PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA (KI-3161)
STRUKTUR DAN FUNGSI BIOMOLEKUL
LABORATORIUM BIOKIMIA PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2017
Protein
Glukosa
DNA
Fosfolipid
i
PRAKTIKUMBIOKIMIA(KI-3161)STRUKTURDANFUNGSIBIOMOLEKUL
KIMIASEMESTERI2017/2018
PENANGGUNGJAWABKULIAH(KI3161)
1. Prof.FidaMadayantiW.
2. Dr.Ihsanawati
PEMIMPINPRAKTIKUM
1. Dr.RezaAditama
PETUGASLABORATORIUM
1. DiahHadiati
2. BellaYashinta
3. DadanGunawan
ii
JADWALPRAKTIKUMBIOKIMIA
Waktu KegiatandanJudulPercobaan
Mingguke-1 Penjelasanawalpraktikum1–4diLab.BiokimiaDasar
Mingguke-2 1.ReaksiUjiterhadapProteindanPemisahanProteindengancaraFraksinasi
Mingguke-3 2.PenentuanKadarProteinSecaraLowry
Mingguke-4 3.KajianStrukturFungsiProtein
Mingguke-5 4.KinetikaReaksiEnzimatis
Mingguke-6 UjianPraktikumI&Penjelasanawalpraktikum4–6diLab.BiokimiaDasar
Mingguke-7 5.ReaksiUjiKarbohidratdanReaksiUjiLipid
Mingguke-8 6.PenentuanLaktosaDalamSusu
Mingguke-9 7.PenentuanAngkaPenyabunan,NetralisasiEkivalen,danGliseroldalamMinyak
Mingguke-10 8.IsolasiDNAdariplasmiddanElektroforesisGelAgarosa
Mingguke-11 UjianPraktikumII
Mingguke-12 Akhirmasapengembaliandanpenggantianperalatan
iii
ATURANUMUMLABORATORIUMBIOKIMIAPROGRAMSTUDIKIMIAFMIPA-ITB
SelamamengikutiPraktikumBiokimia(KI-3161),pesertadiwajibkanuntuk:1.Mempersiapkandiri,dengan:
1. Menggunakanjaslabdansepatutertutupselamapraktikum2. Menyiapkanjurnal/catatanpraktikumdanlaporan3. MemahamiMaterial Safety Data Sheet (MSDS) dari bahan-bahan kimia yang akan
digunakanpadapercobaansebelummemulaipraktikum4. Membawakainlap,tissuegulung,sikattabung,sabuncucicair,dankorekapi
2.Bertanggungjawabterhadapperalatanyangdigunakan:
1. Meminjamperalatangelasyangselanjutnyadisimpandilemaripraktikum2. Mengecek ulang peralatan tambahan dan mengembalikan alat-alat yang dipinjam
harian setelah selesai melakukan praktikum. Apabila tidakmengembalikan alat padasaat itu,maka alat tersebut dianggap hilang/pecah dan dimasukkan ke dalam daftaralatyangharusdigantidiakhirsemester
3. Mengganti peralatan yang hilang/pecah di akhir semester dengan menyertakan bonpembelian
3.MenjagakebersihanruangkerjadanlingkunganLaboratorium1. Menjagakebersihanalatdanmejakerja2. Meletakkanbangkudiatasmejasecaraterbaliksetelahpraktikumselesai3. Tidakmembuangbatudidihataupadatankedalamwashbak4. Membuang sampah pada tempat yang telah disediakan, terutama tissue yang
digunakanselamapraktikum5. Membuang limbah logamberat dan limbahpelarut organik pada tempat yang sudah
disediakan6. Mematikankeranairdanapi/gassetelahselesaidigunakan7. Menanyakan hal-hal mengenai keselamatan dan keamanan kerja di lab kepada
ASISTEN,PETUGASLABatauPEMIMPINPRAKTIKUMjikaadakeraguan
iv
ATURANKHUSUSPRAKTIKUMBIOKIMIAKI-3161(StrukturdanFungsiBiomolekul)
SelamamengikutiPraktikumBiokimia(KI-3161),pesertadiwajibkanuntuk:1.Datangtepatwaktu,yaituPukul08.00(shiftPAGI)atauPukul13.00(shiftSIANG)
1. Setiap keterlambatan berakibat pengurangan nilai praktikum hingga tidak bolehmengikutipraktikum
2. Tanpajas labdanjurnalyangtelahditulis,praktikantidakdapatmengikutipercobaansaatitu
3. PengecualiandimungkinkandenganijinPemimpinPraktikum
2.Mengerjakanseluruhmodulpercobaandengantertib 1. Jikapercobaanmemerlukan tahapandanwaktuyangpanjang,masing-masingasisten
akanmembagipraktikankedalamsub-subkelompok2. Masing-masingpraktikanmencatatseluruhhasilpercobaandijurnalnya3. Setiap praktikan wajib membuat laporan yang berisi pendahuluan, hasil, dan
pembahasandandikumpulkankeasistenpadahariyangsama4. Penggunaankomputer/notebookhanyapadasaatanalisishasilpercobaan
3.Hak-hakPraktikan
1. Setiappraktikanberhakmengerjakansetiapmodulpercobaan,tetapijikaperalatandanzat-zat kimia terbatas,modulpercobaandilaksanakanolehbeberapaorangpraktikansecarabersama-sama
2. Masing-masing praktikan berhakmendapatkan penjelasanmengenai percobaan yangsedangdikerjakandariasistenataupemimpinpraktikum
3. Hasil tesawalsetiappercobaanakandikembalikankepraktikansetelahdikoreksidannilainyadicatatkedalamkartuBIRU
4. TespraktikumIyangmencakuppercobaan1–4dantesakhiryangberisimateri-materipercobaan5–8,jugaakandikembalikankepraktikan
v
DENAHLABORATORIUMBIOKIMIA
DANZONAEVAKUASIDARURAT
GambarDenahLaboratoriumBiokimiaDasar InstitutTeknologiBandungProgramStudiKimiadan
ZonaEvakuasiDaruratnya
Meja 7
Meja 8
Meja 6
Meja 5
Meja 4
Meja 3
Meja 2
Meja 1
Ruang Asisten Ruang
Analis & Gudang
EXIT
EXIT
W
E
Pintu Utama
Meja 7
Meja 8
Meja 6
Meja 5
Meja 4
Meja 3
Meja 2
Meja 1
Ruan
g K
epal
a Lab
. Bi
okim
ia
Lab.
Bio
kim
ia
Kom
puta
si Ruang Asisten
Ruang Analis & Gudang
Ruan
g A
sam
Ruang Asam
vi
PANDUANPENGGUNAAN HAZARDOUSMATERIALSIDENTIFICATIONSYSTEM
Hazardous Identification System adalah suatumetodeuntukmengidentifikasi potensi bahayasuatubahankimiadenganmenggunakankodenumerikdanwarnaberdasarkanOSHAHazardCommunication Standard. Metode yang biasa digunakan untuk mengklasifikasikan hazardterbagimenjadiduayaituNFPA704(NationalFireProtectionAssociation)danHIMS(HazardousMaterials Identification System). Prinsip dari kedua metode ini hampir sama hanya sajaterdapat perbedaan pada cara menggambarkan risiko bahaya dan penggunaan standarhazardnya. PadaNFPA704, bahayadigambarkandenganbelah ketupatberwarna sedangkanpadaHIMSdigunakanbarberwarnadankodeangkadarinolsampaiempat.
(a) (b)
GambarHazardousIdentificationSystemuntukNFPA(a)danHIMS(b) NFPAWarna biru di sebelah kiri menandakan risiko kesehatan. Warna Merah di bagian atasmerupakanketeranganmengenaitingkatmudahmenyalanyasuatubahandanwarnakuningdisebelah kuning memberikan informasi mengenai tingkat reaktivitas bahan kimia tersebut.Proteksi personal sendiri diberikan pada warna putih di bagian paling bawah. Setiap warnapadaHazardousIdentificationSystemcaraNFPAinimemilikikodenumerikyangmenunjukkantingkatan-tingkatantertentu. HIMSPadaHazardousIdentificationSystemcaraHIMS,bolehdikatakantidakterlaluberbedadenganNFPAhanyasajapenggambaranmasing-masingkategorinyadisusunberdasarkankolom-kolomberwarna.Kolompertamaadalahkolomrisikokesehatandandilanjutkandengankolomkeduayangberisikaninformasitingkatmudahmenyalanyasuatubahankimia.Kolomketigaberwarnaoranyeberisikan informasi reaktivitas dan terakhir kolomberwarnaputih berisikan informasialat kelengkapan untuk proteksi diri. Sama dengan NFPA, HIMS ini jugamenggunakan kodenumerikuntukmemberikaninformasimasing-masingkolom.
vii
KodeNumerikHazardousIdentificationSystemBiru/KesehatanKodeAngka Keterangan
0 Tidakadaresikosignifikanbagikesehatan1 Iritasiataucederaringanmungkin2 Cederasementaraatauminordapatterjadi3 Kemungkinan besar cedera kecuali dilakukan pengobatan medis
dengansegera4 Mengancam jiwa, kerusakan besar atau permanen dapat dihasilkan
darioverexposurestunggalatauberulangMerah/KemudahanmenyalaKodeAngka Keterangan
0 Bahanyangtidakakanterbakar1 Bahan yang harus dipanaskan sebelum pengapian terjadi. Termasuk
cairan,padatandanpadatansetengahmemilikititiknyaladiatas93°C2 Bahan yang harus dipanaskan atau terkena suhu lingkungan yang
tinggisebelumpengapianakanterjadi.Termasukcairanyangmemilikititiknyalapadaataudiatas38°C),tetapidibawah93°C
3 Dapat menyala hampir di semua kondisi suhu normal. Termasukcairan yangmudah terbakar dengan flash point di bawah23 °C dantitikdidihdiatas38 °C, sertacairandengan flashpointantara23 °Cdan38°C
4 Gas yangmudah terbakar, atau cairan yangmudah terbakar sangatfluktuatifdenganflashpointdibawah23°C,dantitikdidihdibawah38°C.Bahandapatmenyalasecaraspontandenganudara
Kuning/ReaktivitasKodeAngka Keterangan
0 Bahan yang biasanya stabil, bahkan di bawah kondisi api, dan tidakakanbereaksidenganair,polimerisasi,membusuk,menguap,ataudiribereaksi.Tidakeksplosif
1 Bahanyangbiasanyastabiltetapidapatmenjaditidakstabil(bereaksisendiri)padasuhutinggidantekanantertentu.Bahandapatbereaksitidak kuat air atau mengalami polimerisasi berbahaya dengan tidakadanyainhibitor
2 Bahanyangtidakstabildandapatmengalamiperubahankimiapadasuhudantekanannormaldenganrisikoledakanrendah.Bahandapatbereaksi hebat dengan air atau membentuk peroksida setelahterpaparudara
3 Bahan yangmemungkinkanmembentuk ledakan apabila bercampurdengan air sangat eksplosif apabila ada sumber inisiasi kuat. Bahan
viii
dapat terpolimerisasi, membusuk, bereaksi sendiri, atau mengalamiperubahankimialainnyapadasuhudantekanannormaldenganrisikoledakansedang
4 Bahan yang dapat segera bereaksi dengan air (eksplosif),terpolimerisasi,ataubereaksisendiripadasuhudantekanannormal
Putih/ProteksipersonalKodeAngka Keterangan
0 Bahayaminimal1 Agakberbahaya2 Cukupberbahaya3 Berbahaya4 Sangatberbahaya
GambarAlatkelengkapanproteksidiri
1
PERCOBAAN1REAKSIUJITERHADAPPROTEINDAN
PEMISAHANPROTEINDENGANCARAFRAKSINASIAMONIUMSULFAT
PENDAHULUANProteinadalahkomponenyangterdapatdiberbagaijaringanmanusia,hewan,tanaman,dandidalamsel-selmikroorganisme.Proteinmemilikifungsisebagaiarsitektursel,katalis,pengendalimetabolisme,proseskontraktil,dansenyawayangpentingdalamsistim imundan regenerasisel.Dengandemikian,proteinberkaitaneratdenganhampirsemuaaktivitasfisiologismakhlukhidup. Untukmemahami fungsi biologi suatu protein, maka terlebih dahulu harus dipelajaristrukturproteintersebut.Secara kimiawi, protein adalah suatu polimer asam amino. Hidrolisis lengkap proteinmenghasilkan campuran 20—22 macam asam amino. Struktur protein dibagi dalam empatkelas: primer, sekunder, tersier, dan kuartener. Keempat struktur protein pada dasarnyadibedakanatasjenisdanjumlahikatan/interaksikimia.Strukturprimerhanyaterdiridarisatujenisikatan,yaituikatankovalenyangmenghubungkangugusaminodankarboksilantarasamaminoataudisebutjugasebagaiikatanamida/peptida(Gambar1.2).Olehkarenaitu,strukturprimermengandunginformasiurutanasamaminoyangmenyusunsuatuprotein.
Gambar1.1.IkatanpeptidaIkatankimiayangterdapatpadastruktursekunderadalah ikatanyangterdapatpadastrukturprimer (kovalen) dan ikatan hidrogen antara oksigen karbonil dan hidrogen amida (C=O---H―N).Ikatanhidrogeniniterbentukmenurutpolayangteratursehinggamembentukstrukturyanguniksepertiα-heliksdanlembaran-β.Struktur tersier sudahmemiliki strukturyang lengkap.Padastruktur jenis ini,elemen-elemenstruktursekunderdikemaskedalambentuktertentu.Dalampengemasannya,berbagaiikatandaninteraksikimiadilibatkan,sepertiikatansulfidaantarasamaminosistein,ikatanhidrogen,interaksi ionik antar gugus fungsi yang terionisasi, interaksi hidrofobik dan hidrofilik, dankemungkinan juga terdapat ikatan kovalen koordinasi, seperti pada metaloprotein. Semuaikatan maupun interaksi-interaksi kimia berperan sebagai penstabil, di samping membentukstrukturtersier. Struktur terakhir adalah struktur kuartener yang terbentuk pada beberapa protein yangmemilikilebihdarisatusub-unit.Padastrukturkuartenerterjadiinteraksiantarstrukturtersierproteinmembentuk suatu agregat yangmemiliki fungsi biologi tertentu. Ikatan yang terlibatbiasanya non-kovalen dan kebanyakan ikatan hidrofobik antar daerah non-polar pada
2
permukaan molekul protein. Haemoglobin, sebagai contoh, terdiri dari empat rantaipolipeptida(sub-unit),α,α',βdanβ'.Seluruhsub-unitmembentukhaemoglobintetrameryangmemiliki fungsi yang lebih efektif dalam mentransport oksigen dibandingkan haemoglobinmonomer.Penambahan garam pada konsentrasi rendah dapatmeningkatkan kelarutan protein (saltingin), tetapi protein akan mengalami presipitasi garam pada konsentrasi tinggi (salting out)(GambarII.1).Garamyangbiasadigunakanadalahamoniumsulfat,sodiumsulfat,dansodiumklorida.Endapanyangterbentukdapatdilarutkankembaliproteintidakmengalamidenaturasi.
Mekanismesaltingoutdidugaterjadimelaluidehidrasiproteinakibatpenambahangaram.Iongaramdapatmenarikmolekulairyangmelarutkanproteinsehinggaproteinmenjaditidaklarut.Dalam percobaan ini akan dilakukan pemisahan protein dengan cara penambahan garamamoniumsulfatjenuh.
Gambar1.2.Kelarutankarboksihemoglobinpadaberbagaikonsentrasiion
Padapercobaaniniakandipelajaricaraidentifikasiproteindenganmemanfaatkanikatanyangkhas pada protein, yaitu ikatan peptida dengan uji biuret dan juga akan diamati pengaruhperubahan fisik, seperti suhu dan pH serta penambahan zat-zat kimia terhadap strukturprotein.Selain itu,padapercobaan ini jugaakandipelajarisalahsatucarauntukmemisahkanproteindenganmenggunakanfraksinasiamoniumsulfat.
Perhatian: Beberapa percobaan berikut melibatkan pemanasan reaksi di inkubator-air mendidih. Berhati-hatilah terhadap uap atau permukaan yang panas.
3
PERCOBAAN1.UjiBiuretBiuretdihasilkandenganmemanaskanureapadasuhu±180ºC.
Urea Biuret
Gambar1.3ReaksiyangterlibatdalamujiBiuretDalamlarutanbasa,biuretmemberikanwarnavioletdenganCuSO4.Reaksiinidisebutdenganreaksi biuret, kemudian terbentuk kompleks Cu2+ dengan gugus C=O dan N—H dari rantaipeptida dalam suasana basa. Dipeptida dan asam-asam amino (kecuali histidin, serin, dantreonin)tidakmemberikanhasilyangpositif. Bahan-bahan:
• NaOH2,5N• larutanalbumintelur(1:5)• CuSO40,01M
Prosedur:
1. Siapkan1buahtabungreaksiyangbersihdankering.Masukkan3mLlarutanalbumintelur(1:5).
2. Tambahkan1mLNaOH2,5Ndanaduk.3. Kemudian tambahkan pula setetes CuSO4 0,01 M ke dalam campuran. Aduk
campuran,jikatidaktimbulwarna,tambahkanlagisetetesatau2teteslarutanCuSO4.4. Catatpengamatananda.5. Buanglah larutan yang mengandung logam berat ke dalam wadah berlabelkan
“LimbahLogamBerat”(dilemariasam).Cucilahtabungreaksidengansabundanbilasdenganairsebanyaktigakalidankeringkan.
Pertanyaan:
1. Warnaapayangterbentuk?2. MengapaharusdihindarkanpenambahanlarutanCuSO4berlebih?3. Mengapagaramamoniummenggangguujibiuret?4. Sebutkanduamacamzatlainselainproteinyangmemberikanujibiuretpositif?
2.PengendapandenganlogamBahan-bahan:
• larutanalbumintelur(1:5)• HgCl20,2M
• Pbasetat0,2M
4
Prosedur:1. Siapkan2buahtabungreaksiyangbersihdankering,beri label:HgCl2danPb-asetat.
Masukkan3mLlarutanalbumintelur(1:5)kemasingmasingtabung. 2. Tambahkan 5 tetes larutan HgCl20,2M atau Pb-asetat 0,2M ke tabung reaksi yang
sesuai.3. Catatpengamatananda.4. Buanglah larutan yang mengandung logam berat ke dalam wadah berlabelkan
“LimbahLogamBerat”(dilemariasam).Cucilahtabungreaksidengansabundanbilasdenganairsebanyaktigakalidankeringkan.
Pertanyaan:
1. Apayangdapatandaamatidarireaksidiatas?2. TerangkanmengapaputihtelurdigunakansebagaipenawarkeracunanPbdanHg?
3.PengendapandengangaramApabilaproteinmengandunggaram-garamanorganikdalamkonsentrasitinggi,makakelarutanprotein akan berkurang sehingga mengakibatkan terjadinya proses pengendapan protein(presipitasi). Secara teori, presipitasi protein terjadi karena kemampuan ion garam untukterhidrasisehinggaberkompetisidenganmolekulproteindalammengikatair. Bahan-bahan:
• larutanalbumintelur(1:5)• larutan(NH4)2SO4• reagenMillon• reagenuntukujiBiuret
Prosedur:Jenuhkan 5 mL larutan albumin telur (1 : 5) dengan amonium sulfat. Untuk pekerjaan ini:pertama-tamatambahkansedikitgaramamoniumsulfatkedalamlarutanprotein,adukhinggamelarut.Tambahkan lagi sedikitamoniumsulfatdanaduk lagi, lakukanterussehinggagaramtidak akan larut lagi. Setelah larutan jenuh, saring dan uji kelarutan endapan di dalam air.SelanjutnyaujiendapandenganreagenMillondanujilarutanfiltratdenganreagenBiuret.Pertanyaan:Terangkanhasil-hasilyangdiperoleh!4.PengaruhpHterhadapProteinBahan-bahan:
• larutanalbumintelur(1:5)• HCl0,1M• buferasetatpH4,71M• NaOH0,1M
5
Prosedur:
Perlakuan 1 2 3 4
Larutanalbumin 9mL 9mL 9mL 9ml
BuferasetatpH4,71M - - 1mL -
HCl0,1M 1mL - - -
NaOH0,1M - 1mL - -Pertanyaan:
1. Sifatfisikproteinapakahyangmempengaruhikelarutanproteinpadapercobaanini?2. Perubahansifatkimiaapakahyangberhubungandengandenaturasitelur?
5.PemisahanproteindengancarafraksinasiamoniumsulfatAlat:• Tabungreaksi• Batangpengaduk• Gelaskimia• SentrifugaBahan:• Garamammoniumsulfat• Larutanprotein• BuffertrispH720mM• TabungselofanProsedurA.Fraksinasilarutanproteinputihtelurdenganpenambahan(NH4)2SO4jenuh
1. Siapkan5mllarutanproteinputihtelur.2. Tambahkangaramamoniumsulfathinggamencapai20%jenuh(11,4gamoniumsulfat
per100mllarutan) 3. Adukcampurandanbiarkanselamalimamenitpadatemperaturkamar 4. Lakukansentrifugasiselama15menit 5. Pindahkansupernatankedalamtabungbaru.(endapanyangterbentukdisebutdengan
fraksi0-20%ammoniumsulfatjenuh)6. Larutkanendapandengan5mlbuffertrispH7 7. Tambahkan garam ammonium sulfat ke dalam supernatant dari tahap 5 hingga
mencapai50%jenuh(18,9gammoniumsulfatper100mLlarutan) 8. Adukcampurandanbiarkanselamalimamenitpadatemperaturkamar 9. Lakukansentrifugasiselama15menit 10. Pindahkansupernatankedalamtabungbaru.(endapanyangterbentukdisebutdengan
fraksi20-50%ammoniumsulfatjenuh)11. Larutkanendapandengan5mLbuffertrispH7 12. Tambahkan garam ammonium sulfat ke dalam supernatant dari tahap 11 hingga
mencapai70%jenuh(13,7gammoniumsulfatper100mllarutan) 13. Adukcampurandanbiarkanselamalimamenitpadatemperaturkamar
6
14. Lakukansentrifugasiselama15menit 15. Pindahkansupernatankedalamtabungbaru.(endapanyangterbentukdisebutdengan
fraksi50-70%ammoniumsulfatjenuh). 16. Larutkanendapandengan5mlbuffertrispH717. Larutkan dialysis terhadap setiap fraksi ammonium sulfat yang dihasilkan dengan
menggunakanbuffertrispH7selamasatumalam B.AnalisisSDS-Page
1. LakukananalisaproteinsetiapfraksiammoniumsulfatyangdiperolehdenganmetodeSDS-Page
TUGAS
1. Lakukananalisisprofilproteinsetiapfraksiamoniumsulfat!2. Tentukanberatmolekulproteindominanpadasetiapfraksiamoniumsulfat!
TUGASPENDAHULUAN
1. GambarkanstruktursenyawakompleksantaraCu2+denganrantaipeptida2. Mengapalogamdapatmenggendapkanprotein?3. Apayangdimaksuddengansaltingindansaltingout?4. Unsur-unsurkimiaapa sajayangbiasaadadidalamprotein tetapi tidakadadidalam
lipiddankarbohidrat?5. Jelaskanapayangdimaksuddengandenaturasiprotein! 6. Jelaskan4faktoryangdapatmenyebabkanproteinterdenaturasi! 7. Jelaskanmengapagaramamoniumsulfatdapatdigunakanuntukpemurnianprotein!
DAFTARPUSTAKABollag,D.M.,Rozycki,M.D.,andEdelstein,S.J.,1996,ProteinMethods,2nded., JohnWiley&
Sons.Inc.Pub.NewYork Boyer R.F., 1993, Modern Experimental Biochemistry, 2nd ed., The Benyamin Cummings
PublishingCompany,Inc.California Harrow,B.”LaboratoryManualofBiochemistry”,Ed.V,1960Mathews, C.K., Holde, K.E. (1990). Biochemistry, the Benjamin/Cummings Publishing Co.,
RedwoodCity,USA.Stryer,L.,1998,Biochemistry,4thed,W.H.FreemanandCompany,NewYork.