nm. Sedangkan pada spektrofotometer, panjang gelombang yang benar-
benar terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti
prisma. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang
kontinyu, monokromator, sel pengabsorpsi untuk larutan sampel atau
blangko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorpsi antara sampel
dan blangko ataupun pembanding (Khopkar SM,1990).
1. Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis
spektroskopik yang memakai sumber REM (radiasi elektromagnetik)
ultraviolet dekat (190-380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) dengan
memakai instrumen spektrofotometer. Spektrofotometri UV-Vis
melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang
dianalisis, sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai
untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif.
Spektroskopi UV/VIS merupakan metode penting yang mapan,
andal dan akurat. Dengan menggunakan spektroskopi UV/VIS, substansi
tak dikenal dapat diidentifikasi dan konsentrasi substansi yang dikenal
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
24/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 24
dapat ditentukan. Pelarut untuk spektroskopi UV harus memiliki sifat
pelarut yang baik dan memancarkan sinar UV dalam rentang UV yang
luas.
Spektrofotometer Uv-Vis adalah alat yang digunakan untuk
mengukur transmitansi, reflektansi dan absorbsi dari cuplikan sebagai
fungsi dari panjang gelombang. Spektrofotometer sesuai dengan
namanya merupakan alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer.
Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang
gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitascahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorbsi. Jadi spektrofotometer
digunakan untuk mengukur energi cahaya secara relatif jika energi
tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi
dari panjang gelombang. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber
spektrum sinar tampak yang sinambung dan monokromatis. Sel
pengabsorbsi untuk mengukur perbedaan absorbsi antara cuplikan
dengan blanko ataupun pembanding.
Spektrofotometer Uv-Vis merupakan spektrofotometer yang
digunakan untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak.
Semua metode spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh
senyawa yang ditentukan, sinar yang digunakan adalah sinar yang
semonokromatis mungkin.
Spektrofotometri UV/Vis melibatkan energi elektronik yang
cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spetrofotometer
UV/Vis lebih banyak dpakai ntuk analisis kuantitatif dibanding
kualitatif.
Molekul-molekul yang memerlukan lebih banyak energi untuk
promosi elektron, akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih
pendek. Molekul yang memerlukan energi yang lebih sedikit akan
menyerap pada panjang gelombang yang lebih panjang. Senyawa yang
menyerap cahaya dalam daerah visible (yakni senyawa berwarna)
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
25/68
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
26/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 26
Tabel 2 : Rentang Serapan Spektrum UV-Vis Flavonoid
Keuntungan Spektrofotometer
Keuntungan dari spektrofotometer adalah yang pertama
penggunaannya luas, dapat digunakan untuk senyawa anorganik,
organik dan biokimia yang diabsorpsi di daerah ultra lembayung atau
daerah tampak. Kedua sensitivitasnya tinggi, batas deteksi untukmengabsorpsi pada jarak 10-4 sampai 10-5 M. Jarak ini dapat
diperpanjang menjadi 10-6 sampai 10-7 M dengan prosedur modifikasi
yang pasti. Ketiga selektivitasnya sedang sampai tinggi, jika panjang
gelombang dapat ditemukan dimana analit mengabsorpsi sendiri,
persiapan pemisahan menjadi tidak perlu. Keempat, ketelitiannya baik,
kesalahan relatif pada konsentrasi yang ditemui dengan tipe
spektrofotometer UV-Vis ada pada jarak dari 1% sampai 5%.
Kesalahan tersebut dapat diperkecil hingga beberapa puluh persen
dengan perlakuan yang khusus. Dan yang terakhir mudah,
spektrofotometer mengukur dengan mudah dan kinerjanya cepat.
Komponen-komponen Pada spektrofotometer
Yang pertama adalah sumber cahaya, Sebagai sumber cahaya
pada spektrofotometer, haruslah memiliki pancaran radiasi yang stabil
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
27/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 27
dan intensitasnya tinggi.Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah
tampak, ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu
pijar dengan kawat rambut terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini
mirip dengan bola lampu pijar biasa, daerah panjanggelombang ( )
adalah 3502200 nanometer (nm). sumber cahaya ini digunakan untuk
radiasi kontinyu :
Untuk daerah UV dan daerah tampak
Lampu wolfram (lampu pijar) menghasilkan
Spektrum cahaya tampak (visible)
Hal kedua yang diperlukan adalah pembaur cahaya yang
kerennya disebut monokromator yang di video memberikan sinar
pelangi, karena dari sana lah kemudian kita bisa memilih panjang
gelombang yang diinginka/diperlukan. Pada video yang diperlihatkan
sinar tampak atau untuk spektro visible, tapi untuk UV pun kerjanya
sama, hanya saja tidak akan terlihat oleh mata kita.
Hal ketiga adalah tempat sampel atau kuvet, pada praktikum
tempat meletakan kuvet ada dua karena alat yang dipakai tipe double
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
28/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 28
beam, disanalah kita menyimpan sample dan yang satu lagi untuk
blanko. Pada pengukuran di daerah sinar tampak digunakan kuvet kaca
dan daerah UV digunakan kuvet kuarsa serta kristal garam untuk daerah
IR.
Keempat adalah detektor atau pembaca cahaya yang diteruskan
oleh sampel, disini terjadi pengubahan data sinar menjadi angka yang
akan ditampilkan pada reader (komputer). Komponen lain yang nampak
penting adalah cermin-cermin dan tentunya slit (celah kecil) untuk
membuat sinar terfokus dan tidak membaur tentunya, jadi satu halpenting dalam pekerjaan dengan spektrofotometer Uv-Vis adalah harus
dihindari adanya cahaya yang masuk ke dalam alat, biasanya pada saat
menutup tenpat kuvet, karena bila ada cahaya lain otomatis jumlah
cahaya yang diukur menjadi bertambah.
Tipe Instrumen Spektrofotometer
Pada umumnya terdapat dua tipe instrumen spektrofotometer,yaitu single-beam dan double-beam. gambar Single-beam instrument
danDouble-beam instrument
1. Single-beam instrument
Single-beam instrument dapat digunakan untuk kuantitatif
dengan mengukur absorbansi pada panjang gelombang tunggal.
Single-beam instrument mempunyai beberapa keuntungan yaitu
sederhana, harganya murah, dan mengurangi biaya yang ada
merupakan keuntungan yang nyata. Beberapa instrumen
menghasilkansingle-beam instrument untuk pengukuran sinar ultra
violet dan sinar tampak. Panjang gelombang paling rendah adalah
190 sampai 210 nm dan paling tinggi adalah 800 sampai 1000 nm
(Skoog, DA, 1996).
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
29/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 29
2. Double-beam instrument
Double-beam dibuat untuk digunakan pada panjang
gelombang 190 sampai 750 nm. Double-beam instrument dimana
mempunyai dua sinar yang dibentuk oleh potongan cermin yang
berbentuk V yang disebut pemecah sinar. Sinar pertama melewati
larutan blangko dan sinar kedua secara serentak melewati sampel,
mencocokkan foto detektor yang keluar menjelaskan perbandingan
yang ditetapkan secara elektronik dan ditunjukkan oleh alat
pembaca (Skoog, DA, 1996).
2. Spektrofotometri Inframerah
Konsep radiasi inframerah diajukan pertama kali oleh Sir
Wiliam Hershel (tahun 1800) melalui percobaannya mendespersikan
radiasi matular dengan prisma. Pada daerah sesudah sinar merah
menunjukkan adanya kenaikan temperatur tertinggi yang berarti pada
daerah X radiasi tersebut banyak kalori (energy tinggi). Daerah
spektrum tersebut selanjutnya disebut inframerah.
Spektrofotometri IR sangat penting dalam kimia modern,
terutama (meskipun bukan satu-satunya) dalam daerah organik.
Spektrofotometer ini merupakan alat untuk mendeteksi gugus
fungsional, mengidentifikasi senyawa dan menganalisis campuran.
Bila sinar inframerah dilewatkan melalui cuplikan senyawa
organik, maka sejumlah frekuensi diserap sedangkan frekuensi yang
lain dilepaskan atau ditranmisikan tanpa diserap. Jika digambarkan
antara % A atau % T lawan t ,maka akan dihasilkan suatu spektrum
inframerah.
Kedudukan pita serapan dapat dinyatakan dalam satuan
frekuensi, V (det-1atau hz) atau panjang gelombang (mikrometer) atau
bilangan gelombang
(cm
-1
).
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
30/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 30
Interaksi radiasi IR dengan molekul
Radiasi IR yang dipakai untuk analisis instrumental adalah
radiasi IR yang rentang bilangan gelombangnya ( ) antara 4000
hingga 670cm-1.
Radiasi IR tersebut terbagi lagi atas dua daerah ,yaitu :
1.
Daerah gugus fungsi pada rentang () antara 4000 hingga 600cm-1
2. Daerah sidik jari pada rentang antara 1600 hingga 670 cm-1
Radiasi IR yang dipakai tersebut harus berada pada rentang
frekuensi yang sesuai dengan rentang getaran alamiah (natural
vibrations) dan molekul, supaya memperoleh informasi gugus-gugus
molekul dari zat yang dianalisis.
Bentuk dari struktur molekul juga menjadi penentu terjadinya
interaksi IR dengan molekul-molekul yang simetris, yaitu gugus
molekul atau atom mempunyai keelektronegatifan yang sama, tidak
akan diperlukan perubahan netto moment dwi kutub sehingga tidak
terjadi perbedaan muatan listrik pada kedua kutub. Dengan demikian
medan listrik IR tidak berinteraksi dengan molekul dan lebih jauh
molekul tersebut tidak akan mengalami perubahan-perubahan vibrasi
karenanya tidak menyerap radiasi IR.
8 Daerah Terpenting Yang Digunakan Pada Pemeriksaan
Pendahuluan Spectrum IR
( m ) () Ikatan yang menyababkan Absorpsi
2,7 3,3
3,03,4
3000 - 2750
33002900
Regang OH, NH
(Regang CH) - CCH, C = CH, Ar
H
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
31/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 31
3,33,7
4,24,9
7,36,1
5,96,2
6,87,7
10,015,4
30002700
24002100
19001650
16751500
14751300
1000650
( Regang Ch )CH3, CH2, CH, H
C = O
Regang C C , C N
Regang C = O ( asam, aldehida,keton,
amida, ester, anhilida
Regang C = C ( alifatik dan aromatic )
C = N
Lentur CH
Lentur C = C H , Ar H ( luar
bidang).
LINGKUP KEGUNAAN SPEKTROFOTOMETRI IR
Berdasarkan pernyataan bahwa tidak mungkin 2 senyawa
memberikan serapan fundamental radiasi IR yang sama serta tidak
mungkin juga 2 senyawa (kecuali isomer optic) memberikan spectra IR
yang sama, maka spektrofotometri IR khusus digunakan untuk tujuan
analisis kualitatif yang difokuskan pada identifikasi gugus fungsi.
Sasaran analisis kualitatif spektrofotometri IR secara umum
adalah zat-zat organik walaupun dapat yang untuk zat anorganik,
namun demikian dari yang telah diuraikan masih banyak kelemahan
analisis kualitatif dengan spektrofotometri IR,sehingga sistem optic dan
instrumennya perlu dikembangkan, saat ini telah dikenal FT-IR (fourier
transform IR) yang dapat menutup beberapa kelemahan
spektrofotometer IR yang konvensional.
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
32/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 32
INSTRUMENTASI SPEKTROFOTOMETER IR
Bagian utama dari spektrofotometer inframerah adalah
sumber cahaya inframerah monokromator dan detector. Cahaya dari
sumber dilewatkan melalui cuplikan, dipecah menjadi frekuensi-
frekuensi individunya dalam monokromator dan intensitas relative
dan frekuensi individu diukur oleh detector.
Instrumentasi spektrofotometer IR susunannya hampir sama
dengan spektrofotometer UV-VIS. Perbedaannya adalah sampel
berhadapan langsung dengan sumber radiasi.
SUMBER RADIASI
Prinsip sumber radiasi IR dipancarkan oleh padatan lembam
yang dipanaskan sampai pijar dengan aliran listrik.
3 macam sumber radiasi IR :
1.
Kawat nikhrom yang dipijar dengan aliran listrik sampai
temperature 1100 oC akan memancarkan radiasi IR akan tetapi
pancaran radiasi IR dari pijaran kawat nikhrom ini memberikan
bilangan gelombang lebih dari 5000 cm-1 dengan intensitas yang
lemah.
2.
Nernst Glower, juga sebagai hasil pijaran Zirkonium oksida yang
dijepit kedua ujungnya dengan keramik pada temperature 1200 K
2200 K
3. Global, senyawa silicon karbida yang mempunyai kehandalan
dapat dipijarkan langsung sampai temperature 1300 1500
K,sumber radiasi sangat banyak dipakai
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
33/68
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
34/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 34
2.7 Lada Putih
Lada atau merica adalah rempah-rempah berwujud biji-bijian yang
dihasilkan tanaman Piper nigrum L.Lada sangat penting dalam komponen
masakan dunia dan dikenal luas sebagai komoditi perdagangan penting
di dunia. Piperin merupakan suatu senyawa yang sangat bermanfaat dalam
kesehatan. Piperin banyak ditemukan pada simplisia yang termasuk dalam
keluarga piperaceae, yaitu pada Piperis nigrii fructus, Piperis albi fructus,
Piperis retrofracti fructus, dll. Tanaman yang termasuk dalam keluarga
piperaceae sangat banyak ditemukan hampir seluruh dataran rendah diIndonesia, karena tanaman ini tidak tahan dengan genangan air. Piperis nigri
sangatlah mudah ditemukan di seluruh daerah di Indonesia dengan harga
yang relative rendah. Pada umumnya kandungan piperin dalam piperis nigri
sebanyak 1,7- 7,4%.
Lada mengandung minyak atsiri, pinena, kariofilena, lionena,
filandrena alkaloid piperina, kavisina, piperitina, piperidina, zat pahit dan
minyak lemak. Rasa pedas disebabkan oleh resin yang disebut kavisin.
Kandungan piperine dapat merangsang cairan lambung dan air ludah. Selain
itu lada bersifat pedas, menghangatkan dan melancarkan peredaran darah
(Septiatin, Eatin, 2008).
Klasifikasi ilmiah
Kerajaan : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliophyta
Ordo : Piperales
Famili : Piperaceae
Genus :Piper
Spesies :Piper nigrum L
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
35/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 35
P. nigrum (lada) menghasilkan lada hitam dan lada putih. Lada
hitam yaitu buah lada yang belum masak dikeringkan bersama kulitnya
hingga kulit keriput dan berwarna hitam. Lada putih yang berasal dari buah
lada yang masak yang setelah diberssihkan dari kulitnya lalu dikeringkan,
hingga berwarna putih (Gembong Tjitrosoepomo, 2000).
Nama lain dari lada adalah pedes (Sunda) dan merica (Jawa). Lada
dengan nama latin; Piper Nigrum, sudah dikenal sebagai penyedap
makanan,mengatasi bau dan rasa makanan yang beraroma tak sedap, serta
pengawet daging (Septiatin, 2008).
Ada dua macam lada yang menjadi komoditi perdagangan yaitu lada
hitam dan lada putih. Lada hitam diperoleh dengan memetik buah yang
masih hijau,mengupasnya, difermentasi untuk menambah rasa lada,
kemudian dikeringkan di bawah sinar matahari, dan rasanya lebih pedas.
Sedangkan lada putih diperoleh dengan memetik biji masak merah, diremas
perlahan-lahan dan direndam dalam air, kulit dan daging buah dibuang
sebelum dikeringkan di sinar matahari(Septiatin, 2008).
Sifat Lada
Lada memiliki rasa pedas, berbau khas dan aromatik. Rasa pedas
dari buah lada hitam, 90-95% disebabkan oleh adanya komponen trans-
piperin yang ada dalam buah kering kadarnya 2-5% dan terdiri atas senyawa
asam amida piperin dan asam piperinat. Rasa pedas piperin masih ada
walaupun diencerkan 1:200000. Rasa pedas juga disebabkan oleh adanya
kavisin yang merupakan isomer basa piperin. Kandungan lain yang
menghasilkan bau aromatic adalah minyak atsiri dengaan kadar 1-2.5%
yang mengandung piperonal, eugenol, safrol, metil eugenol, dan miristissin.
Lada hitam juga mengandung monoterpen dan seskuiterpen
(Wiryowidagdo, Sumaali, 2007)
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
36/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 36
Khasiat dan Kegunaan
Penggunaan, lada digunakan sebagai stomakik, karminatif, dan
bumbu masak. Khasiat dari buah lada yaitu dapat mengobati kaki bengkak
pada ibu hamil, kolera, nyeri haid, rematik, salesma, air mani yang encer,
dan impoten(septiatin, 2008).
Efek farmakologis lada diantara lain:
1.
Kamfena merangsang timbulnya kejang.
2. Boron meluruhkan haid, merangsang keluarnya hormone androgen dan
estrogen.3. Mencegah pengeroposan tulang, menghambat prostaglandin, relaksasi
otot, menghilangkan kelelahan
4.
Merangsang semangat, calamine dan chavicine
5. Merangsang syaraf pusat calamine.
Piperin
Piperin (1piperilpiperidin ) C17H19O3N merupakan alkaloid dengan
inti piperidin. Piperin berbentuk kristal berwarna kuning dengan titik leleh
127-129,50C, merupakan basa yang tidak optis aktif, dapat larut dalam
alkohol, benzena, eter, dan sedikit larut dalam air (Anwar,dkk.1994).
Piperin terdapat dalam beberapa spesies piper dan dapat dipisahkan
baik dari lada hitam maupun lada putih perdagangan piperin juga dapat
ditemukan pada cabe jawa. Kandungan piperin biasanya berkisar antara 5-
92% (Anwar,dkk.1994).
Struktur piperin adalah sebagai berikut :
N
CO CH
HC CH
HC
O
O
CH2
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
37/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 37
Piperin merupakan amida (R-CONH2). Reaksi hidrolisis amida dapat
dilakukan baik dalam suasana asam maupun suasana basa. Dalam kedua
kondisi ini, asam dan basa berfungsi sebagai pereaksi dan bukan sebagai
katalis. Dalam suasana asam, terjadi penyelangan air terhadap amida
sedangkan dalam suasana basa terjadi penyerangan ion hidroksil terhadap
atom karbon karbonil amida.
O
O
H
HH
H
O
N
Isochavisin
O
O
H
O
N
Isopiperin
H
H
H
O
O
H
H
N
Chavisin
H
H O
O
O
H
H
H
H
O
N
Piperin
Reaksi hidrolisis amida dalam suasana basa digambarkan sebagai
berikut :
R C
O
NH2
+ -OH R C
O-
NH2
OH R C
O
O-
NH3+
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
38/68
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
39/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 39
Dua metode yang paling banyak digunakan untuk menyeleksi
tanaman yang mengandung alkaloid. Prosedur Wall meliputi ekstraksi
sekitar 20 gram bahan tanaman kering yang di refluks dengan 80%
etanol. Setelah dingin dan disaring, residu dicuci dengan 80% etanol
dan kumpulan filtrat diuapkan. Residu yang tertinggal dilarutkan
dalam air, disaring, diasamkan dengan asam klorida 1% dan alkaloid
diendapkan baik dengan pereaksi Mayer atau dengan siklotungstat.
Bila hasil test positif, maka konformasi test dilakukan dengan cara
larutan yang bersifat asam tersebut dibasakan, alkaloid diekstrak ke
dalam pelarut organik, dan kemudian alkaloid diekstrak kembali ke
dalam larutan asam. Jika larutan asam ini menghasilkan endapan
dengan pereaksi tersebut di atas, ini berarti tanaman mengandung
alkaloid. Fasa basa berair juga harus diteliti untuk menentukan adanya
alkaloid quartener(Sastrohamodjojo, 1996).
2. Isolasi
Karakter dasar berbagai alkaloid digunakan untuk
mengisolasinya. Alkaloid diambil ke dalam larutan asam berair
(umumnya asam hidroklorida, sitrat, atau tartarat) dan
komponennetral atau bersifat asam dari campuran asal dipisahkan
dengan ekstraksi pelarut. Setelah larutan berair dibasakan, maka
alkaloid diperoleh dengan ekstraksi ke dalam pelarut yang
sesuai(Sastrohamodjojo, 1996).
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
40/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 40
BAB III
METODE PERCOBAAN
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat yang digunakan
1. Tabung reaksi
2.
Cawan penguap
3.
Pipet tetes4.
Spatula
5. Batang pengaduk
6. Beaker glass
7.
Erlenmeyer
8. Gelas kimia
9. Gelas ukur
10. Mortir dan stamper
11. Penangas air
12. Wadah maserasi
13.
Vial
14. Rotari efavorator
15. Corong gelas
16.
Coroh pisah
17. Sendok tanduk
18. Statif
19. Timbangan analitik
20. Plat KLT : Silika Gel GF 254
21. Bejana KLT (Chamber) + tutup
22.
Botol semprot
23. Pipa kapiler
24. Kertas saring (Kertas Whatman)
25.
Alumunium foil
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
41/68
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
42/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 42
20.
Aquadest
21. Toluen
22. Silika gel GF 254
23.
Toluene
24.AlCl3 1%
25. Penampak bercak :
a) Uap Amonia
b) AlCl3 1%
c) FeCl3
d)
Dragenderof
e) Vanilin 1%
26.Metanol PA
27.
KOH
28.Metanol
29.Etanol
30.
Biji lada putih
3.2 Prosedur kerja
3.2.1 Penapisan Fitokimia
a. Golongan Senyawa Alkaloid
1. Serbuk simplisia dibasahi dengan 5 ml amonia.
2.
Ditambahkan 20 ml kloroform.
3. Digerus kuatkuat.
4.
Lapisan kloroform yang dihasilkan dipipet.
5.
Ditambahkan 5 ml asam klorida 2 N.
6. Dikocok kuatkuat hingga terbentuk 2 lapisan.
7. Lapisan asam dipipet.
8. Dibagi ke dalam 3 tabung reaksi.
9. Tabung reaksi 1 ditambahkan pereaksi Mayer. Bila terjadi
kekeruhan atau endapan berwarna putih, berarti di dalam
simplisia tersebut kemungkinan mengandung alkaloid.
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
43/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 43
10.
Tabung reaksi 2 ditambahkan pereksi Dragendorff. Bila
terjadi kekeruhan atau endapan jingga kecoklatan, berarti
di dalam simplisia tersebut kemungkinan mengandung
alkaloid.
11.reaksi 3 digunakan sebagai blanko sehingga tidak
ditambahkan apapun.
b. Golongan Senyawa Polifenol
1. Serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
2.
Dipanaskan, lalu disaring.
3. Filtrat yang dihasilkan ditambahkan sedikit pereaksi
besi(III)klorida. Terbentuknya warna hijau biru hitam
hingga hitam menunjukkan adanya senyawa fenolat.
c. Golongan Senyawa Tanin
1.
Serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
2.
Dipanaskan, lalu disaring.
3. Filtrat yang dihasilkan ditambahkan sedikit larutan gelatin
10%. Adanya endapan berwarna putih menandakan
adanya senyawa tanin.
d.
Golongan Senyawa Flavonoid
1. Serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
2.
Ditambahkan serbuk magnesium, lalu ditambahkan 1 ml
asam klorida.
3. Dipanaskan dan disaring. Filtrat yang dihasilkan
ditambahkan 12 ml amil alkohol.
4. Dikocok kuat kuat. Adanya senyawa flavonoid ditandai
dengan terbentuknya cincin berwarna kuning hingga
merah di sekitar tabung reaksi.
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
44/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 44
e.
Golongan Senyawa Monoterpenoid dan Seskuiterpenoid
1. Serbuk simplisia digerus dengan eter, kemudian disaring.
2. Filtratnya dimasukkan ke dalam cawan penguap. Lalu
diuapkan hingga kering.
3. Ditambahkan larutan vanilin 10% dalam asam sulfat pekat
melalui selasela dinding cawan. Adanya perubahan
warna yang terjadi menunjukkan simplisia tersebut
mengandung senyawa monoterpenoid dan
seskuiterpenoid.
f. Golongan Senyawa Steroid dan Triterpenoid
1. 12 gram serbuk simplisia digerus dengan eter, kemudian
disaring.
2. Filtrat yang dihasilkan dimasukkan ke dalam cawan
penguap, lalu diuapkan hingga kering.
3.
Ditambahkan pereaksi Liebermann Burchard pada sela
sela dinding cawan. Terjadinya warna ungu menunjukkan
adanya senyawa triterpenoid sedangkan adanya warna
hijau biru menunjukkan adanya senyawa steroid.
g. Golongan Senyawa Kuinon
1.
Serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
2. Dipanaskan, lalu disaring.
3.
Filtrat yang dihasilkan ditambahkan dengan larutan kalium
hidroksida 5%. Adanya warna kuning kemerahan
menandakan adanya senyawa kuinon dalam simplisia
tersebut.
3.2.2 Ekstraksi
1. Simplisia daun kecubung ditimbang sebanyak 250 gram.
2.
Wadah maserasi dilapisi dengan kapas secukupnya.
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
45/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 45
3.
Daun kecubung yang telah ditimbang dimasukkan kedalam
wadah maserasi.
4. Etanol ditambahkan kedalam wadah maserasi hingga
merendam simplisia daun kecubung.
5. Diaduk selama 15 menit, kemudian wadah ditutup dan
didiamkan selama 24 jam.
6. Maserat ditampung, residu ditambahkan etanol dan dilakukan
langkah kerja yang sama hingga tiga kali.
7. Maserat dirotav menggunakan alat rotasi efavorator, kemudian
diuapkan diatas waterbath hingga menjadi ekstrak kental.
8. Ekstrak kental sebanyak 10 gram dilarutkan dalam campuran
etanol dan air dengan perbandingan 80 ml : 20 ml (ekstrak air).
9.
Ekstrak air sebanyak 100 ml dimasukkan kedalam corong
pisah 250 ml dan ditambahkan dengan nheksan 100 ml.
10.Ekstrak dikocok dalam corong pisah selama 15 menit dengan
frekuensi tiga kali pengocokan dalam satu menit.
11.
Setelah dikocok campuran di diamkan sampai terbentuk dua
fase dalam corong pisah.
12.
Setelah memisah, fraksi air dan n heksan ditampung dalam
wadah terpisah (lapisan di bawah adalah fraksi air dan lapisan
yang berada di atas adalah fraksi n - heksan).
13.
Fraksi air dimasukkan kembali kedalam corong pisah lalu
ditambah n heksan 100 ml dan dilakukan pengulangan
prosedur seperti langkah 3, 4, dan 5. Prosedur terus diulang
sampai fraksi n - heksan menjadi jernih.
14.Setelah fraksi n heksan jernih, fraksi air dimasukkan ke
dalam corong pisah kembali dan ditambahkan dengan etil
asetat 100 ml.
15.Lakukan prosedur seperti langkah no 3 dan 4. Setelah memisah
fraksi air dan etil asetat ditampung dalam wadah terpisah
(fraksi etil asetat diatas dan fraksi air dibawah).
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
46/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 46
16.
Fraksi air dimasukkan kembali kedalam corong pisah lalu
ditambah etil asetat 100 ml dan dilakukan pengulangan
prosedur seperti langkah 3 dan 4 sampai fraksi etil asetat
menjadi jernih. Setelah jernih setiap fraksi disimpan di dalam
wadah terpisah.
17.Fraksi air diuapkan hingga menjadi fraksi kental.
18.Fraksi n-heksan dan fraksi etil asetat dirotav hingga volume
berkurang menjadi setengahnya.
19.Fraksi n heksan dan fraksi etil asetat yang telah di rotav di
uapkan hingga menjadi fraksi kental.
3.2.3 Kromatografi Lapis Tipis
1.
Disiapkan chamber pengembangan kromatografi lapis tipis
yang berisi larutan pengembang. Dibiarkan hingga bagian
dalam camber pengembangan jenuh dengan uap larutan
pengembangan
2.
Disiapkan lempeng kromatografi lapis tipis dengan penjerap
Silika Gel GF 254. Ukuran lempeng yang disiapkan adalah
3x10 cm
3. Ditandai batas bawah (garis awal) pada lempeng kromatografi
dengan jarak kurang lebih 1 cm dari tepi lempeng
4.
Ditutulkan larutan ekstrak pada garis awal, dibiarkan kering.
Diulangi penutulan hingga beberapa kali dan konsentrasi
ekstrak dalam tutulan diperkirakan cukup.
5.
Dimasukan lempeng kromatografi lapis tipis tersebut secara
hati-hati dan tegak lurus ke dalam tangki pengembangan yang
berisi larutan pengembang. Dipastikan bahwa garis awal tidak
terendam oleh larutan pengembang. Dibiarkan terjadi
pengembangan beberapa saat hingga larutan pengembang
mencapai batas lebih kurang dari 1 cm dari tepi atas lempeng
kromatografi.
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
47/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 47
6.
Diangkat lempeng dari tangki pengembang, dibiarkan kering
diudara terbuka. Setelah kering, diamati dibawah sinar
ultraviolet 254 nm, tandai bercak yang teramati. Setelah itu
lempeng disemprot dengan penampak bercak, amati dan tandai
bercak yang terjadi.
7. Dihitung nilai Rf dari bercak yang teramati dengan cara
mengukur jarak bercak dan dibandingkan dengan jarak rambat
larutan pengembang.
3.2.4 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
1. Dibersihkan pelat kaca dan disusun di atas alat pembuat plat
KLTP.
2.
Dibuat bubur silica gel dengan cara mencampurkan 10 gram
silica gel dengan 20 ml aquades hingga homogeny.
3. Dituangkan semua bubur silica gel ke dalam alat dan dorong
kaca hingga terkena bubur silica gel.
4.
Didiamkan lapisan silica gel hingga mengering (6-12 jam)
5. Setelah kering plat di oven terlebih dahulu sekitar 30 menit
untuk pengaktifan.
6. Plat KLTP dapat digunakan, Caranya: sejumlah fraksi
dilarutkan dalam larutan pengembang yang telah disiapkan dan
totolkan culikan secara berderet sehingga membentuk pita
sebagai garis awal pengembangan. Dikeringkan di udara
beberapa saat.
7.
Plat dimasukan kedalam chamber yang telah di jenuhkan oleh
larutan pengembang hingga tanda batas.
8. Amati spot yang terbentuk dibawah sinar UV 254 dan sinar
UV 366 nm.
9. Dikerok salah satu pita yang terbentuk dan saring hasil
kerokan dengan pelarut pengembang yang digunkanan.
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
48/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 48
3.2.5 Kromatografi Lapis Tipis Dua Dimensi
1.
Alat dan bahan yang akan digunakan disiapkan
2. Plat KLT disiapkan dengan ukuran 6x6 cm
3. Plat KLT dibuat garis untuk batas atas dan batas bawah dengan
menggunakan pensil ,untuk batas atas dibuat jarak 0,5 cm dari
sisi atas plat dan batas bawah dibuat jarak 1 cm dari sisi bawah
plat
4.
Plat KLT diberi tanda untuk tempat sampel yang akan
ditotolkan5.
Isolat hasil dari KLTP ditambahkan etil asetat sebanyak 1 ml
6. Hasil pelarutan di totolkan sekitar 0,5cm dari pojok plat KLT
dengan menggunakan pipa kapiler
7.
Plat KLT dimasukkan kedalam chamber yang berisi
pengembang Etil Asetat : Toluen (7:3) yang telah dijenuhkan
terlebih dahulu selama 15 menit
8.
Pengembangan dilakukan sampai eluen atau pelarut hampir
mencapai batas atas
9. Plat KLT dikeluarkan setelah eluen hampir mencapai batas
atas dan dibiarkan beberapa saat sampai kering
10.Kemudian plat KLT dilihat dibawah sinar UV pada panjang
gelombang 254 nm dan 366 nm
11.
Apabila pada saat dilihat pada sinar UV hanya terdapat satu
spot maka dilakukan pengembangan kembali dengan cara
memutar plat 90o
12.
Dilakukan langkah yang sama seperti pada langkah no. 3-10
3.2.6 Pengukuran Spektrofotometri UV-Vis
1.
Alat dan bahan yang akan digunakan disiapkan
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
49/68
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
50/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 50
2.
Disimpan di erlenmeyer, di tambahkan 100ml etanol dan
batu didih kemudian diaduk.
3. Dipanaskan selama 2 jam memakai bunsen dan tutup
dengan kaca arloji yang diatasnya disimpan kapas yang
sudah dibasahi, bila pelarut sudah mulai habis tambahkan
50ml etanol kembali.
4. Disaring dan filtratnya di uapkan di cawan penguap pada
penangas air.
Isolasi Piperin Dengan Metode Rekristalisasi
1. Ekstrak kental diambil dan disimpan kedalam dua buah
vial.
2. Setiap vial ditambahkan 10 ml KOH-etanolik 10 % pada
ekstrak kental sambil diaduk aduk. sampai timbul
endapan.
3. Setelah mengendap dipisahkan sari dari bagian yang tak
larut.
4. Sari yang didapat didiamkan vial 1 didiamkan di suhu
ruang sedangkan vial 2 didalam lemari pendingin selama
satu malam sampai terbentuk kristal.
7. Identifikasi Kristal
1. Kristal piperin dilarutkan dalam etanol .
2.
Ditotolkan pada plat KLT kemudian di keringkan.
3. Dielusi dalam pengembang benzene-etil asetat (2:1).
4. Dilihat spotnya di lampu UV.
5. Kristal sisa dilarutkan dengan metanol untuk diuji pada
alat sprektofotomotri pada panjang gelombang 342 nm.
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
51/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 51
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Percobaan
4.1.1 Penapisan Fitokimia
No.Golongan
Senyawa
Pereaksi Hasil
1. AlkaloidMayer
Dragendorf
(-) tidak ada endapan putih
(-) tidak terbentuk endapan
jingga coklat
2. Polifenol FeCl3 (+) biru kehitaman
3. Tannin Gelatin 1%(-) tidak terbentuk endapan
putih
4. Flavonoid Serbuk Magnesium,HCl, Amil alkohol
(+) lapisan amil alkoholberwarna kuning
5.Monoterpen dan
SeskuiterpenVanilin 10% (+) terbentuk warna ungu
6.Steroid dan
Triterpenoid
Liebermann-
Bouchard
(-) tidak terbentuk warna
hijau biru dan ungu
7. Kuinon KOH 5%(-) tidak terbentuk warna
kuning kemerahan8. Saponin HCl 2N (+) busa stabil
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
52/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 52
4.1.2 Ekstraksi
Maserasi
Hari
ke-
Volume etanol yang
ditambahkan (liter)
1 2,1
2 1,6
3 1,5
Hasil rendemen ekstrak
No. Bahan Hasil
1. Simplisia yang dipakai 250 gram
2. Ekstrak kental etanol 30 gram
Persen rendemen 12%
Ekstraksi Cair-Cair
Jenis fraksi Bobot fraksi kental % Rendemen fraksi
Nheksan 3,66 gram 36,6 %
Etil asetat 2,471 gram 24,71 %
Air 3,399 gram 33,99 %
Total 9, 53 gram 95,3 %
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
53/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 53
4.1.3 Kromotografi Lapis Tipis (KLT)
Pemilihan fraksi terbaik setelah dilihat di UV
FraksiKeterangan
N-Heksan Etil Asetat
Eter 3 : 7 EAAda spot di atas
(ketinggian) berekor
Ada spot di atas
(ketinggian)
N-Heksan 6 : 4 EA
Ada spot tidak ber ekor
tetapi numpuk pada satu
spot
Ada spot ber ekor
Toluene 3 : 7 EA Spot di tengahSpot merata bagus
tidak berekor
Replikasi
Toluene 3 : 7 EA pada fraksi EA (Etil Asetat)
Di dapatkan Rf : 2,6 / 5,1 = 0,5098
Jadi kita gunakan fraksi EA (Etil Asetat) karena fraksi ini lebih bagus.
Di lanjutkan ke metode KLTP dengan larutan pengembang yang sama
ada fraksi EA (Etil Asetat)
Di dapatkan Rf : 9 / 17,5 = 0,5142
No Fraksi Secara
Visual
UV
368 nm
UV
254 nm
Dragendorf AlCl3 FeCl3
1. EA 7:3
Toluene
Tidak
Terlihat
Ada
spot
Biru
Hijau - - -
No Fraksi Secara Visual UV366 nm UV254 nm1. EA 7:3
Toluene
Hijau memanjang Ada spot Biru Hijau
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
54/68
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
55/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 55
4 Rekristalisasi dengan KOH selama
semalam didapatkan Kristal
sebanyak
Bobot kristal :1,73 gram
Presentase kristal : 57,67%
5 Penotolan sampel Kristal dalam
etanol didapatkan ke plat KLT
dihaslkan Rf
Suhu kamar : 0,5454 (warna
hijau)
Suhu dingin : 0,5454 (warna
hijau)
Pembanding : 0,5818 (warna
hijau)
6 Perbandingan absorban kristal
suhu kamar,dingin dan
pembanding
Suhu kamar : 0,26
Suhu dingin : 0,2
Pembanding :0,193
4.2 Pembahasan
Skrining fitokimia merupakan analisis kualitatif terhadap senyawa
senyawa metabolit sekunder. Suatu ekstrak dari bahan alam terdiri atasberbagai macam metabolit sekunder yang berperan dalam aktivitas
biologisnya. Senyawasenyawa tersebut dapat diidentifikasi dengan
pereaksipereaksi yang mampu memberikan ciri khas dari setiap golongan
dari metabotit sekunder.
Senyawasenyawa yang akan diidentifikasi dengan uji pereaksi
kimia pada praktikum ini adalah senyawa alkaloid, polifenol, tannin,
flavonoid, monoterpen dan seskuiterpen, steroid dan triterpenoid, kuinon
dan saponin. Sampel yang akan di uji adalah simplisia daun kecubung
(Datura metel L.).
Pada uji alkaloid, saat penambahan pereaksi mayer dan pereaksi
dragendorf sampel yang kami uji tidak terbentuk endapan putih dan endapan
jingga coklat. Sedangkan pada literatur, daun kecubung positif mengandung
alkaloid. Hal ini mungkin dikarekan pada saat penelitian, pereaksi yang
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
56/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 56
kami gunakan kurang baik, sehingga tidak memberikan hasil yang
signifikan.
Pada uji polifenol, saat penambahan pereaksi FeCl3 memberikan
hasil perubahan warna menjadi biru hitam, yang berarti menandakan bahwa
daun kecubung positif mengandung senyawa polifenol. Hasil yang diperoleh
sesuai dengan literatur.
Identifikasi uji tannin pada daun kecubung, memberikan hasil negatif
pada saat penambahan gelatin 1% yang ditunjukkan dengan tidak adanya
endapan putih. Pada literarut yang kami peroleh, hasil yang didapat sesuai
dengan literatur.
Pada uji flavonoid, saat penambahan amil alkohol menghasilkan
cincin berwarna kuning yang menunjukkan adanya flavonoid. Hal ini
dikarenakan flavonoid termasuk dari senyawa fenol. Bila fenol direaksikan
dengan basa akan terbentuk warna yang disebabkan terjadinya sistem
konjugasi dari gugus aromatik.
Pada uji monoterpen dan seskuiterpen, saat penambahan vanilin pada
sela sela dinding cawan penguap mengalami perubahan dari warna hijau
menjadi ungu yang menandakan daun kecubung mengandung senyawa
monoterpen dan seskuiterpen. Namun pada literatur, senyawa monoterpen
dan seskuiterpen tidak terkandung di dalam daun kecubung.
Pada uji steroid dan triterpenoid digunakan pereaksi Liebermann
Butchard. Uji warna Liebermann- Burchard (LB) berguna untuk mengetahui
adanya senyawa saponin baik triterpenoid maupun steroid. Pada pengujian
yang kami lakukan, daun kecubung tidak mengandung senyawa tersebut
karena pada saat penambahan pereaksi Liebermann Butchard tidak
memberikan perubahan warna.
Pada uji kuinon, sampel larutan daun kecubung yang diberikan KOH
5% tidak memberikan warna kuning kemerahan. Hal ini menunjukkan
bahwa daun kecubung negatif mengandung senyawa kuinon.
Setelah dilakukan penapisan fitokimia, simplisia daun kecubung
yang telah diserbukkan, diekstraksi secara maserasi dengan pelarut etanol.
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
57/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 57
Pelarut yang digunakan bukan air, karena maserasi dilakukan berhari-hari
dan air merupakan media yang baik untuk pertumbuhan mikroba. Ekstraksi
dilakukan dengan cara merendam simplisia pada wadah maserasi yang
sebelumnya dilapisi dengan kapas. Pelapisan dengan kapas bertujuan supaya
tidak ada serbuk simplisia yang terbawa saat akan dilakukan penampungan
maserat.
Penambahan pelarut pada hari kesatu sebanyak 2,1 liter, pada hari
kedua sebanyak 1,6 liter dan pada hari ketiga sebanyak 1,5. Pada hari
pertama penambahan pelarut lebih banyak daripada hari kedua dan ketiga,
karena pelarut menyerap pada kapas sehingga volume lebih banyak.
Maserasi dilakukan selama tiga hari, supaya senyawa yang terdapat
pada simplisia daun kecubung dapat tertarik secara sempurna. Setelah
simplisia direndam dengan pelarut etanol dan didiamkan selama 24 jam,
maserat ditampung kemudian dilakukan rotav terhadap maserat
menggunakan alat rotasi efavorator. Perotavan dilakukan hingga ekstrak
mengalami penurunan volume, setelah volume ekstrak berkurang, ekstrak
diuapkan diatas waterbath hingga didapatkan ekstrak kental. Persen
rendemen ekstrak etanol yang didapatkan adalah 12%.
Setetah menjadi ekstrak kental. Ekstrak dari hasil maserasi dibuat
menjadi fraksi dengan cara ekstraksi cair-cair. Metode ini dipilih karena
metode dapat dilakukan dalam skala mikro maupun makro, pemisahannya
tidak memerlukan alat khusus (hanya menggunakan corong pisah), metode
bersifat sederhana, dan proses pemisahan hanya memerlukan waktu yang
relatif singkat.
Pada metode ekstraksi cair-cair, ekstraksi dilakukan dengan kontinyu
atau dengan cara bertahap. Ekstraksi cair-cair dimulai dari fase non polar ke
fase semi polar dan terakhir ke fase polar. Hal ini bertujuan agar proses
ekstraksi berjalan sempurna.Apabila pemisahan dimulai dari fase polar ke
fase semi polar kemudian ke fase non polar, maka dikhawatirkan fase semi
polar akan ditemukan pada fase polar.
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
58/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 58
Ekstrak kental diencerkan dengan pelarut yang dipakai pada saat
maserasi yaitu etanol kemudian ditambahkan dengan pelarut polar yaitu air.
Ekstrak diencerkan dengan pelarut maserasi bertujuan agar zat mudah
bercampur dengan pelarutnya yaitu air. Apabila tidak diencerkan ekstrak
kental akan susah bercampur dengan air. Setelah terbentuk ekstrak air,
ekstrak ditambahkan dengan pelarut non polar (n-heksan) kemudian
dikocok dalam corong pisah.
Hasil pemisahan umumnya akan menghasilkan dua fase yaitu fase
polar (air) dan fase nonpolar (n-heksan). Fase air umumnya berada dibawah
hal ini dikarenakan bobot jenis air lebih berat dari pada nheksan. Pada saat
pengocokan, ekstrak tidak boleh dikocok terlalu kuat. Apabila terlalu kuat
maka akan terbentuk fase tambahan yaitu fase suspensi yang mana yang
tidak dapat lagi atau sukar sekali dipisah. Selain itu pada saat pengocokan
sekali-sekali keran corong dibuka. Hal ini bertujuan agar pada saat ekstraksi
tekanan di dalam corong tidak terlalu besar. Apabila tekanan di dalam
corong terlalu besar maka corong yang digunakan akan pecah. Ekstraksi
dengan pelarut nheksan dilakukan sampai warna hasil ekstraksi menjadi
jernih. Hasil ekstraksi yang jernih menandakan bahwa semua senyawa non
polar telah tertarik kedalam n-heksan. Semua fraksi n-heksan yang telah
didapat, disatukan kedalam satu wadah.
Fraksi air hasil ekstraksi dengan n-heksan kemudian dicampurkan
dengan etil asetat 100 ml. Hal ini bertujuan agar didapatkan senyawa semi
polar dan senyawa non polar. Senyawa semi polar akan tertarik dalam fraksi
etil asetat senyawa polar akan tertarik kedalam fraksi air. Proses ekstraksi
dilakukan sampai fraksi etil asetat menjadi jernih. Setelah jernih fraksi etil
asetat dan fraksi air di masukkan dalam wadah terpisah.
Fraksi air diuapkan diatas waterbath hingga terbentuk fraksi yang
kental. Sedangkan fraksi n heksan dan etil asetat di rotav terlebih dahulu
hingga volume fraksi menjadi setengahnya sebelum diuapkan. Fraksi di
rotav terlebih dahulu agar proses penguapan tidak memakan waktu yang
lama. Setelah selesai di rotav fraksi n heksan dan etil asetat diuapkan hingga
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
59/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 59
menjadi fraksi kental. Dalam proses penguapan perlu diingat bahwa suhu
yang digunakan dalam penguapan tidak boleh terlalu tinggi karena
dikhawatirkan senyawa senyawa yang tidak tahan panas akan ikut menguap
bersama pelarut.
Setelah diuapkan dari hasil dari tiap fraksi diuapkan, ditimbang dan
dihitung persentasi rendemen fraksinya. Hasil persentase rendemen yang
didapat sebesar 36,6 % ( fraksi n heksan) 24,71 % (fraksi etil asetat) dan
33,99% (fraksi air). Total persentase rendemen fraksinya adalah 95,3% .
Rendemen adalah persentase produk yang kita hasilkan dibanding
dengan bahan baku yang terolah. Jadi ekstraksi daun kecubung dengan
menggunakan metode ekstraksi cair cair memberikan perolehan produk
fraksi yang besar.
Setelah dillakukan ekstraksi, dilakukan identifikasi daun kecubung
dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis. Kromatografi Lapis
Tipis (KLT) adalah suatu teknik yang sederhana yang banyak
digunakan,metode ini menggunakan lempeng kaca atau lembaran plastik
yang ditutupi penyerap atau lapisan tipis dan kering. Perubahan warna yang
terjadi pada KLT adalah pada saat dilihat dibawah sinar UV 254nm dan 366
nm. Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki
substansi yang ditambahkan kedalamnya agar menghasilkan pendaran
flouresensi ketika dilihat dibawah sinar UV . Sehingga pada saat dilihat
dibawah sinar UV dengan panjang gelombang 366nm, akan tampak spot.
Ketika memisahkan dua atau lebih senyawa melalui kromatografi,sangat penting untuk memilih pelarut yang benar sebagai fase gerak. Jika
terlalu lemah pelarut yang dipilih dari eluting, akan memakan waktu yang
sangat lama dan volume pelarut yang digunakan sangat besar untuk
mengelusi senyawa. Jika terlalu kuat pelarut yang dipilih dari eluting, semua
senyawa akan segera dielusi. Senyawa polar dengan mudah larut dalam
pelarut polar dan memiliki afinitas rendah untuk pelarut nonpolar. Senyawa
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
60/68
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
61/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 61
ekstrak tanaman. Pemilihan sistem pelarut yang sesuai untuk ekstrak
tanaman tertentu hanya dapat dicapai dengan menganalisa nilai Rf
senyawa pada sistem pelarut yang berbeda-beda. Dengan demikian
informasi ini dapat membantu untuk pemilihan sistem pelarut yang sesuai
untuk pemisahan senyawa lebih lanjut dari ekstrak tanaman.
Dari hasil percobaan dengan ketiga campuran eluen yang berbeda
didapatkan jarak totolan pada perbandingan eluen toluen:etil asetat = 3:7
adalah 2,6 cm sehingga Rf 0,5098. Berdasarkan literature diketahui bahwa
toluen adalah senyawa non polar dan etil asetat adalah senyawa polar,Silica yang merupakan fase diam bersifat polar.
Seharusnya, semakin rendah polaritas senyawa, semakin tinggi
afinitas untuk pelarut dan semakin besar nilai Rf. Namun pada percobaan
ini, fraksi yang bersifat non polar lebih tertarik ke fase gerak yang bersifat
paling non polar metode ini sesuai dengan prinsip like dissolve like.
Kesalahan yang terjadi pada praktikum ini disebabkan karena
beberapa hal. Diantaranya perhitungan dan pengukuran toluene dan etil
asetat yang digunakan sebagai eluen sehingga polaritas campuran berbeda.
Saat memasukkan campuran eluen, kemungkinan pelarut kurang
homogen, serta saat memasukkan pelarut ke dalam chamber kurang hati-
hati sehingga sebelum chamber ditutup pelarut ada yang menguap terlebih
dahulu. Kontaminasi dapat pula terjadi akibat pembilasan pipa kapiler
dengan etanol yang kurang sempurna sehingga mengkontaminasi fraksi
standar. Kesalahan juga dapat terjadi saat mentotolkan fraksi tidak dalam
kondisi yang benar-benar tegak sehingga terbentuk hasil noda yang
berbentuk lonjong yang seharusya bulat. Hal tersebut dapat mempengaruhi
nilai Rf yang didapatkan.
Setelah didapatkan satu spot pada pengujian KLT, dilakukan
langkah selanjutnya yaitu KLTP dengan tujuan untuk mendapatkan isolat
dari daun kecubung. KLTP dilakukan dengan pembuatan plat KLTP
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
62/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 62
terlebih dahulu. Plat KLTP yang dibuat dibuat dengan menggunakan kaca
yang berbentuk persegi dengan ukuran 20x20 cm. Bubur selulosa sebagai
fase diam dibuat dengan mencampurkan 10 gram silica gel G60 F254
dengan 20 ml aquadest. Bubur selulosa dicetak pada plat kaca, kemudian
didiamkan selama 24 jam.
Sebelum plat akan digunakan, plat diaktivasi terlebih dahulu
kedalam oven selama 30 menit pada saat yang bersamaan fase gerak yang
akan digunakan yaitu EA dan toluene dengan perbandingan 7 : 3
dijenuhkan terlebih dahulu selama 30 menit. Setelah sampel ditotolkanpada plat KLTP, plat di elusi sampai tanda batas kemudian spot yang
terbentuk diamati dibawah sinar UV 254nm dan 366nm. Spot yang
berwarna biru dipisahkan untuk diisolasi.
Tahap selanjutnya dilakukan kromatografi lapis tipis 2 dimensi
dengan tujuan untuk mengetahui dan memastikan kemurnian senyawa
yang terkandung pada isolat. Pada percobaan KLT 2 dimensi ini yang
perlu diperhatikan adalah saat melakukan penotolan ,harus serba hati-hati
jangan terlalu tebal dan jangan terlalu tipis. Penandaan pada plat KLT
mengunakan pensil dan tidak menggunakan bolpoint karena pada bolpoint
akan menganggu saat dicelupkan di fase gerak, tinta akan ikut masuk dan
menganggu pengamatan. Dari hasil percobaan pada saat dilakukan
pengembangan pertama dengan menggunakan fase geraknya EA : Toluen
( 7 : 3 ) pada plat KLT muncul 1 spot berwarna biru ketika dilihat dibawah
sinar UV-366 nm, kemudian pada proses pengembangan kedua plat KLTdi putar 90o dan setelah dielusi dengan menggunakan fase gerak EA :
Toluen ( 6 : 4 ) spot yang muncul pada pengembangan pertama terelusi
kembali pada pengembangan kedua dengan kepolaran yang berbeda dan
spot yang muncul sama seperti pada pngembangan pertama. Hal ini
menandakan bahwa kandungan senyawa yang terdapat dalam isolate telah
murni.
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
63/68
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
64/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 64
merupakan daerah gugus fungsi lentur C-H. Bilangan gelombang ()
968,27-802,39 cm-1 yang masuk kedalam rentang 1000-650 cm-1, yang
merupakan daerah gugus fungsi lentur C=C-H dan Ar-H.
Berdasarkan hasil spektrum yang didapat, dapat diinterprestasikan
bahwa daun kecubung memiliki gugus O-H, C-H, C=O, C=C dan Ar-H.
Gugus fungsi tersebut dimililiki oleh senyawa flavonoid. Senyawa
flavonoid mempunyai gugus fungsi inti C-H, C=O, C=C dan Ar-H. Hasil
spektrum yang didapatkan dari percobaan, terdapat gugus O-H. Flavonoid
dengan gugus fungsi tambahan O-H merupakan flavonol, flavonolol.Sehingga kemungkinan sampel daun kecubung mengandung senyawa
flavonol atau flavonolol.
Identifikasi Dan Isolasi Biji Lada Putih
Simplisia dapat digunakan untuk pengobatan bila simplisia tersebut
memiliki zat aktif berkhasit. Misalnya saja pada lada putih, salah satu
kandungan senyawa aktifnya adalah piperin. Piperin juga merupakan
kandungan utama dari beberapa genus Piper, misalnya Piper nigrum,
Piper cubeba, danPiperretrofractum. Piperin sering digunakan pada obat
tradisional dan juga digunakan sebagai insektisida.Piperin juga berkhasiat
sebagai antioksidan, antidiare.
Pada percobaan ini dilakukan penetapan kadar piperin dalam
simplisia, piperin yang diukur kadarnya adalah piperin dari simplisia lada
putih. Awalnya dilakukan ekstraksi biji lada putih dengan metode sokhlet
sederhana . Dalam proses soxhletasi pada percobaan ini, menggunakan
pelarut berupa etanol. Pelarut etanol digunakan untuk melarutkan zat yang
diinginkan dari dalam lada putih. Etanol digunakan karena baik piperin
maupun etanol memiliki kepolaran yang sama yaitu bersifat polar
sehingga etanol mampu melarutkan piperin sesuai dengan prinsip like
dissolved like. Dari literature diperoleh bahwa piperin merupakan senyawa
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
65/68
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
66/68
-
8/10/2019 Penafisan Fitokimia (Autosaved) 2
67/68
Identifikasi dan Isolasi Daun Kecubung Page 67
BAB V
KESIMPULAN
Dari percobaan yang kami lakukan pada simplisia daun kecubung (Datura
metelL.) disimpulkan bahwa:
1.
Senyawa metabolit sekunder yang terkandung di dalam daun kecubung
(Datura metel) ialah golongan polifenol, flavonoid, monoterpen dan
seskuiterpen, serta saponin.
2.
Maserasi merupakan metode ekstraksi dengan cara dingin.
3. Ekstraksi cair-cair dapat dilakukan pada tingkat mikro maupun makro.
4. Ekstraksi cair-cair umumnya dilakukan secara kontinyu atau bertahap.
5.
Ha