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PEPTIDI (PROTEINE)PEPTIDI (PROTEINE)Polimeri costituiti da monomeri relativamente semplici: gli amminoacidi. Hanno proprietà biologiche molto varie (ad es., antibiotici, ormoni, additivi alimentari, antidolorifici, ecc.)
Gli amminoacidi sono tenuti insieme con legami ammidici; il legame ammidico viene chiamato anche legame peptidico
Gli amminoacidi che fanno parte di un peptide o di una proteina si dicono residui
polimeri costituiti da meno di 50 residui di amminoacidi; di solito non hanno una struttura tridimensionale ben definita.
polimeri costituiti da almeno 50 residui (fino a oltre 1000); hanno strutture tridimensionali ben definite, da cui dipendono le proprietà biologiche.
DEFINIZIONI
La distinzione tra proteine e peptidi è formale e di riferisce alle dimensioni:
PEPTIDI
PROTEINE
Per peptidi e proteine si definiscono:
quando unità separate di proteine sono bloccate insieme(per esempio, emoglobina, tropocollagene)
Struttura primaria
Struttura secondaria
Struttura terziaria
Struttura quaternaria
è la sequenza dei residui
si riferisce ad aspetti strutturali specifici all'interno di una molecola
è la forma tridimensionale complessiva della molecola
2
PROPRIETA' CHIMICHE DEL LEGAME PEPTIDICO
1. Il legame peptidico è piuttosto inerte. N non è né nucleofilo né basico. Perché gli elettrofilireagiscano con C=O servono condizioni drastiche
2. Il gruppo ammidico può talvolta funzionare da nucleofilo (in tal caso il centro nucleofilo è l'O).
3. Il gruppo ammidico è planare (importante per la forma tridimensionale).
CNRH
R'O
.. CNRH
R'O
+
-
PROPRIETA' BIOLOGICHE DI PEPTIDI E DI AMMINOACIDINon è necessario avere lunghe catene polimeriche per avere attività biologica
Nome n. di GABA 1 neurotrasmettitore, implicato nel controllo degli impulsi nervosiGlutammato monosodico 1 additivo alimentareAspartame 2 dolcificante artificiale (circa 100 volte più dolce del saccarosio) Penicillina 3 potente antibiotico (prodotto da alcune muffe)TRH 3 ormone che controlla il rilascio di un altro ormone (tirotrofina) ed influenza il sistema nervoso centrale.Encefaline 5 trovate nel cervello; sono peptidi coinvolti nella sensazione del doloreFalloina 7 peptide biciclico, estremamente velenoso, in funghi non commestibiliAngiotensina II 8 usato dal corpo per aumentare la pressione del sangueOssitocina 9 nonapeptide ormonale ciclico, che può essere usato per provocaare il travaglioGramicidina S 10 decapeptide ciclico, potente antibiotico
Proprietà biologicheresidui
2
3
La sequenza degli amminoacidi in molti peptidi è controllata dal codice geneticosolo 20 α-amminoacidi sono codificati dal DNA
anche così le combinazioni sono molte:
pentapeptide 205 combinazioni 3 200 000 possibili peptidi
L(S)HNH2
R
CO2H
HNH2R
CO2H
Gli α-amminoacidi naturali (tranne la glicina) sono di serie L e di configurazione S
Nome struttura abbreviazioni punto catena laterale isoelettrico pKa tipo
Alanina Ala, A 6.00 - L
Arginina Arg, R 10.76 12.5 H+
Asparagina Asn, N 5.41 - H
NH2
ON
NHNH2
OHH
NH2
OCH3
OH
NH2
OO
NH2
OH
4
Nome struttura abbreviazioni punto catena laterale isoelettrico pKa tipo
Acido aspartico Asp, D 2.77 3.9 H-
Cisteina Cys, C 5.07 9.3 H-
Acido glutammico Glu, E 3.22 4.3 H-
Glutammina Gln, Q 5.65 - H
Glicina Gly, G 5.97 -
NH2
O
OHOH
NH2
OSH OH
NH2
OO
OHOH
NH2
OO
NH2OH
NH2
O
OH
His, H 7.59 6.1 HIstidina(Histidine)
NH2
ON
NOH
3
5
Nome struttura abbreviazioni punto catena laterale isoelettrico pKa tipo
Isoleucina Ile, I 6.02 - L
NH2
O
OH
Leucina Leu, L 5.98 - L
Lisina Lys, K 9.74 10.5 H+
Metionina Met, M 5.74 - L
NH2
O
OH
NH2
ONH2
OH
NH2
OSOH
Fenilalanina(Phenylalanine)
Phe, F 5.48 - L
Prolina Pro, P 6.30 - L
NH2
O
OH
N
O
OH
H
6
Nome struttura abbreviazioni punto catena laterale isoelettrico pKa tipo
Serina Ser, S 5.68 - -
Treonina Thr, T 5.60 - -
Triptofano Trp, W 5.89 - L
Tirosina Tyr, Y 5.66 9.1 L
Valina Val, V 5.96 - L
H = idrofilo; L = lipofilo (idrofobo)
NH2
OH
O
OH
NH2
OH O
OH
NH2
O
NH
OH
NH2
O
OHOH
NH2
O
OH
4
7
Amminoacidi "non usuali"Moltissimi amminoacidi presenti in natura non sono codificati dal DNA. Sono meno abbondanti di quelli codificati
Catene laterali insoliteesempi:
ON
ClH
NH2
CO2HHN
S
HCO2H
HNH
H CO2H
HCHO2CH2 C CH CH2 C
NH2
CO2H
H
Ornitina Lisinapresente in molti peptidi naturali (antibiotico)
CH2CH2CH2 CH2 CNH2
CO2H
HNH2NH2 CH2CH2 CH2 CNH2
CO2H
H
Idrossiprolina Prolinacostituente principale del collagene
NH
CO2H
HOH
NH
CO2H
H
β-amminoacidi
esempi:NH2
CO2H NH2CO2H
8
γ-amminoacidi
esempi:GABA
acido 4-amminobutanoicoentra nella trasmissione degli impulsi nervosi
NH2 CO2H CO2H
NH2
OH
D-amminoacidi
D-Phe D-Val D-Pro
CCO2H
NH2
HCH2 CCO2H
NH2
HCHCH3
CH3NH
H
CO2H
sono sintetizzati da diversi organismi e sono importanti costituenti di antibiotici
altri+ -
Betaina Glicina
N CH2 CO2
CH3
CH3
CH3 NH2 CH2 CO2H
agente metilante, entra nella biosintesi della metionina
esempi:
esempi:
5
9
CLASSIFICAZIONE E PROPRIETA' FISICHE DEGLI α-AMMINOACIDIGli amminoacidi vengono classificati, a seconda della natura della catena laterale, in:
Amminoacidi "acidi“
Amminoacidi "basici“
Amminoacidi "neutri"polari
non polari
contengono nella catena laterale un altro gruppo -CO2H
contengono nella catena laterale un altro gruppo -NH2
contengono nella catena laterale un eteroatomo
la catena laterale è idrocarburica
Gli α-aminoacidi naturali sono composti solidi cristallini, alto-fondenti, solubili in acqua
Le proprietà fisiche sono diverse da quelle di acidi o ammine con lo stesso numero di atomi di C
RCO2H pKa ~ 5 RNH2 pKb ~ 4 NH2 CHR
CO2H pKa ~ 10pKb ~ 12 ?
Allo stato solido gli α-amminoacidi sono "ioni dipolari" (zwitterioni)
H3N C
R
CO2
H
-+
Il centro acido è -NH3+, il centro basico è -CO2
-
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IN SOLUZIONE ACQUOSA LA STRUTTURA PREVALENTE DIPENDE DAL pHIn soluzione acquosa -NH3
+ è più forte come acido di quanto -CO2- sia forte come base
Come risultato della differenza di forza tra il centro acido ed il centro basico, UNA SOLUZIONE ACQUOSA DI ALANINA (amminoacido neutro non polare) CONTIENE PIU' ANIONI CHE CATIONI
A pH 7 l'alanina ha una carica globale negativa.
+ H2O
-
H3O++
carica globale negativaacido(più forte)
base(più debole)
si comportada base
-+
H3N C
R
CO2
H NH2 C
R
CO2
H
Per tornare allo ione dipolare bisogna aggiungere H3O+
A pH 6 l'alanina ha una carica globale nulla.
carica globale nulla
H3N C
R
CO2
H
-+
+ H2O
-
H3O++NH2 C
R
CO2
H
6
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Si definisce PUNTO ISOELETTRICO quel valore di pH al quale l'amminoacido esiste in prevalenza come ione dipolare (complessivamente neutro). Al punto isoelettrico la concentrazione della forma cationica e di quella anionica sono uguali (e molto basse).
NH2 C
CH3
CO2HH
L’alanina NON E’ MAI così
H3N C
R
CO2
H
-+
L’alanina è così allo stato solido e al punto isoelettrico
Per un amminoacido "neutro" il punto isoelettrico (che dipende soprattutti dai valori del pKa di NH3
+ e del pKb di -CO2-) è attorno a 5.5-6.0.
-
OH-
H+
OH-
H+
prevalente a prevalente a prevalente apH = pIpH > pI pH < pI
NH2 C
R
CO2
H C
R
CO2HH
-+
H3N C
R
CO2
H H3N+
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Ogni amminoacido ha un punto isoelettrico diverso
In un amminoacido "acido" c'è un altro gruppo (il secondo carbossile) che reagisce con l'acqua (è il centro acido più forte)
+ H2O
-
H3O++
carica globale negativaacido(più debole)
base(più debole)
si comportada base
-+
-
+
acido(più forte)
H3N C
CH2
CO2
H
CH2 CO2H
CO2
H
CH2 CH2 CO2
H3N C
Una soluzione acquosa di un amminoacido "acido" è decisamente acida:
Per portare un amminoacido "acido" al punto isoelettrico E' NECESSARIA UNA CONCENTRAZIONE DI H3O+ MAGGIORE che per un amminoacido "neutro".
Il punto isoelettrico di amminoacidi "acidi" è ~ pH 3.
7
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+ H2O
-
OH-+
carica globale positivaacido(più debole)
base(più debole)
si comportada acido
-+ +
base(più forte)
+H3N C
CH2
CO2
H
CH2 CH2 CH2 NH2
CO2
H
CH2 CH2
H3N C
CH2 CH2 NH3
Per neutralizzare un amminoacido "basico" e portarlo al punto isoelettrico BISOGNA AGGIUNGERE IONI OH-.
Il punto isoelettrico di amminoacidi "basici" è nell'intervallo 9-10 di pH.
In un amminoacido "basico" c'è un altro gruppo (il secondo gruppo amminico) che reagisce con l'acqua (è il centro basico più forte)
Una soluzione acquosa di un amminoacido “basico" è decisamente basica
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TITOLAZIONE DELLA GLICINA
+ H2OK1
+ H3O++CH2 CO2H3N
+ -CH2 CO2HH3N
Quando sono stati aggiunti 0.5 equivalenti di OH-
K1 = [H3O+]
K1 = = 10-2.4
[ ]+
CH2 CO2HH3N
[H3O+] [ ]CH2 CO2H3N+ -
pKa1 = 2.35
Aggiungendo altro OH-:
+ H2OK2
+ H3O+CH2 CO2NH2CH2 CO2H3N+ - -
Quando sono stati aggiunti 1.5 equivalenti di OH- K2 = [H3O+]
[H3O+] [ ]K1 = = 10-9.78 pKa2 = 9.78
[ ]
-
+CH2 CO2H3N
-CH2 CO2NH2
al punto isoelettrico [ ] =- +[ ]CH2 CO2HH3NCH2 CO2NH2
specie prevalente CH2 CO2H3N+ -
8
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[H3O+] [ ]
=x 10-2.4
10-9.78[ ]
-+CH2 CO2H3N
-
Dal primo equilibrio[ ]
[H3O+] CH2 CO2H3N
+ -[ ]
Dal secondo equilibrio =CH2 CO2NH2
CH2 CO2HH3N
[H3O+] [ ]x 10-2.4
10-9.78
CH2 CO2NH2-[ ]CH2 CO2HH3N
[H3O+] =
=[H3O+] 2 10-12.2
CH2 CO2NH2-[ ]
[ ]CH2 CO2HH3N+
al punto isoelettrico [H3O+] = 10-12.2
Per gli amminoacidi "neutri" il valore del punto isoelettrico è determinato dall'effetto induttivo del gruppo R
il fenile ha effetto -I aumenta l'acidità, diminuisce la basicità
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Curva di titolazione dell’acido glutammico (amminoacido “acido”)
Confronto fra le curve di titolazione di glicina e fenilalanina
+H3N C
CH2
CO2HH
CH2 CO2H
acido glutammico
pKa=9.67
pKa=2.19
pKa=4.25
pI =pKa1 + pKa2
2=
22.19 + 4.25
= 26.44
= 3.22
9
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Curva di titolazione della lisina(amminoacido “basico”) +
+H3N C
CH2
CO2HH
CH2 CH2 CH2 NH3
lisinapKa=8.95
pKa=2.18
pKa=10.79
pI =pKa2 + pKa3
2=
28.95 + 10.79
= 219.74
= 9.87
E’ significativo confrontare la carica complessiva dei quattro amminoacidi a pH diversi
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IDROFILICITA'/LIPOFILICITA'
La catena laterale degli amminoacidi ne influenza la solubilità
Il fatto che tutti gli amminoacidi allo stato solido esistano come ioni dipolari li rende più solubilinei solventi polari che in quelli non polari.
Amminoacidi (e peptidi) di solito sono solubili in acqua, ma spesso si sciolgono con difficoltànei solventi organicile solubilità relative nei diversi solventi dipendono dalla natura della catena laterale
in H2O (polare protico) Ser > Gly > Phe
in CHCl3 (poco polare) Gly ~ Ser ~ Phe
in benzene (non polare) Phe > Gly > Ser
Gli amminoacidi "acidi", "basici" o "neutri polari" in grado di formare legami idrogeno si dicono IDROFILI ed hanno elevata solubilità in acqua. Gli amminoacidi "neutri" si dicono LIPOFILI (o IDROFOBI) e preferiscono mezzi non polari.
Le proprietà fisiche degli amminoacidi sono determinate da tre fattori principali:
- la carica complessiva ad un dato pH- il pH al quale c'è carica complessiva zero (pI) - l'idrofilicità o la lipofilicità delle catene laterali.
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SINTESI DI α-AMMINOACIDIAmminazione di α-alogenoacidi1.
P/Br2 NH3
in eccesso- NH4
+CH3CH2 CO2H CH3CH CO2HBr
CH3CH CO2
NH2
E’ il metodo più semplice, ma il MENO UTILE in pratica, perché l’amminoacido prodotto è ancora nucleofilo e può reagire con il bromoacido.
CH3CH CO2HBr
CH3CH CO2
NH2
- NH4+
+
CH3CH CO2
NHCH3CH CO2
- NH4+
- NH4+Br-
Prodotto indesiderato.
Si abbassano le rese e si deve separare
utile solo per preparare industrialmente la glicina
2. Sintesi di Gabriel
N
O
O
RCH
CO2CH3
H2O, H+O
O
OHOH+
+H3N
RCH CO2H
KBr
N
O
O
- K+ + R CH CO2CH3
Br
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Alchilazione di derivati dell'estere malonico3.
CO2CH3
CH2
CO2CH3
1) CH3ONa
2) Br2
CO2CH3
CH
CO2CH3
Br
NH3
NH4Br
in eccessoCO2CH3
CH
CO2CH3
NH2
PhCH2OCOClCO2CH3
CH
CO2CH3
NHC
OCH2
1) CH3ONa
2)
CO2CH3
C
CO2CH3
NHC
OCH2 R H+ Δ
CO2HCHNH3
R
+
CO2RX
CO2HC
CO2H
H3N RC
OCH2
OH
+
in alternativa:
2)
CO2CH3
CH
CO2CH3
Br + N
O
O
- K+ N
O
O
CO2CH3
CHCO2CH3
1) CH3ONa N
O
O
CO2CH3
CCO2CH3
R
H+
H2OCO2HCH
NH3
R
+
+ CH3OH +CO2H
CO2H
RX
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Sintesi di Strecker4.
NH3..
H2O
:CN-
2) H+ H+H2O
+
+R H
OR CH NH2
OH
R H
NHR CH C
NH2
N R CH CO2HNH3
Tutti i metodi precedenti portano a miscele racemiche
RISOLUZIONE DI MISCELE RACEMICHE DEGLI α-AMMINOACIDI
1) Metodi chimici
Qualche volta è possibile la formazione di sali con un controione chirale, che può precipitarepreferenzialmente con l'amminoacido D o con quello L.
N-acetil-(±)-amminoacido + base otticamente attiva sali diastereomeri si separano e si
aggiunge acidoCH3 CH3
H
OCH2SO3H
li amminoacidi basici possono essere risolti direttamente, usando l'acido (1S)-10-canforsolfonico
Non ci sono regole per poter prevedere quale enantiomero dia il sale che precipita, né le condizioni necessarie perché la cristallizzazione avvenga. bisogna operare per tentativi.
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2) Metodi enzimaticiN-acetil-(±)-amminoacido + acilasi
N-acetil-D-amminoacido
solubile in acqua
insolubile in acquada rene di maiale
L-amminoacido+
Se occorre anche l'amminoacido D, si recupera per idrolisi
3) HPLC chirale (metodo analitico)
Con un gruppo chirale legato alla fase stazionaria diventa possibile separare glienantiomeri. Sono disponibili colonne HPLC chirali che usano come componenti chirali della fase stazionaria carboidrati o proteine.Le fasi stazionarie chirali piùusate sono quelle con derivati di amminoacidi legatiad un supporto di silice.
O
O
OEtSi
NH O
ONO2
NO2
H
fase stazionaria chiraledi Pirkle
12
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SINTESI ASIMMETRICA
1) Uso di reagenti chirali
Sono disponibili reagenti ossidanti chirali, reagenti riducenti chirali e catalizzatori chirali
Esempio:
PO
PO
..
..
(R,R)-Dipamp
1) [Rh(COD)Cl]2/NaBF4
2) H2
COD =
RhH(R,R-Dipamp)
H2
[RhH(R,R)Dipamp] resa 100%e.e. 96%
(1972)N CO2H
O
HN CO2H
O
H
H
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2. Uso di ausiliari chirali
Nel composto di partenza c'è un gruppo chirale rimovibile, che indirizza l'andamento stereochimico nella formazione del nuovo centro chirale; alla fine del processo (e dopo la purificazione) il gruppo chirale si rimuove
Esempio:
Al/Hg
CH3OCH2CH2OCH3
riduzione stereospecificasulla faccia inferiore
1) H2/Pd
2) OH-+
-
1) HNO22) LiAlH4
NN
O
RO
H H CH3R OR'O
O
NN
O
RO
H H CH3
HH
NNH2
OH
CH3HH
NH
OH
CH3HH NH2 C
RO
H
O
13
25
3. Sintesi chirale
Si parte da materiale otticamente attivo, il cui centro chirale viene poi incorporato nel prodotto.
Esempio:
L-Ser
1) TsCl
2) 2 PrLi
1)BF3.Et2O
2) Ni Raney
[O] HBr
Acido D-2-amminoesanoico
Resa complessiva: 24%; >99% e.e. (1984)
OH OH
O
NH2 HOH
O
NH HTs
OHNH HTs
SH SH
OHNH HTs
O
OHNH2 H
O
Ci sono molti modi per preparare un dato amminoacido: quale via scegliere in un caso specifico dipende da un'accurata considerazione della struttura da preparare e dall'esame di sintesi riportate in letteratura per composti simili.
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Esempio
L'acido γ-amminobutanoico (GABA) è un neurotrasmettitore e molti suoi derivati sono stati studiati per le loro potenzialità come farmaci. Un importante derivato, il 3-idrossi (GABOB), èanch'esso un neurotrasmettitore; l'enantiomero R ha attività biologica molto maggiore dell'S.
GABA(R)-GABOB
acido 4-ammino-3-idrossibutanoico
CO2HNH2
OHCO2HNH2
All'inizio è il GABOB è stato preparato come miscela racemica con metodi tradizionali. La risoluzione della miscela racemica è stata ottenuta per cristallizzazione del sale canforsolfonico dell'ammide.
CONH2NH2
OH
(R,S)
CH3 CH3H
OCH2SO3H
+
CH3 CH3H
OCH2SO3
-
CONH2
OHNH3
+
(R)
H2O, OH-
CO2HNH2
OH
(R)
+ CONH2NH2
OH
(S)(in soluzione)
precipitato cristallino(1977)
questo metodo ha permesso di ottenere (R)-GABOB, ma è lungo e con sprechi
14
27
Nel 1980 è stata pubblicata una sintesi chirale a partire dall'acido ascorbico (Vitamina C)
acido L-ascorbico(Vitamina C)
O
H
OHHCH2OH
OH OH
O Metodo 3: sintesi chirale
Sintesi lunga (nove passaggi) e resa bassa (~ 10%).
Un miglioramento si è avuto con la pubblicazione nel 1985 di una sequenza in tre passaggi che comprendono una riduzione enzimatica
Nel 1983 è stata pubblicata una sintesi asimmetrica
t-BuOOH/Ti(O-iPr)4
L-(+)Tartrato dietilico
1) RuO42) NH3
Resa globale 17%; 55% e.e.
OH
OOHNH2OH OH
O
Metodo 1: reagente chirale
Sintesi breve (tre passaggi), ma resa scarsa ed e.e. modesto
OC8H17
ClO O lievito di
birraOC8H17
ClOH O 1) NMe3
2) H2O/HCl OHN
OH OMe3
+
Cl-
Resa globale 45%; >95% e.e.
Metodo 1: reagente chirale
La difficoltà maggiore è stata la ricerca del β-chetoestere migliore
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A tutt'oggi il metodo migliore comporta una sintesi chirale a partire dall'acido malico (acido 2-idrossibutandioico), disponibile sia come isomero R che S, anche se la sintesi è stata fatta con l'acido S-malico, meno costoso.
Metodo 3: sintesi chirale
acido (S)-malico
(CF3CO)2O 1) NH3
2) MeOH/HCl
H+
1) LiAlH4
2) (t-BuOCO)2O
1) Zn(MnO4)2
2) HCl Resa complessiva 25%; ~ 100 % e.e.(1987)
OHO
OHO
OHOO O
OCOCF3 OHO
OO
NH2
O
OH NH
C(CH3)3
BocOO
OO
NH2
C(CH3)3
OH
OH NH2
O
Fra i molti metodi a disposizione la scelta può dipendere dall'importanza della purezza ottica (se per esempio l'enantiomero "sbagliato" è tossico) o dalla resa o dalla versatilità del metodo.
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29
CNRH
R'O
.. CNRH
R'O
+
-
Legame rigido e planare
POLIPEPTIDI
Con due amminoacidi diversi si possono avere due dipeptidi diversi, a seconda di quale gruppo carbossilico e quale gruppo amminico formino il legame peptidico
I peptidi conservano molte delle proprietà degli amminoacidi, avendo alle due estremitàun gruppo acido ed un gruppo amminico.
Le proprietà fisiche dei peptidi possono grosso modo essere determinate considerando insieme gli effetti di tutte le catene laterali, più quelli dei gruppi amminico e carbossilico alle estremità
- cariche globali tipiche a diversi pH- punti isoelettrici caratteristici- affinità specifiche per la fase acquosa e quella non acquosa
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In un peptide l’amminoacido con l’NH2 libero si chiama estremità amminica o residuo N-terminale; l’amminoacido con il gruppo –CO2H libero si chiama estremitàcarbossilica o residuo C-terminale; la catena che comprende i legami ammidici si chiama catena principale; i sostituenti R degli amminoacidi costituenti il peptide si chiamano catene laterali.
esempio: con glicina e alanina
16
31
Per convenzione i peptidi si rappresentano scrivendo la sequenza da sinistra verso destra, a partire dall'estremità con il gruppo amminico:
N N OHR
NH2
O
H
R'
O
H
R"
O
primoresiduo
secondoresiduo
terzoresiduo
residuoN-terminale
residuoC-terminale
NOMENCLATURA. Il residuo C-terminale costituisce il nome base; gli altri residui si chiamano come sostituenti (desinenza -ile).
NNH2
O
H O
OHCH3 glicilalanina
Gly-Ala
N N OHCH3
NH2
O
H O
H OSH
alanilcisteinilfenilalanina
I nomi degli amminoacidi si abbreviano con le prime tre lettere, si collegano con"-" o con "." Ala-Cys-Phe
Ala.Cys.Phe
NCH3
NH2
O
H O
OH alanilglicina
Ala-Gly
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In caso di amminoacidi sostituiti, il sostituente si può indicare di seguito alla abbreviazione del nome dell'amminoacido
GlyNH2 H2NCH2CONH2 GluMe NH2 CH
CH2
CO2HCH2 CO2CH3
Si presuppone che gli amminoacidi siano di serie L. Se sono di serie D, va indicato
D-Ala
OHCH3
NH2
O
N N OHCH3
NH2
O
H O
H OSH
D-Ala-Cys-Phe
1. Perché si estrae dalla matrice biologica, insieme ad altre migliaia di composti
2. L’analisi non solo deve identificare quali amminoacidi costituiscono il peptide, ma anche la sequenza, cioè l’ordine con cui gli amminoacido sono legati tra loro, a partire dal residuo N-terminale fino al residuo C-terminale
3. Per avere quantità di peptide sufficiente per gli studi clinici, servono quantitàmolto maggiori di quelle che si posono ottenere dalla matrice biologica.
Quando si studiano i peptidi (e le proteine) le operazioni importanti sono:
1. Purificazione ed isolamento2. Analisi degli amminoacidi e determinazione della sequenza3. Sintesi
17
33
PURIFICAZIONE ED ISOLAMENTO DEI PEPTIDI
Oltre al pI ed alla affinità per l'acqua o per i solventi organici è importante la dimensione del peptide1. DIALISI
Il piccolo peptide, però, saràdistribuito dentro e fuori la membrana semipermeabile.
il volume esterno deve essere molto grande: quando la concentrazione dentro e fuori la membrana semipermeabile èuguale, c'è molto più peptide fuori.
Quando si ha una miscela complessa, tutte le molecole al di sotto di una certa dimensione passano attraverso la membrana, tutte quelle più grandi restano nella sacca della dialisi
Con membrane semipermeabili è possibile separare molecole piccole (peptidi) da molecole grandi (proteine)
La dialisi è un metodo per una purificazione grossolana, che permette di maneggiare grandi quantità di materiale
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2. GEL FILTRATIONLa gel filtration impiega un supporto polimerico poroso. Le molecole grandi, che non entrano nei pori, vengono eluite rapidamente, mentre le molecole più piccole hanno tempi di ritenzione più lunghi.
Se la miscela di peptidi è complessa, piùgrandi delle dimensioni dei pori verranno eluitiinsieme ed insieme verranno eluiti quelli piùpiccoli Usando un intervallo di dimensioni dei pori, le molecole di dimensioni piccole entreranno in tutti i pori, quelle di dimensioni medie entreranno solo in alcuni, le molecole grandi non entreranno in nessuno
Per molecole di dimensione intermedia diventano importanti i fattori di diffusione ed i tempi di ritenzione sono approssimativamente una funzione lineare di log(MW).
Purificazione per gel filtration di una miscela con 4 peptidi di MW 5000 (A), 3000 (B), 500 (C) e 100 (D)
MW>1000 MW<1000
Colonna di gel filtration con una sola dimensione dei pori
Con pori di dimensione corrispondente a circa MW 1000 (~12Å) verranno eluitiprima A+B e poi C+D
18
35
Colonna di gel filtration con un intervallo di dimensione dei pori
I pori differiscono tra loro all’incirca di 12Å : i quattro peptidi vengono separati
Questo è un profilo tipico per una gel filtration e dà anche un’indicazione del peso molecolare dei peptidi
Con la gel filtration si ha un miglioramento della purezza del peptide ed una idea del peso molecolare, ma per isolare un peptide veramente puroservono altri metodi.
3. CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO
Se una soluzione di una miscela di peptidi viene fatta passare lungo una colonna che contiene un supporto polimerico carico, i peptidi verranno eluiti con una velocità diversa, che dipende soprattutto dalla loro carica complessiva.
La carica del polimero può essere sia positiva che negativa.
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Sn/HCl CH3I
(eccesso)
POLIMERO NO2
NO2POLIMERO NH2
NH2HNO3H2SO4
POLIMERO
POLIMERO N(CH3)3
N(CH3)3
+
+
I-
I-
cromatografia a scambio di anione
l'anione ioduro può essere sostituito da altri anioni
SO3
H2SO4 NaOH
POLIMERO
POLIMERO SO3H
SO3HPOLIMERO SO3
SO3 Na+
Na+-
-
cromatografia a scambio di cationeil catione sodio può essere sostituito da altri cationi
I peptidi carichi positivamente hanno una elevata affinità per resine anioniche e non vengono eluiti; i peptidi carichi negativamente non interagiscono con le resine anioniche e vengono eluiti rapidamente (il contrario si ha con le resine cationiche).
19
37
Per essere sicuri che tutto venga eluito in un tempo ragionevole, spesso si varia l'eluente con il tempo e questo di solito migliora anche la separazione dei componenti. Si può variare il pH o la forza ionica
A pH <9 entrambi i peptidi vengono eluiti lentamente.
Aumentando il pH entrambi vengono eluiti abbastanza rapidamente ed escono a valori di pH prossimi al loro pI
A = Ala-LysB = Ala-Lys-Ala-Lys
C = Lys-Ala-AlaD = Lys-Glu-Lys
Tra pH 3 e 10 hanno carica complessiva molto simile
D contiene più gruppi polari: la sua maggiore affinità per i solventi polari è incrementata dall’aumento della forza ionica.
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4. ELETTROFORESI
Nell'elettroforesi, una miscela di peptidi viene applicata su un supporto solido; il supporto viene permeato con una soluzione di elettrolita, in modo che possa essere applicata una differenza di potenziale.
Quando si fa passare la corrente, i peptidi carichi positivamente sono attratti verso il catodo, verso cui migrano. Invece i peptidi carichi negativamente migrano verso l'anodo.
Il supporto più semplice è una striscia di carta ed i peptidi si applicano vicino al centro della striscia. I diversi peptidi migrano con velocità diversa a seconda della loro carica complessiva e della loro resistenza al movimento: peptidi piccoli con carica elevata migrano più velocemente.
20
39
tipico elettroforetogramma da una miscela di di- e tri-peptidi, eseguito a pH 7.
I dipeptidi Phe-Phe e Lys-Glu sono elettricamente neutri e restano vicino all'origine. Più alta è la carica complessiva, più migrano i peptidi (per es., Lys-Lys > Lys-Phe), ma un aumento di dimensione riduce la mobilità (per es., Lys-Lys-Phe migra meno di Lys-Lys).
L'elettroforesi su carta è un metodo molto efficace per purificare piccole quantità di peptidi.
Elettroforesi SDS-PAGE (PolyAcrylAmide Electrophoresis)
Come supporto, invece della carta, si preparara un gel di un polimero come la poliacrilammide e la miscela di peptidi si applica ad una estremità
I gel di poliacriloammide si formano per polimerizzazione radicalica della propenammide(acrilammide).
40
R.
iniziatoreradicalico
+.
.radicale stabilizzato
.+ . R
O NH2O
NH2O
NH2O NH2
NH2
O
NH2
O
R NH2
O
R
NH2
O
R NH2
O NH2
O
NH2
O
RNH2
O n
Per dare solidità al gel si usano agenti di cross-linking. CH2
NH
NH
O
O
PAGE si può eseguire come l'elettroforesi su carta
PAGE si esegue in presenza di dodecilsolfato si sodio (SDS)- Na+CH2CH2 CH2CH2 CH2CH2 CH2CH2 CH2CH2CH2 O S O
O
OCH3
SDS (Sodium DodecylSuplhate)
SDS: è un tensioattivo e denatura i peptidi (e le proteine)circonda i peptidi (e le proteine) conferendo loro una carica complessiva negativa e
facendoli quindi migrare verso l'anodofa migrare i peptidi (e le proteine) solo in funzione del loro peso molecolare (migrano
più rapidamente i più piccoli).
21
41
(-)
(+)
il campionesi applica qui
MigrazionePesomolecolare
Tipico elettroforetogramma SDS-PAGE; il peso molecolare si deduce dalla distanzapercorsa, per confronto con standard noti
a scala non è lineare ed è graduata in kilo-daltons (1 kD = peso molecolare 1000)
SDS-PAGE è un ottimo metodo per separare peptidi(e proteine) sulla base del solo peso molecolare e permette anche di determinare il pesomolecolareapprossimato.
5. HPLC (High Performance Liquid Chromatography)L'HPLC è una tecnica che usa supporti con elevata area superficiale e che può sopportare pressioni abbastanza elevate.
10-100 atm, l'analisi dura 10-30 min
La presenza di un solo segnale all'HPLC è criterio per la purezza del peptide- metodo analitico (< 1 mg)- fase inversa
La cromatografia a fase inversa usa una fase stazionaria NON polare ed una fase mobile polare. I peptidi idrofili vengono eluiti rapidamente, quelli lipofili hanno tempi di ritenzione più lunghi.
42
Il supporto consiste di granelli di silice ( < 10 mm), in cui i gruppi Si-OH presenti sulla superficie sono stati sililati per trattamento con RMe2SiCl.
OHOH
OH
OHOH
Si ClCH3
R
CH3
O Si(CH3)2ROSi(CH3)2R
OSiR(CH3)2
OSiR(CH3)2
OSi(CH3)2R
OO
O
OO
R = catena idrocarburica Più lungo è R, più lipofila è la colonna
campione in solvente polare
OO
O
OO O
OO
OO
OO
O
OO
OO
O
OO
OO
O
OO
OO
O
OO
OO
O
OO
OO
O
OO
OO
O
OO
-----------------------
acqua con quantità crescenti di un solvente meno polare (MeCN, MeOH, i-PrOH), a pHcostante e vicino alla neutralità.
eluente
22
43
Il campione viene iniettato (I). A questo punto inizia il gradiente del solvente. A èil peptide più idrofilo, D il più lipofilo.
HPLC tipico
44
RIVELAZIONE DEI PEPTIDI
1. METODI NON DISTRUTTIVI
Assorbimento nell'ultravioletto
Indice di rifrazione
Rotazione ottica (OR)
λmax ~ 214 nm (π π* del carbonile ammidico)
di solito si usano λ 230 o 254 nm (spalla), perché la maggior parte degli eluenti ha assorbimento significativo a 210 nm. Se ci sono sostituenti aromatici (Phe, Tyr), si usa λ = 280 nm
Quando nell'eluente è presente un composto, cambia l'indice di rifrazione (RI refractive index) del solvente. Metodo molto sensibile, non può essere usato con gradiente di solventi
La presenza di C chirali nei peptidi fa sì che questi ruotino la luce polarizzata
rivelatori OR laser, molto sensibili
I metodi non distruttivi non si possono usare per l'analisi di elettroforetogrammi
23
45
2. METODI DISTRUTTIVI
Ninidrina
O
O
O
O
O
OHOH
H2O
conferisce una colorazione caratteristica viola-porpora
+H2O CO2, H+
-H2O, H+
+
NH2 CH CO2HR
O
O
NCH
R
CO
OH
O
O
NCH
ROH
O
NH2 OC
H
R
O
O
O
+..
H2O
λmax= 570 nm
OH
O
NH2
O
O
O
OH
O
N
O
O
Solo l’N del residuo N-terminale viene incorporato nel prodotto: il saggio non permette di distringuere tra i vari amminoacidi (o peptidi)
46
Fluorescammina reagisce con qualsiasi gruppo -NH2
+ RNH2 assorbe a 390 nmriemette a 475 nm
O
O
O
ON
CO2HOHO
R
Il metodo è molto sensibile, in grado di rivelare picomoli (10-12 moli)
Cloruro di dansile reagisce con qualsiasi gruppo -NH2
+ RNH2 assorbe nell'UV
N CH3CH3
SO2Cl
N CH3CH3
SO2 NHRIl metodo è in grado di rivelare < 1 μg (10-8 moli) di qualsiasi amminoacido (o peptide)
1,2-Benzendicarbaldeide (Aldeide ftalica, OPA o-phthalaldehyde)in presenza di mercaptoetanolo, reagisce con qualsiasi gruppo -NH2
+ RNH2assorbe a 340 nmriemette a 450 nm
N R
S OHCHO
CHO
SH OH
24
47
I metodi distruttivi sono accettabili solo se si usano piccole quantità di materiale.
Se si sta usando l'elettroforesi per purificare i peptidi, si può rimuovere una sottile striscia di carta, sulla quale vengono visualizzati i peptidi
A B C D
A B C D
------------------------------
A
B
C
D
Una volta visualizzati i peptidi, si deduce la loro posizione sull'elettroforetogramma, si ritagliano le strisce contenenti i peptidi, che vengono recuperati lavandoli via con un solvente.
La purificazione di un pentapeptide incognito verrà ottenuta con più passaggi successivi, iniziando con quelli che permettono di trattare grandi quantità di materiale e passando poi a tecniche che abbiano risoluzione sempre maggiore, man mano che diminuisce la quantità di campione. Una sequenza tipica può essere:
1. Dialisi: per rimuovere le proteine2. Gel filtration: dà una purificazione significativa ed un PM approssimato3. Cromatografia a scambio ionico: permette di trattare quantità relativamente
grandi di materiale.4. HPLC in fase inversa: metodo ottimo per purificare quantità piccole di
peptidi5. Elettroforesi su carta: per controllare la purezza del peptide e, se
necessario, per isolare in piccola scala il peptide veramente puro.
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ANALISI DEI PEPTIDIL’analisi dei peptidi consiste nell’individuare gli amminoacidi presenti e nel determinare la sequenza con cui sono legati fra loro
ANALISI DEGLI AMMINOACIDI
1. Idrolisi totale dei peptidi I gruppi ammidici sono relativamente poco reattivi e possono essere idrolizzati incondizioni fortemente acide o basiche od usando enzimi specifici.
a) Idrolisi acida E' il metodo più usato per l'idrolisi totale dei peptidi allo scopo di analizzare gli amminoacidi
Condizioni standard: HCl acquoso 6M 110°C, 24 ore
La reazione si esegue di solito in un tubo di vetro sigillato, che prima di essere chiuso viene accuratamente degassato.HCl 6 M
campione di peptide
fiamma
pompa davuoto
riscaldatoa 110°Cper 24 ore
Al termine il tubo viene rotto, il solvente viene evaporato, lasciando gli amminoacidi che costituivano il campione.
25
49
Alcuni amminoacidi possono essere distrutti nelle condizioni di idrolisi acida:- Ser e Thr si disidratano ad alcheni (di solito le perdite non sono gravi)- Met, Cys e Cys2 si ossidano facilmente a 110°C. Non basta degassare, bisogna flussare
accuratamente con azoto.- Trp viene completamente distrutto.
Anche le catene laterali ammidiche vengono idrolizzate: l'asparagina ad acido aspartico, la glutammina ad acido glutammico.
b) Idrolisi basicaCondizioni standard: NaOH 2 M in acqua, 100°C.
Arginina, cisteina, serina e treonina sono completamente distrutte, il triptofano no.
c) Idrolisi enzimaticaGli enzimi peptidasi scindono i legami ammidici
Condizioni standard: pH 7, 37°C, quantità catalitica di enzima
Amminopeptidasi scindono (velocemente) i legami peptidici, liberando gli amminoacidi uno dopo l'altro, a partire dal residuo N-terminale. La scissione si interrompe tutte le volte che si arriva:
- ad un residuo Pro: il gruppo amminico è secondario e la catena laterale non può entrare nel sito attivo dell'enzima
- ad un D-amminoacido: la configurazione D impedisce alla catena laterale di entrare nella tasca del sito catalitico.
Carbossipeptidasi scindono (lentamente) i legami peptidici, liberando gli amminoacidi uno dopo l'altro, a partire dal residuo C-terminale.
50
a) Cromatografia a scambio ionico
Di solito si usano solfonati (resine a scambio di catione).
I tempi di ritenzione relativi sono influenzati dalla carica complessiva dell'amminoacido.
Supponiamo di avere Gly, Phe, Lys e Glu
Gly: ha H come catena laterale; praticamente non caricoPhe: ha CH2Ph come catena laterale (effetto -I); praticamente non caricoGlu: ha un altro gruppo acido; complessivamente ha una carica negativaLys: ha un altro gruppo amminico; complessivamente ha una carica positiva.
a pH 7
Gli amminoacidi si separano in base alla carica complesiva.
Si raccolgono più frazioni che poi si analizzano
Ordine di eluizione a pH 7 Glu (carica complessiva -1)Gly e Phe (carica complessiva 0)Lys (carica complessiva +1)
2. Separazione degli amminoacidiEseguita l'idrolisi totale del peptide, il problema successivo è separare gli amminoacidi liberati.
26
51
A pH 2 gli amminoacidi non avranno cariche intere, perché è un valore di pH piùacido del punto isoelettrico.
Gly + 0.7, Phe + 0.4, Glu + 0.6, Lys + 1.6
a pH 2
Ordine di eluizione a pH 2 Phe, Glu, Gly, Lys eluizione molto lenta (anche alcuni giorni)
Per separare tutti gli aminoacidi in tempi ragionevoli, nel corso della eluizione il pH viene gradualmente aumentato da 3 a 10: vengono eluiti prima gli amminoacidi acidi, poi quelli neutri ed infine quelli basici
La cromatografia a scambio ionico si può effettuare automaticamente, con un analizzatore di amminoacidi. Le frazioni raccolte sono esaminate spettrofotometricamente, dopo aggiunta di ninidrina, a 570 nm (sapendo il coefficiente di estinzione molare, si conosce anche la concentrazione.
52
Aa 570 nm
(eluente +ninidrina)
Volume di eluizione, ml
pH 3.25 pH 4.25 pH 9.0
AspCys SerThr
Glu
Pro
Gly Ala
Cys2
ValMet
IleLeuTyr Phe HisTrpLysNH
Arg
3
Cromatografia a scambio di catione per la separazione di quantità equimolari degli aa codificati dal DNA
A
(eluente +ninidrina)
Volume di eluizione, mlA = Glu, B = Gly, C = Phe, D = Lys, E = ammoniaca
Gli amminoacidi ottenuti dall'idrolisi totale di un peptide, fatti passare attraverso una colonna a scambio di catione, vengono identificati per confronto con gli standard.
27
53
b) HPLCL'HPLC in fase inversa è particolarmente efficiente per separare gli amminoacidi, che si possono rivelare con la ninidrina o facendone i fluorenilmetossicarbonilderivati, che assorbono a circa 280 nm.
cloruro di fluorenilmetossicarbonile (Fmoc-Cl)
+λ = 280 nm
Derivato Fmoc dell'amminoacido
O
ClO
NH2 CO2H
R
NH CO2H
RO
O
vantaggi si usano strumenti HPLC standard e si rivelano tutti gli amminoacidi, compresa la prolina.
c) GascromatografiaGli amminoacidi, esistendo generalmente come ioni dipolari, non sono volatili e vanno trasformati in derivati volatili per poter essere analizzati via GC.
NH2 CO2H
R N CO2Et
R
H
O
F3C
N CO2SiMe3
RSi
H
Me3
1. EtOH, H+
2. (CF3CO)2O
Me3SiCl
Et3N
Generalmente la temperatura della colonna viene aumentata con il tempo
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(+)
(-)fiamma
Registratore
gas dal GC
H O2 2
Rivelatore ad ionizzazione di fiamma: il gas di trasporto (eluente) viene convogliato su una fiamma che brucia in una camera, attraverso la quale èapplicata una differenza di potenziale: la corrente dipenderà dal numero di particelle ionizzate prodotte dalla fiamma.
Quantitàrivelata
Tempo di ritenzione, min
Gly(92°C)
(135°C)
(148°C)
(170°C)Phe
Glu
Lys
Analisi GC dei trifluoroacetammido esteri degli aa
vantaggi
Si possono usare gli strumenti GC standard.
Si possono rivelare tutti gli amminoacidi (anche se danno risposte diverse al f.i.d.)
Il GC può essere direttamente collegato ad uno spettrometro di massa
28
55
d) Elettroforesi su carta
La tecnica si effettua caricarndo la miscela di amminoacidi su una striscia di carta che viene poi imbevuta con un tampone acquoso ad un pH opportuno. Quando alla carta si applica una differenza di potenziale, gli amminoacidi con carica globale positiva migrano verso il catodo, quelli con carica globale negativa migrano verso l'anodo.
Svantaggi: scarsa risoluzione-molto difficile eseguire un'analisi quantitativa
Vantaggi: ☺ utile per separare amminoacidi insoliti☺ utile per separare amminoacidi marcati con isotopi radioattivi
(-) (+)
GluLysPhe
Gly
il campioneviene
applicatoqui
elettroforesi a pH 8
56
a) Cromatografia su carta
La cromatografia su carta separa gli amminoacidi in base alla polarità. Gli amminoacidi meno polari vengono eluiti più rapidamente.
Al termine dell’eluizione ai spruzza ninidrina, che dà una macchia violetta in corrispondenza degli amminoacidi.
La cellulosa funziona da supporto e l'acqua ad essa legata (legame idrogeno) fa da fase stazionaria. Si usa un eluente acquoso (cromatografia di ripartizione).
Eluenti tipici contengono: - acqua - soluzione ammoniacale (per aumentare il pH) - acido acetico (per diminuire il pH) - 1-butanolo (per diminuire la costante dielettrica).
29
57
SOLV
E
NT
E
B
SOLVENTE A
1 Glu2 Ser3 Gly4 Thr5 Lys6 Ala7 Arg8 Tyr9 Val
10 Pro
Cromatografia su carta in due dimensioni di una miscela di 10 a
Se non si riesce a separare completamente gli amminoacidi con la cromatografia su carta, si può tentare una cromatografia bidimensionale.
Si fa correre l'eluente in una direzione, si asciuga la carta, si cambia eluente e si fa correre in direzione perpendicolare alla precedente.
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DETERMINAZIONE DELLA SEQUENZA
1. Analisi dei residui alle estremità del peptide
I residui alle estremità sono gli unici che hanno, rispettivamente, il gruppo aminico ed il gruppo carbossilico liberi (a parte quelli che li contengono nelle catene laterali).
Si modificano chimicamente questi gruppi funzionali, si esegue l'idrolisi del peptide: gli amminoacidi alle estremità vengono liberati in forma modificata
Residuo N-terminale
I gruppi amminici primari e secondari sono abbastanza nucleofili da dare reazione con il 2,4-dinitrofluorobenzene (reagente di Sanger), dando i 2,4-dinitrofenil derivati (DNP, dinitrophenyl)
a. Metodo di Sanger
..+ -
HF
+ NO2
NO2
NHR
FNO2
NO2
NRHH
FNO2
NO2
R NH2
Frederick Sanger
30
59
Il gruppo DNP è stabile all'idrolisi acida. Idrolizzando il peptide, si liberano gli amminoacidi: l’unico con DNP in α è il residuo N-terminale.
Asp-Met-Phe-Lys-Ala
NH2
CO2H
NH
NHO
SMe
O
O
NH
NH2
NH
O
CO2H
FNO2
NO2
NH
CO2H
NH
NHO
SMe
O
O
NH
NH
NH
O
CO2H
NO2
NO2
NO2
NO2
H2O, H+
+
AlaDNP-AspLys(DNP)
+ ++
Met Phe
+
+
+ CO2HNH3
+NH
CO2H
OH
O
NO2
NH3N
SMe
O
OH
H3N
NH
OH
O
NO2
NO2
NO
OHO2
H3
Provenendo dall’idrolisi acida, gli amminoacidi sono in forma cationica!
60
L'identificazione si fa per confronto con i DNP derivati degli amminoacidi.
Gli amminoacidi che hanno gruppi amminici in catena laterale saranno sostituiti in una posizione diversa dalla α.
derivato Nε-DNP(tutti i residui di Lys)
NHNH
CO2H
NO2
NO2
NO2
NO2
derivato Nα,Nε-bis-DNP(Lys N-terminale)
NHNH2
CO2H
NO2
NO2
αβ
γδ
ε
l processo di identificazione si può migliorare estraendo i DNP derivati con solventi organici (cloroformio, acetato di etile).
Più recentemente il cloruro di dansile viene utilizzato a preferenza del reagente di Sanger (i derivati hanno forte assorbimento nell'UV).
+ RNH2
N CH3CH3
SO2Cl
N CH3CH3
SO2 NHR
31
61
Residuo C-terminale L'identificazione dell'estremità carbossilica è meno facile
a. trattamento con NH2NH2
L'idrazina (Nu forte) attacca tutti i legami ammidici e come base dà l'anione carbossilato. L’unico carbossile libero al termine della reazione è quello del residuo C-terminale (o un carbossile in catena laterale)
.. -
+ + +
+Asp Met PheNH
NH
O
CO2H
NH2
NH2 NH2
Asp Met PheNH O
NH2
NH NH2
NH2 CO2
NH2 NH2
Phe NH NH2Asp NH NH2 Met NH NH2 Lys NH NH2
b. trattamento con LiBH4
Tutti i gruppi carbossilici si trasformano in esteri metilici: il trattamento con LiBH4riduce le funzioni esteree, ma non quelle ammidiche.
NH
O
CO2HAsp Met Phe LysMeOH, H+
NH
O
CO2CH3Asp Met Phe Lys
62
Per idrolisi totale del peptide modificato, si ottengono gli amminoacidi ed un amminoalcool (quello dal residuo C-terminale)
LiBH4NH
O
CO2CH3Asp Met Phe Lys NH
O
CH2OHAsp Met Phe Lys
H2O, H+
ΔAsp + Met + Phe + Lys + estraibile con solvente
organico (etossietano)a pH 11
NH2 CH2OH
I metodi non sono molto sensibili ed il limite inferiore è circa 10μg.
2. Rimozione dei residui uno alla volta
Degradazione di EdmanResiduo N-terminale
reagente: isotiocianato di fenile
NC
S
Edman
32
63
NC
S
+ NH2NH
Peptide
R
O
NCS
N NH
Peptide
R
OH H- +
NCS
N NH
Peptide
R
OH H
+
-
NHCS
N NH
Peptide
R
OH
tiourea
Si aggiunge HCl 6 M che distrugge l'eccesso di Ph-N=C=S e promuove la reazione successiva
NHCS
N NH
Peptide
R
OHNH N
SO
R
H
NH2 Peptide +H+
N
NOS
HR
H
derivato dellafeniltioidantoina(termodinamica-mente più stabile)
con un residuo inmeno rispetto alpeptide iniziale
La tioidantoina si estrae con un solvente organico e si identifica per confronto con le tioidantoine preparate con i vari amminoacidi.
64
Esempio:
Asp-Met-Phe-Lys-Ala
1.
2. H++
Met-Phe-Lys-Ala
NH2
CO2H
NH
NHO
SMe
O
O
NH
NH2
NH
O
CO2H
NC S
NNHS
OCO2H
N NH
SMe
O
O
NH
N
NH
O
CO2HH3
H3+
+
NO
NH
N
NH
O
CO2H
H3
H3
+
+N NH
SMe
O
O
NH
N
NH
O
CO2H+
Met-Phe-Lys-Ala
NC S
1.
2. H+
NNHS
OS
+
Phe-Lys-Ala+
H3
H3
+1.
2. H+
Phe-Lys-Ala
+
Lys-Ala+
NO
NH
N
NH
O
CO2H
H3
H3
+
+N
N
NH
O
CO2HN
C SNNH
S
O
H3
H3
33
65
1.
2. H+
+Ala
+
Lys-Ala +
NC S NNH
S
ON
N
N
NH
O
CO2HN CO2H
H3
H3
H3
+
+
H3
☺ con 50 μg si può ricostruire la sequenza di un pentapeptide☺ il processo è stato automatizzato
Vantaggi:
Svantaggi non è abbastanza sensibile per le piccole quantità di peptide spesso a disposizione
con la ripetizione del ciclo di reazione il peptide rimanente contiene sempre più impurezze e dopo 20 residui i risultati possono essere ambigui
è necessario che l'estremità contenga il gruppo amminico libero (ed in molti peptidi naturali non è così).
Se si deve ricostruire la sequenza di un peptide contenente più di 20-30 residui di amminoacidi, si effettua una scissione parziale a peptidi piùpiccoli.
66
La carbossipeptidasi scinde gli amminoacidi uno alla volta, partendo dal residuo C-terminale. L'idrolisi è abbastanza lenta ed interrompendola intempi successivi (per es., per acidificazione) è possibile determinare i primi residui dagli amminoacidi liberati.
Residuo C-terminale
Esempio: Usando la carbossipeptidasi sul pentapeptide Asp-Met-Phe-Lys-Ala, si ottengono i seguenti risultati:
tempo di reazione (min) Aa liberati (equivalenti)
2 Ala (0.34) 6 Ala (0.73) Lys (0.17)20 Ala (0.96), Lys (0.52), Phe (0.07)60 Ala (0.96), Lys (0.52), Phe (0.07) Met (0.12)
Con il procedere del tempo, le diverse velocità di idrolisi determinano un quadro piùcomplesso. Di solito non è possibile risalire la sequenza per più di 3-5 residui.
34
67
3. Idrolisi parziale
L'idrolisi parziale (chimica o enzimatica) scinde il peptide in peptidi piùpiccoli, di cui è più facile ricostruire la sequenza: la struttura del peptide iniziale si ricostruisce trovando i punti in comune dei peptidi più piccoli.
Esempio
Ala-Phe-Gly-Glu-Phe-Ser-Ser-Phe ottapeptide
idrolisi parziale
Ala + Phe-Gly-Glu-Phe-Ser-Ser-Phe + Ala-Phe-Gly-Glu-Phe-Ser-Ser + Phe
eptapeptidi + amminoacidi
esapeptidi + dipeptidi
Ala-Phe + Gly-Glu-Phe-Ser-Ser-Phe + Ala-Phe-Gly-Glu-Phe-Ser + Ser-Phe
pentapeptidi, tripeptidi
68
Si raccolgono tutti i peptidi della stessa lunghezza: per esempio i tripeptidi
Ala-Phe-Gly-Glu-Phe-Ser-Ser-Phe
Ala-Phe-Gly
Phe-Gly-Glu
Gly-Glu-Phe
Glu-Phe-Ser
Phe-Ser-SerSer-Ser-Phe
Glu-Phe-Ser
Phe-Gly-Glu
Ser-Ser-Phe
Gly-Glu-Phe
Phe-Ser-Ser
Ala-Phe-Gly
Un peptide (o una proteina) può essere idrolizzato parzialmente anche usando enzimi, detti endopeptidasi, che catalizzano l’idrolisi di un legame ammidico non terminale
Idrolisi enzimatica
Enzima Specificità
Tripsina idrolizza dal lato carbonilico di Arg e LysChimitripsina idrolizza dal lato carbonilico di amminoacidi contenenti anelli aromatici a 6 termini (Phe, Tyr, Trp)Elastasi idrolizza dal lato carbonilico di piccoli amminoacidi (Gly, Ala)
35
69
SINTESI DEI PEPTIDI
La sintesi dei peptidi permette di:-confermare la struttura di un peptide naturale- preparare quantità relativamente grandi di peptidi rari- preparare peptidi nuovi
Supponiamo di dover preparare il pentapeptide Glp-Phe-Gly-Gly-Lys partendo da L-amminoacidi facilmente disponibili.
Affrontiamo il problema iniziando ad unire insieme due residui a partire da quello C-terminale: si tratta di fare il dipeptide Gly-Lys
+-
+
-+ ?+H3N CO2
H3N CO2
NH2
CO2
NH2
NH
OH3N
si può pensare di trasformare la glicina nel suo cloruro acilico e poi di aggiungere la lisina
Se però si fa questa reazione:
+ SOCl2+-
+ polimeri della Gly
+
+ polimeri
NH2
CO2NH2
- CO2
NH2
NH
ONH2
-
H3N CO2 NH2O
Cl
NH2 CO2
NHNH2
O
oltre al dipeptide desiderato si formano un centinaio di sottoprodotti!
70
Per formare un dipeptide dagli amminoacidi che lo costituiscono, bisogna proteggere tutti i gruppi funzionali, tranne quelli che dovranno essere coinvolti nella formazione del legame ammidico
posizioni che devono essere protette per avere l'accoppiamento corretto
-NH2 CO2 +
NH2 CO2
NH2
- ?Gly-Lys
si devono scegliere gruppi protettori che si possano rimuovere senza rompere il legame peptidico appena formato
- Protezione del gruppo amminicosi ottiene diminuendo la nucleofilicità dell'N, trasformando il gruppo amminico in alcossicarbonil derivato
R O NH
O
R = PhCH2, t-Bu, EtCambiando R, la deprotezione si può ottenerecon varie condizioni blande.
- Protezione del gruppo carbossilicosi ottiene trasformando l'acido nell'estere corrispondente (gli esteri sono più reattivi delle ammidi)
36
71
La sintesi del dipeptide Gly-Lys si può perciò effettuare nel modo seguente
Gly
Gly-Lys
Lys
NH
O
OEtCO2Me
NH
O
O Et
N
O
H
1. OH-, H2O
2. H+ acquoso
NH
O
OEtO
Cl
NH2 CO2Me
NH
O
O Et
Questa strategia funziona bene per preparare il dipeptide. Se però si vuole continuare la sintesi di un peptide più lungo, bisogna introdurre di nuovo i gruppi protettori: sarebbe meglio poter rimuovere solo il gruppo protettore dell'NH2 in α
NH
O
OR'CO2R
NH
O
O R
N
O
H
rimozioneselettiva di R'
NH2CO2R
NH
O
O R
N
O
H
accoppiamento delresiduo successivo (X)all'NH2 libero in α X Gly Lys OR
CO2Recc.
Gly
Lys
72
L'uso di gruppi protettori complementari si dice protezione ortogonale
Un esempio di protezione ortogonale si ha con i bruppi benzile/terz-butile
RCO2H RCO2R'
RNH2 ONH
O
RR'
reagente TFA H2/Pd-C
R'=CH2Ph
R'= CMe3 (t-Bu)
√
√
×
×
× √= stabile = deprotezione
entrambi i gruppi si possono rimuovere con HBr/AcOH o HF
Combinando i gruppi protettori benzile e t-butile, si può preparare facilmente un dipeptide Gly-Lys protetto, pronto per le reazioni successive
NH
O
OC
NH
O
O
N
O
HCH3
CH3
CH3 O
O
Boc Gly LysZ
OCH2Ph
La sintesi dei peptidi si semplifica notevolmente, se si usano due tipi di gruppi protettori, ciascuno dei quali può essere rimosso selettivamente.
37
73
il trattamento con TFA deproteggerà solo il gruppo amminico in α, lasciando protetti il gruppo carbossilico ed il gruppo amminico in catena laterale. L'NH2 su può accoppiare con il successivo amminoacido protetto e così via, fino ad ottenere la sequenza desiderata
Il pentapeptide Glp-Phe-Gly-Gly-Lys si può preparare nel modo seguente:+
1. accoppiamento2. aggiunta di TFA
+
1. accoppiamento2. aggiunta di TFA
+
1. accoppiamento2. aggiunta di TFA
+
accoppiamento
H2/Pd-C
Boc Gly OH LysZ
OCH2PhH
LysZ
OCH2PhGlyH
LysZ
OCH2PhGlyGlyH
Boc Gly OH
LysZ
OCH2PhGlyGlyPheH
Boc Phe OH
LysZ
OCH2PhGlyGlyPheGlp
Glp OH
LysGlyGlyPheGlp
74
Un modo abbreviato di rappresentare la sintesi peptidica è quello di indicare ciascun residuo con una linea verticale, i legami con linee orizzontali, i gruppi protettori con segmenti diagonali e mettendo i reagenti tra le strutture:
ZOCH2Ph
OH
H
Boc
OCH2Ph
OCH2Ph
OCH2Ph
OCH2Ph
OCH2Ph
OCH2PhOCH2Ph
ZZ
Z
Z
Z
Z
ZOH
BocBoc
Boc
BocBoc OH
OH
OH
H
H
H
Glp Phe Gly Gly Lys
TFA
H2/Pd-C
accoppiamento
accoppiamento
TFA
accoppiamento
TFA
accoppiamento
38
75
- Protezione di altri gruppi
In catena laterale ci possono essere gruppi che devono essere protettiAmminoacido protetto abbreviazione rimozione
NH2NNO2
NH
H3N CO2+-
Arg(NO2) H2/Pd-C S
H3N CO2+
-
Amminoacido protetto
Cys(CH2Ph) Na/NH3liq.
H3N CO2
NN
O
+
-
His(Bom) H2/Pd-C O
H3N CO2+-
Ser(CH2Ph) HBr/AcOHo Na/NH3liq.
Tyr(CH2Ph) HBr/AcOHo Na/NH3liq.
H3N CO2
O
+
-
abbreviazione rimozione
Tutti questi gruppi protettori sono stabili quando si tratta con TFA. Sono tutti rimuovibili con HF.
76
INTRODUZIONE DEI GRUPPI PROTETTORISpesso costa meno comperare gli amminoacidi già protetti (perché preparati ingrandi quantità). Dovendoli preparare, i gruppi protettori più comuni si introducono nel modo seguente:
+NEt3
+NEt3
R NHZ
R NHBoc
O Cl
O
R NH2
O O O
O O
O NHR
O
O NHR
O
R NH2
+ H+
+H+ R CO2But
R CO2HOH
R O
OR CO2CH2Ph
R CO2H R O
O
Un problema particolare si presenta quando dobbiamo differenziare due gruppi amminici o due gruppi carbossilici. La soluzione dipende da quale gruppo si deve proteggere.
39
77
Per esempio, la protezione della catena laterale della lisina con Z si può effettuare sul chelato con un catione, come quello rameico; successivamente il gruppo amminico si protegge con Boc, dopo aver rimosso il catione
-
2 Cu2+
NEt3
H2S
NEt3CuS
NH2N
OO NH2
N
OO
Cu
OO
H
H
OO
. ....
....
NH2NH2
OO NH2
NH2
OO
Cu. ..
..
....
CO2
NH2
NH
OO
-
CO2NH2
NH2
O Cl
O
O O O
O O
CO2H
NN
H
OO
H
O
O
Boc Lys(Z) OH
78
FORMAZIONE DEL LEGAME PEPTIDICO
Dovendo formare il legame ammidico tra due amminoacidi, opportunamente protetti, bisogna trasformare il gruppo OH dell'acido in un buon gruppo uscente
Boc-Gly-OH Boc-Gly-X
NHO
OHBoc NHO
XBoc
Per gli acidi carbossilici l'attivazione più usata nel passato è stata la trasformazione in cloruri acilici
SOCl2R
O
OH R
O
ClR'NH2
R
O
NHR'
però per la formazione del legame peptidico, se l'attivazione è troppo forte, si hanno dei problemi, il principale dei quali è la racemizzazione del C α
otticamente puro
base
acido
(-)(-)
+
racemico
OR
X H
OR
X
OR
X OR
X HOH
R
X
OR
H X
40
79
L'acido carbossilico libero non dà racemizzazione in ambiente basico, ma il cloruro acilico la dà, (Cl favorisce la formazione dell'anione)
base -
il centro chirale è "al sicuro"(dianione sfavorito)
base-
racemizzazione
NH O
OHRH
NH2
O
ORH
NH O
XRH
NH O
XR
Con i peptidi (e con gli amminoacidi con il gruppo amminico protetto come ammide semplice) c'è un altro meccanismo con cui avviene la racemizzazione quando ilgruppo OH dell'acido carbossilico è sostituito con un gruppo uscente molto buono.
= ..
H+ossazolone
NH O
XRHO O X
NH
O
RX
NO
O
RH
Gli ossazoloni sono molecole abbastanza reattive e possono fare legame peptidico per trattamento con l'opportuno composto con il gruppo amminico
: H+
NOO
RH
NH
R'-
NOO
RH
NH
R'
-NH
NH
R'
O
O
H R
NO
O
RH
NH2
R'
80
però l'ossazolone dà racemizzazione in condizioni molto blande, soprattutto inseguito a deprotonazione base-catalizzata, dando un anello aromatico a 6 elettroni π
NO
O
RH
:B
BH+
NO
O
R- NO
O
R- N
OO
R
-
qualunque formazione di ossazolone potrebbe portare a racemizzazione del centro chirale, pregiudicando l'integrità del peptide appena preparato
Per ridurre il grado di racemizzazione durante le reazioni di formazione del legame peptidico si può:
eseguire reazioni di accoppiamento in cui il carbossile attivato sia quello della glicina (che non è chirale) o della prolina (che non forma ossazolone)
scegliere condizioni di reazione che minimizzino la racemizzazione (solvente poco polare, pH neutro, bassa temperatura)
scegliere accuratamente le condizioni per attivare il carbossile (v. dopo)usare nelle reazioni di accoppiamento amminoacidi protetti con gruppi
alcossicarbonile
R' acido
base
praticamente nessuna racemizzazione}NH
O X
O
O H R
41
81
con questi derivati non si osserva praticamente racemizzazione, tranne che in condizioni molto estreme (si pensa che gli alcossiossazoloni corrispondenti siano difficili da deprotonare sul C α).
gli amminoacidi protetti con alcossicarbonile possono essere "attivati" e poi accoppiati con l'amminoacido appropriato, senza rischio di avere racemizzazione.
REAGENTI PER L'ACCOPPIAMENTO PEPTIDICO
DICICLOESILCARBODIIMMIDE (DCC)
+
DCC
+
dicicloesilurea
CN
NR
CO
ONH
NC
RC
NHR'
O ONH
NHCR
COH
O
R' NH2
La DCC può essere aggiunta direttamente alla miscela di acido ed ammina, perchécon l'ammina dà solo un equilibrio.
La dicicloesilurea è poco solubile e si separa per filtrazione
L'uso della DCC permette di accoppiare un acido ed un'ammina in una reazione "one-pot" ed è il metodo più semplice di formazione del legame ammidico.
82
ANIDRIDE
Se l'acido carbossilico si tratta con mezzo equivalente di DCC, si osserva la formazione del precipitato bianco di diciloesilurea anche prima dell'aggiunta della DCC, a causa della formazione di anidride
2 DCC
RC
OH
O
RC
O
O
RCO
H2O
L'anidride può essere utilizzata per la formazione del legame ammidico
RC
O
O
RCO
R' NH2+
RC
NHR'
O+
RC
OH
O
Questo procedimento è molto usato nella sintesi di peptidi, perché la reazione è pulita ed avviene velocemente (di solito entro un'ora).
Le anidridi simmetriche, formate da acido e DCC, reagiscono con le ammine per dare ammidi che di solito sono molto pure, ma questo metodo comporta lo spreco di metà dell'acido carbossilico (costoso).
L'inconveniente si può evitare usando anidridi miste:
RC
OH
O+
CC
Cl
O
CH3 CH3
CH3
CC
O
O
RCO
CH3
CH3
CH3
R' NH2
RC
NHR'
O+ (CH3)3CO2H
42
83
ESTERE ATTIVO Gli esteri metilici sono poco reattivi con le ammine e perciò non sono buoni substrati per la sintesi di peptidi.
la reazione diventa utile con esteri con gruppi OR migliori gruppi uscenti (maggiore stabilità do RO- )
+
+ R'O-
RC
O
O
R' R'NH2
RC
NHR'
O esteri p-nitrofenilici(reagiscono in 12 ore)
RC
O
O NO2
Alcuni esteri attivi possono essere preparati in situ. Per esempio, l'1-idrossibenzotriazolo e la DCC vengono fatti reagire con l'acido carbossilico in uno stadio di "pre-attivazione"; la successiva aggiunta di ammina porta alla formazione pulita dell'ammide desiderata.
esteri pentafluorofenilici(reagiscono in 1 ora)
RC
O
O FF
F
FF
DCC+
RC
O
ONH
NC
NN
NOH O
NH
NHCR
CO
O
NNN
RC
OH
O
Quando gli esteri attivi vengono fatti reagire con le ammine, si ottengono ammididi elevata purezza, ma gli esteri attivi possono essere difficili da preparare (o costosi da comperare).
84
AZIDILe azidi aciliche si possono formare dagli esteri carbossilici per trattamento con idrazina (che forma l'idrazide dell'acido) ed acido nitroso (fonte di NO+).
NO+ + -
azide acilica(stabilizzata per risonanza)
MeOH
RC
N
O
N NR
CNH
O
NH2
NH2 NH2R
CO
O
R'
Il gruppo azido è un gruppo uscente moderatamente buono. La reazione con le ammine avviene in circa 10 ore, dando l'ammide corrispondente.
+
H+, N3-
RC
N3
O
R'NH2 RC
NHR'
O
Il metodo dell'azide non viene scelto di solito, perché le azidi aciliche danno reazioni secondarie (per esempio la trasposizione di Curtius) e la formazione di ammide è piuttosto lenta. Però le azidi non danno racemizzazione.
La formazione di legame peptidico con azide si usa solo quando la racemizzazione è un problema serio, soprattutto nell'accoppiamento di due frammenti peptidici.
43
85
Riassumendo, i quattro metodi principali di accoppiamento peptidico sono:
Metodo Forma attivata Vantaggi Svantaggi
DCC RC
O
ONH
NC semplice
qualche reazionesecondaria
AnidrideR
CO
O
RCO
reazionemolto pulita
sprechipiuttosto costoso
Estereattivo R
CO
O NO2
RC
O
O FF
F
FF
reazionemolto pulita
esteri attivi costosio di non facile preparazione
Azide RC
N3
O numerose reazionisecondarie
assenza di racemizzazionenell'accoppiareframmenti
86
STRATEGIADovendo preparare un peptide, dobbiamo eseguire la sintesi aggiungendo un amminoacido alla volta o dobbiamo costruire la molecola in pezzi? Ci sono altri fattori che possono influenzare il progetto della via sintetica?
SINTESI LINEARE o CONVERGENTE ?
Una sintesi di peptide si chiama lineare se la molecola-obbiettivo viene costruita accoppiando un residuo amminoacidico alla volta.
Una sintesi di peptide convergente comporta la sintesi separata di frammenti peptidici (contenenti due o più residui) che poi vengono accoppiati, formando il peptide finale.
Consideriamo la sintesi di un ottapeptide, la cui sequenza di amminoacidi si indichi con:
A-B-C-D-E-F-G-HSupponiamo di poter garantire una resa del 90% per ciascun passaggio di accoppiamento e confrontiamo la resa complessiva di una sintesi lineare con quella di una sintesi convergente
Sintesi lineare:
A + B A-B+ C
A-B-C+ D
A-B-C-D+ E
A-B-C-D-E
+ FA-B-C-D-E-F
+ GA-B-C-D-E-F-G + H
90% 81% 73% 66%
59% 53%A-B-C-D-E-F-G-H
48%
44
87
Sintesi convergente:A + B A-BC + D C-D
E + F E-FG + H G-H
}90%
}A-B-C-D
E-F-G-H} A-B-C-D-E-F-G-H
81% 73%
La resa complessiva mette in evidenza il vantaggio della sintesi convergente.Il numero di passaggi è lo stesso, ma il metodo lineare fa sì che si abbia a che fare con peptidi sempre più grandi ad ogni passaggio di accoppiamento, mentre il metodo convergente permette di eseguire la maggior parte dei passaggi con frammenti relativamente piccoli.
La sintesi convergente dà rese più elevate e comporta la manipolazione di frammenti peptidici piccoli e facili da maneggiare per la maggior parte dei passaggi.
QUALI FRAMMENTI ACCOPPIARE?Per la sintesi convergente di un pentapeptide, per esempio Glp-Phe-Gly-Gly-Lys, ci possono essere strade diverse
Glp-Phe+
Gly-Gly+ Lys
Glp-Phe-Gly-Gly-Lys
Glp-Phe+
Gly-Gly-Lys
Glp +
Phe-Gly+
Gly-Lys
Glp-Phe-Gly+
Gly-Lys
A B C
D
88
C'è una strategia significativamente migliore delle altre?
La via D presenta un accoppiamento semplice, perché è coinvolta la glicina (non chirale): in assenza di problemi di racemizzazione, si può usare il metodo semplice della DCC. Però i precursori (di- e tri-peptidi) devono essere preparati con il metodo lineare.
Sintesi lineare Glp-Phe-Glyattivazione del residuo C-terminale
Glp Phe NH
CH2 CO
X(P = gruppo protettore: occorreproteggere anche la catena lateraledella lisina)
H-Gly-Lys-P
P
Glp-Phe-Gly-Gly-Lys-
PP
Nel decidere quali frammenti accoppiare, è preferibile scegliere come componente carbossilico quello che non dà racemizzazione (glicina o prolina) e quindi usare il metodo semplice della DCC. Se nell'accoppiamento dei frammenti non si può usare un residuo Glyo Pro C-terminale, bisogna usare l'accoppiamento con l'azide.
LA SINTESI DEL PEPTIDE DEVE INIZIARE DALL'ESTREMITA' N- o C-?
Anche se il metodo complessivo è convergente, quasi sempre richiede qualche sintesi lineare al suo interno (per es., la via D precedente)
45
89
Glp + Phe
Glp Phe GlyGlp Phe Gly
Phe + Gly
GlyPheGlpSintesi linearedall'estremitàN-terminale
Sintesi linearedall'estremitàC-terminale
E' meglio costruire il peptide "da destra a sinistra", perché si può minimizzare la racemizzazione.
Per la sintesi lineare di peptidi è meglio partire dall'estremità C-terminale, perché gli amminoacidi protetti con alcossicarbonile si possono attivare facilmente, senza seri rischi di racemizzazione.
+
Boc Phe Gly OCH2Ph
H Gly OCH2PhDCC
Boc Phe OH
TFA
H Phe Gly OCH2PhGlp/DCC
Glp Phe Gly OCH2PhH2, Pd/C
Glp Phe Gly
90
Nonostante i vantaggi della sintesi convergente, in seguito all'avvento della sintesi dei peptidi in fase solida, la maggior parte della sintesi peptidica si esegue in modo lineare.
SINTESI DEI PEPTIDI IN FASE SOLIDAUno dei problemi principali nella sintesi peptidica non sono tanto i passaggi di protezione/ deprotezione o le reazioni di accoppiamento, quanto la necessità di purificare il peptide ad ogni passaggio, per evitare che si accumulino le impurezze.
Un modo di semplificare notevolmente la purificazione si deve a Merrifield, che ha sviluppato la tecnica di legare l'estremità C- ad un supporto polimerico insolubile.
Merrifield ha usato un supporto di polistirene trattato con clorometossimetano in presenza di un acido di Lewis. Questa reazione di Friedel-Crafts dà un polimero insolubile, in grado di formare un legame di tipo estere benzilico con l'appropriato derivato di un amminoacido:
polimerizzazione ClCH2OMe
SnCl4
CH2
CH2
CH2
Cl
Cl
Cl
O CH2O
R
NH
Boc
O CH2O
R
NH
Boc
O CH2O
R
NH
Boc
Questi polimeri si presentano come palline; l'amminoacido reagisce come se fosse un semplice estere benzilico; il polimero è insolubile nei solventi organici: il peptide in crescita è l'unica molecola organica legata alla resina. Tutte le impurezze vengono rimosse per lavaggio.
46
91
Si usano metodi di accoppiamento che assicurano reazione completa entro un'ora e si aggiunge un eccesso (3-5 equivalenti) dell'amminoacido attivato.
Ancora oggi sono è molto usata la combinazione di protezione ed attivazione originale di Merrifield: protezione del gruppo amminico con Boc, attivazione con DCC, protezione di tipo benzilico delle catene laterali. Alla fine della sintesi si usa HBr/AcOH, che rimuove i gruppi protettori benzilici e contemporaneamente stacca il peptide dalla resina.
Durante la sintesi dei peptidi si esegue il seguente ciclo di reazioni:
1) TFA
2) lavaggio con DMF lavaggiodeprotezione
1)
2) lavaggio con DMF lavaggio
accoppiamento
si ripete
ciclocompleto
O CH2O
R
NH
O
R'
NH
Boc
O CH2O
R
NH
Boc
O CH2O
R
NH2
X
O
R'
NH
Boc
Bruce Merrifield
92
Più recentemente sono state sviluppate altre combinazioni di supporto polimerico, di legame del C-terminale, di protezione e deprotezione.
1. Supporto polimerico
La polimerizzazione radicalica della N,N-dimetilpropenammide (acrilammide), in presenza di un derivato funzionalizzato e di un agente di "cross-linking" dà un polimero permeabile in solventi come DMF, che può essere supportato su Kiselguhr (argilla inorganica), per avere sintesi peptidica in "flusso continuo“ (i reagenti ed il solvente scorrono attraverso una colonna contenente la resina).
N
O
CH3
CH3 + N
O
CH3
O
OCH3
polimerizzazione radicalica
N
O
N
O
OOCH3
N
O
Me2
Me
Me2
N
O
N
O
HH
agente di cross-linking
47
93
2. Collegamento polimero-peptide
Una modifica in due passaggi del gruppo estere metilico dà un idrossi derivato, a cui si può legare l'amminoacido C-terminale con un semplice legame estereo
1.
2.O
OCH3
NH2 NH2
OHO
O
X
OH
O
ON N
O
OHH
Il legame è labile in ambiente acido ed il peptide finale può essere rilasciato con ac. trifluoroacetico.
3. ProtezioneIl gruppo protettore Fmoc si rimuove facilmente in condizioni basiche blande (di solito 20% azaciloesano).
FmocCH2 O
NOH
COX
R
Durante la sintesi il peptide in crescita viene in contatto solo con reagenti blandi ed il trattamento finale con TFA libera dalla resina il peptide completamente de-protetto.
94
4. Attivazione
ODhbtNN N
OO
O
R
NFmocH
Gli esteri di Dhbt (3,4-diidro-4-osso-1,2,3-benzotriazol-3-ile, 3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazol-3-yl) si accoppiano abbastanza velocemente con i gruppi amminici liberi (circa 30 min). Durante la reazione di accoppiamento la resina si colora di giallo e quando l'accoppiamento è completo il colore scompare.
Quattro fattori hanno fatto sì che il metodo in fase solida sia quelloattualmente più usato nella sintesi dei peptidi
Le sintesi sono veloci: in un giorno si possono facilmente accoppiare 5-10 residui (la sintesi convenzionale in soluzione di un ottapeptide può richiedere un mese o più).
I passaggi sono semplici e ripetitivi ed è stato possibile ottimizzare le reazioni fino a rese di quasi il 100%.La purificazione mediante HPLC ha permesso di isolare rapidamente peptidi molto puri.
Dato che il metodo è così semplice e ripetitivo è stato possibile renderlo completamente automatico. I sintetizzatori automatici dipeptidi sono costosi, ma adatti per le ditte farmaceutiche, che li possono far funzionare ventiquattro ore al giorno.
48
95
La sintesi dei peptidi in fase solida ha però degli inconvenienti
Dopo 15-20 residui le impurezze cominciano a diventare significative
Qualche volta l'accoppiamento può diventare difficile in modo inatteso e non evidenziato dal metodo, probabilmente per il ripiegamento della catena peptidica
Ci sono dei limiti alla quantità di peptidi che si possono preparare con la sintesi in fase solida. La resina non può essere caricata troppo con il primo residuo, altrimenti diminuisce l'efficienza dell'accoppiamento; 0.5 g di resina (che è la quantità maneggiata nella maggior parte dei laboratori) possono dare solo 75 mg di un pentapeptide (abbastanza per semplici prove biologiche, ma non per l'eventuale applicazione medica)
La resina, gli amminoacidi protetti, i reagenti ed i solventi per la sintesi in fase solida sono molto costosi.
La sintesi dei peptidi in fase solida immobilizza il peptide in crescita su un polimero insolubile, permettendo una purificazione facile dopo ciascun accoppiamento. E' un metodo veloce ed affidabile per ottenere piccole quantità (10-100 mg) di peptide per i test biologici. Quantità maggiori di peptide si preparano usando la sintesi convergente in soluzione.