Download - PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
1/30
tugas mata kuliah biologi molekuler
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
2/30
I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Infertilitas merupakan suatu keadaan yang menyebabkan kegagalan konsepsi
pada pasangan yang telah menikah lebih dari satu tahun, yang tidak menghasilkan
keturunan meskipun tidak mengikuti program keluarga berencana. Sekitar 10% dari
pasangan suami-istri mengalami infertilitas. Faktor peyebab infertilitas berasal dari
suami, istri, atau keduanya. Faktor lain dari kedua belah pihak sebesar 30-0%.
!enurut penelitian yang dilakukan "im dan #atnam, faktor penyebab yang berasal
dari suami sebesar 33%, sedangkan hasil penelitian $& pada 1'(' sebesar 0%.)enelitian yang dilakukan *rsyad terhadap + pasangan infertil di )alembang
menunukkan infertilitas yang disebabkan faktor pria sebesar (,%. Setengah dari
kasus infertilitas pria tersebut disebabkan oleh rendahnya motilitas sperma
astheno/oospermia dan atau umlah sperma oligos/oopermia, dan kelainan
morfologis sperma terato/oospermia.+,3 riteria yang digunakan oleh $& tahun
1''', tentang fertilitas pria.
!itokondria adalah tempat teradinya respirasi sel melalui reaksi en/imatik
fosforilasi oksidatif &2)&S menghasilkan suatu energi dalam bentuk *denosine
riphosphate *). !atriks di dalam mitokondria yang berfungsi sebagai respirasi
sel disebut 4eo5yribonucleic *cid 46*, 46* mitokondria tersebut dikenal dengan
sebutan mt46*. 4i dalam mt46* banyak terdapat gen dan uga terdapat daerah
yang tidak menyandi noncoding region pada mt46* disebut daerah gelung-4 4-
loop, yang merupakan tempat a7al teradinya proses replikasi dan transkripsi.
ecepatan mutasi mt46* pada 4-loop adalah 108+0 kali 46* inti 46*, sehingga
urutan 46* pada daerah 4-loop ini sangat 9ariatif orai and ayasaka, 1''0:
$allace, 1''+: ;ro7n and $allace, 1''3. *kibat adanya mutasi mt46* di samping
mengakibatkan menurunnya *), akan diperoleh #eacti9e &5ygen Species #&S
antara lain hidrogen peroksida yang tinggi. Sedangkan sifat dari hidrogen peroksida
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
3/30
adalah oksidator, yang mana pada konsentrasi yang tinggi akan mengoksidasi lipid,
protein dan 46*.
Sasaran oksidasi #&S adalah lipid, protein dan 46* Sies and !enck, 1''+.
)ada oksidasi 46*, nukleotida guanin adalah nukleotida yang ra7an terhadap
oksidasi #&S. asil oksidasi guanin adalah (-hidroksideoksiguanosin (-&-d. erusakan pada n46* akan
mengganggu proses pembelahan sel pada spermatogenesis, dan pada mitokondria
mengganggu rantai respirasi sel yang dapat menurunkan energi sel Sohal and ;runk,1''+.
Saat ini lebih dari 100 mutasi titik point mutation pada mitokondria telah
ditemukan dan berhubungan dengan penyakit-penyakit manusia, namun baru
beberapa mutasi mt46* yang dilaporkan teradi pada spermato/oa. *pabila hal ini
teradi pada spermato/oa dika7atirkan dapat menyebabkan menurunnya motilitas
spermato/oa dikarenakan motilitas spermato/oa sangat membutuhkan *) #ui/-
)esini et al., 1''(.
4ari beberapa paparan di atas dapat diduga bah7a (-hidroksideoksiguanosin
(-&-d
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
4/30
BAB II
DASAR TEORI
2.1 Mitokondria
!itokondria adalah organela yang terletak di dalam sitoplasma sel eukariota.
Struktur organela ini berupa kantung yang selaputi oleh dua membran yaitu membran
luar dan membran dalam, selain itu memiliki dua kompartemen yaitu matriks
mitokondria yang diselimuti langsung oleh membran dalam dan ruang antar
membran.
!embran luar mengandung seumlah protein transpor yang disebut porin dan
en/im-en/im yang terlibat dalam biosintesis lipid dan metabolisme mitokondria.
Ga!ar 1. Struktur !itokondria.
"eterangan # !itokondria diselaputi oleh dua membran yaitu membran luar dan membran dalam.
!embran dalam membentuk struktur yang melipat ke dalam disebut krista. !itokondria
memiliki dua kompartemen yaitu matriks dan ruang antar membran. !embran luar dapat
dilalui ion atau molekul kecil, sedangkan membran dalam bersifat impermeabel. )adamembran dalam terdapat kompleks protein rantai respirasi, *) sintase dan transporter
membran. #uang matriks mengandung en/im, ribosom, 46* mitokondria.
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
5/30
!embran dalam memiliki struktur melekuk, melipat ke bagian matriks
mitokondria, yang dikenal sebagai krista. Struktur melekuk ini sangat membantu dalam
meningkatkan luas permukaan membran dalam sehingga meningkatkan
kemampuannya menghasilkan *). Struktur yang melekuk ini uga membantu
mempercepat komponen matriks mencapai membran dalam. !embran dalam dan
matriks mitokondria terkait erat dengan akti9itas utama mitokondria yaitu terlibat
dalam pembentukan energi, oksidasi asam lemak dan siklus rebs. !atriks
mitokondria mengandung protein sekitar ?% dari seluruh protein mitokondria,
en/im, 46* mitokondria dan ribosom "odish et al., +000: *rtika, +003.
=umlah mitokondria di dalam sel tergantung dari umlah kebutuhan sel akan
energi. Sel dengan kebutuhan energi yang besar mengandung banyak mitokondria,misalnya oosit yang mengandung 100.000 mitokondria, sedangkan pada spermato/oa
matang, umlah mitokondria sekitar ++-+( St. =ohn et al., +00>. &osit membutuhkan
energi yang banyak terutama untuk pembelahan setelah dibuahi spermato/oa.
Sedangkan pada spermato/oa matang, energi yang dibutuhkan hanya dipakai untuk
pergerakan atau motilitas dalam rangka membuahi o9um.
Ga!ar 2. Spermato/oa manusia.
"eterangan @ Spermato/oa dengan tudung akrosom, nukleus, selubung mitokondria dan
mitokondria yang tersusun heliks di daerah midpiece *. )enampang melintang
bagian spermato/oa, mulai bagian kepala, leher dan ekor ;.
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
6/30
)ada spermato/oa, mitokondria terletak pada daerah midpiece, terdiri atas 11-13
gira masing-masing girus ada + mitokondria yang tersusun secara heliks, melingkari
bagian pusat midpiece ekor Bamboni, 1''1: olstein et al., +003.
!itokondria yang tersusun heliks ini bertanggung a7ab menyediakan energi
bagi motilitas spermato/oa irata et al., +00+.
membuktikan bah7a pada subek asteno/oospermia, daerah midpiece yang berisi
mitokondria secara bermakna lebih pendek dibanding subek normal. Sedangkan
menurut Aardullo dan ;alt/ 1''1 ada korelasi antara 9olume mitokondria, panang
sperma dan frekuensi gerak flagela. !enurunnya motilitas dapat disebabkan oleh
gangguan gen-gen yang terlibat dalam pembentukan ekor dan fungsi a5onema ekor spermato/oa !oore dan #eio-)era, +000.
2.2 $%ng&i $o&'orila&i Ok&idati' Mitokondria
Fungsi mitokondria dalam sel adalah menghasilkan energi dalam bentuk *)
adenosine triphosphate. Sebagian besar *) dihasilkan melalui proses fosforilasi
oksidatif. Cnergi yang dihasilkan ini digunakan sel untuk homeostatis, regulasi,
pembelahan, motilitas dan kematian $allace, 1''': St. =ohn et al., +00>: !ay
)anloup et al., +00.
Fosforilasi oksidatif merupakan reaksi kondensasi molekul *4) dengan )i
phosphate inorganic, )i menadi *) menggunakan energi yang dihasilkan dari
rantai respirasi Saraste, 1''': "ehtonen, +00+. Fosforilasi oksidatif melibatkan
perpindahan elektron dari senya7a 6*4 dan suksinat, keduanya merupakan substrat
yang akan melepaskan elektronnya untuk reaksi transduksi energi ke molekul oksigen
sebagai akseptor elektron terakhir dan membentuk +&.
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
7/30
)roses fosforilasi oksidatif melibatkan lima kompleks en/im rantai respirasi
: Saraste,
1''': "ehtonen, +00+.
ransfer elektron antara kompleks I, III dan ID disertai transpor proton dari
matriks ke ruang antar membran dengan menggunakan energi bebas yang dilepaskan
oleh masing-masing kompleks. )emindahan proton ini mengakibatkan akumulasi
proton pada ruang antar membran sehingga menimbulkan suatu gradien potensial
proton. eadaan ini dimanfaatkan oleh kompleks D untuk mensintesis *) dari *4)
dan )i dengan menggunakan energi yang dilepaskan saat proton berpindah dari ruang
Ga!ar (. Fosforilasi oksidatif pada membran dalam mitokondria.
"eterangan @ Clektron ditransfer melalui 6*4 masuk ke dalam kompleks I AI dan ditranspor ke
koen/im E E. ;eberapa elektron dari oksidasi asam organik ditransfer melalui
kompleks II AII langsung ke E. Clektron-elektron tersebut kemudian ditransfer ke
kompleks III AIII, ke sitokrom c cyt c dan dilanutkan ke kompleks ID AID,
kemudian direduksi menadi air. ransfer elektron disertai transpor proton dari matrik ke
ruang membran dalam mitokondria inner membrane space, I!S. ranspor proton
menyebabkan gradien potensial yang menimbulkan energi, yang dipakai untuk
membentuk *) "ehtonen, +00+.
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
8/30
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
9/30
mitokondria *ndersons et al., 1'(1. etiga belas polipeptida meliputi tuuh sub unit
641, +, 3, , ", > dan dari kompleks I rantai respirasi, satu sub unit apositokrom
b dari kompleks III, tiga sub unit A& I, II, III dari kompleks ID dan dua sub unit
*) ase dan *) ase ( dari kompleks D *ttardi et al., 1'(?.
erdapat suatu daerah pengontrol yang tidak menyandi non coding region,
disebut sebagai displacement loop 4-loop. 4aerah 4-loop merupakan struktur
beruntai tiga triple stranded, terdiri dari 11++ pb 10+-00>?>, mempunyai titik asal
replikasi rantai & dan + promoter utama untuk untai dan " ) dan )".
ranskripsi !t46* diinisiasi dari dua promoter yang ada di daerah 4loop yaitu )
dan )", transkripsi beralan mengelilingi mt46* sehingga membentuk #6* yang
polisistronik. 4-loop merupakan daerah kontrol utama ekspresi mt46*, dan berfungsi
sebagai promoter utama transkripsi Alayton, 1''1. 4i daerah 4-loop terdapat dua
daerah yang sangat ber9ariasi yaitu hyper9ariable region 1 D#1 dan hyper9ariable
Ga!ar *.
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
10/30
region + D#+, kedua daerah ini tidak menyandi gen tertentu, namun telah diketahui
berperan penting pada studi populasi. 4aerah 4-loop diperkirakan ber9ariasi sekitar 1-
3% 1-3 per 100 nukleotida antara indi9idu yang tidak memiliki hubungan keluarga
Sudoyo, +003.
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
11/30
2.* Peran Genetik tDNA Pada Motilita& S)erato+oa
!otilitas sperma adalah pergerakan sperma. Sperma bergerak motil, dengan
maksud agar sampai di alat reproduksi 7anita untuk pembuahan. Cnergi untuk
motilitas bersumber pada bagian tengah spermato/oa. 4i bagian itu terdapat
mitokhondria, yang memecah bahan-bahan tertentu untuk mengeluarkan energi.
;agian tengah spermato/oa dapat diibaratkan generator spermato/oa. Cnergi dari
bagian tengah disalurkan ke distal, yaitu ke ekor. Ckor kemudian bergerak. =adi ekor
dapat diibaratkan sebagai kemudi uga sebagai pendorong spermato/oa ipto, +00(.
!itokondria spermato/oa memegang peranan penting terhadap fungsi sperma,
perubahan genetik pada 46* mitokondria karena mutasi atau 9arian haplogroup
memba7a konsekuensi tersendiri pada fertilisasi secara normal terutama kesuburan pria Sanche/ et al., +003. al ini dapat dipahami karena selain genom inti, mt46*
ikut bertanggung a7ab menyandi kompleks en/im respirasi dalam menghasilkan *)
yang digunakan untuk motilitas spermato/oa !oore dan #eio-)era, +000. *)
digunakan untuk menggerakkan protein dinein penyusun axonema flagela. elah
dilaporkan bah7a gangguan pada motor dinein atau komponen lain yang mengatur
akti9itas motor dapat menyebabkan infertilitas dan respirasi Supp et al., +000.
*) yang dihasilkan oleh mitokondria sebagian besar berasal dari rantai
transfer elektron pada 7aktu fosforilasi oksidatif, dimana segala protein yang terlibat
pada proses rantai respirasi ini disandi oleh genom inti dan genom mitokondria.
ambatan fosforilasi oksidatif diyakini uga terkait dengan genom mitokondria karena
secara genetik mt46* ikut berperan dalam menyandi kompleks en/im respirasi.
. !utasi pada mt46* dapat mengganggu
ekspresi satu atau lebih protein en/imatik Schon et al., 1''?. !utasi mt46* dapat
menurunkan motilitas spermato/oa dengan cara menurunkan produksi *).
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
12/30
;eberapa mutasi yang teradi pada mt46* yang terkait dengan motilitas
spermato/oa banyak diteliti. Folgero et al. 1''3 menemukan mutasi mt46* *3+3<
menurunkan motilitas sperma. )ada le9el yang sangat rendah mutasi *3+3< sudah
mampu menyebabkan gangguan metabolisma energi Ahinnery et al., +000.
Spiropoulos et al. +00+ menemukan mutasi mt46* *3+3< yang teradi pada
mitokondria dengan le9el yang tinggi secara kuat berhubungan dengan penurunan
motilitas spermato/oa.
Selain mutasi *3+3
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
13/30
atas, disamping menderita mitochondrial myopathy uga mengalami penurunan
fertilitas dan motilitas.
2., H%!%ngan M%ta&i tDNA dengan In'ertilita& Pria
Salah satu penentu fertilitas pria adalah motilitas sperma. Sperma memerlukan
energi yang besar sehingga dapat berfungsi secara layak untuk keberhasilan fertilisasi.
"okasi mitokondria dalam sperma yang unik yaitu terletak pada bagian basal dari
flagela mid piece, berperan penting dalam ketersediaan energi secara efektif dan
cepat. etapi, motilitas sperma yang sangat bergantung pada fungsi respirasi
mitokondria, dapat diprediksi bah7a akumulasi mutasi yang bersifat patogenik dari
mt46* dan kelainan respirasi menyebabkan disfungsi sperma dan infertilitas.!engingat bah7a kelainan respirasi bisa teradi akibat mutasi n46* maupun
mt46*, maka untuk meyakinkan bah7a energi yang digunakan untuk motilitas
sperma, lebih banyak berasal dari respirasi sistem respirasi oksidatif mitokondria
&2)&S bila dibandingkan dengan glikolisis, dilakukan dua macam percobaan.
)ercobaan pertama menggunakan mencit yang mengalami kelainan ekspresi en/im
gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenase dan percobaan kedua menggunakan mencit
transmitokondria mitomice yang memba7a mt46* patogen mt 46*. !itomice
ini merupakan mencit yang mengalami delesi ' bp dari posisi nukleotida ??>' bp
pada gen t "NA#ys yang berpindah translokasi ke posisi 1+> pada gen ND$ mutan
mt 46* ini sama seperti pada manusia dengan penyakit yang umum teradi akibat
delesi pada mt 46*. )enelitian membuktikan bah7a akumulasi mutasi pada mt46*
menginduksi oligo/oospermia dan astheno/oospermia. Sebagian besar mitomice
adalah infertil dan pengamatan pada testis menunukkan berhentinya proses meiosis
pada tahap /igoten, uga teradi peningkatan apoptosis.
Sekitar 1181+% dari kasus infertilitas, mt46* mengalami mutasi titik point
mutation yang spesifik pada daerah kompleks I 64> yaitu pada urutan nukleotida
11?1' dan kompleks ID A&I pada nukleotida '0>>.1.3 ;eberapa laporan lainnya
menyatakan bah7a astheno/oospermia dan oligo/oospermia berkaitan dengan mutasi
titik, delesi berulang, substitusi, polimorfisme nukleotida tunggal haplogroup, delesi
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
14/30
pada alel 46* polimerase γ mitokondria, dan mutasi pada glutathion %transferase
!&. >
!utasi yang teradi pada n46*, bisa menyebabkan mitokondria cacat, karena
sel cenderung mengalami delesi berulang pada mt46*. !utasi ini berakibat pada
kelainan fungsi respirasi sebagai akibat koordinasi ekspresi gen dari genom nukleus
dan mitokondria. oordinasi antara genom nukleus dan mitokondria uga dinyatakan
oleh )anloup dkk +003, bah7a penurunan umlah copy mt46* pada sampel sperma
dari pasien infertil merupakan akibat dari penurunan faktor transkripsi * tfam dari
n46* yang mengkode banyaknya copy mt46*.
4elesi dari protein kapsul mitokondria yang disebut mitochondrial capsule
selenoprotein !scp dan sperm mitochondriaassociated cysteinerich proteinSmcp, dapat mempengaruhi motilitas sperma meskipun sperma tampak normal secara
morfologis. Sedangkan mutasi gen n46* yang mengkode mitochondrial 'oltage
dependent anion channel 3 Ddac3 pada membran luar mitokondria, menyebabkan
flagela abnormal yang mengganggu motilitas sperma selama transit ke epididimis.
*kumulasi mutasi polimorfisme pada mt46* teradi sekitar 10 8 1? kali lebih
cepat daripada n46*.1 )olimorfisme gen γ polimerase )&"J+>.1?,1(
)olimorfisme nukleotida tunggal S6) mitokondria +1A merupakan hasil
perubahan satu asam amino histidin yang disubstitusikan ke tirosin pada subunit 641
dari ompleks I 6*4 ubi+uinone oxidoreductase. *lel dari +1A ini
diasosiasikan dengan infertilitas pria akibat astheno(oospermia, diabetes insipidus,
diabetes melitus, atrophy optik, tuli, dan #ebers hereditary optic neuropathy.
)olimorfisme mitokondria *103'(< mengubah threonin menadi alanin subunit 643
dari 6*4 dehidrogenase, yang diasosiasikan dengan neurodegeneratif dan penyakit-
penyakit akibat berkurangnya produksi energi atau meningkatnya produk radikal
bebas. )olimorfisme *'1?< menyebabkan perubahan urutan asam amino asparagin
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
15/30
ke asam aspartat pada subunit 64+ kompleks I yang menyebabkan peningkatan #&S
dan merusak mt46* dan n46*.
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
16/30
III
METODE PENELITIAN
ntuk melihat peranan genetik 46* mitokondria pada infertilitas pria berupa gangguan
motilitas spermato/oa, dilakukan dua pendekatan @
1. Anali&a kadar -idrogen )erok&ida )ada &een dengan arian T1/10
engg%nakan etoda keil%i&en&i.
4ipilih Semen dengan 9arian 11('A mt46*. arena 9arian ini merupakan
bagian 46* mitokondria yang sangat 9ariable pada semen, mengandung
homopolimerik sitosin antara nt 11(811'3 ;endall and Sykes, 1''>. Darian ini
berhubungan dengan kelainan energy mitokondria melalui suatu proses respirasi
fosforilasasi oksidatif. )enurunan fungsi &2)&S berhubungan dengan gangguan
replikasi, yang menyebabkan umlah *) menurun ;ro7n dan $allace, 1''3 yang
akan berdampak pada penurunan motilitas. 4isamping itu, idrogen peroksida yang
merupak #&S #eacti9e &5ygen Spesies terbentuk akibat adanya penurunan *) yang
dihasilkan pada kasus mutasi mt46* Scri9er et al, 1''>: Sohal and ;runk, 1''+:
Aahill et al., 1''?: #ichter, 1''+ . Sehingga dengan dua pendekatan ini,dengan
menggunakan uibeda makna t-test antara kadar hidrogen peroksida pada 9arian 11('
A dan non 9arian 11(', akan diteliti gambaran pengaruh hidrogen peroksida pada
motilitas spermato/oa.
>0 sampel semen yang diambil secara acak dari pasien yang datang rutin di poli
Infertilitas #umah sakit ;udi !ulia, Surabaya untuk kontrol kualitas semen ditentukan
konsentrasi dan motilitas spermato/oanya menurut petunuk laboratorium $& 1''+.
Semen dari sampel yang ada tergolong normo/oospermia sperma normal dan
asteno/oospermia motilitas sperma rendah. emudian masing-masing sampel ditentukan enis 9ariannya,lalu masing-masing diui kadar hidrogen peroksidanya. 4ari
data kadar hidrogen peroksida 9arian 11('A dan data kadar hidrogen peroksida
negatif 9arian tersebut pada golongan normo/oopernia dibandingkan dengan ui t,
begitu pula pada golongan asthenospermia. 4ari hasil analisa akan dilihat pengaruh
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
17/30
50
14
Pe
n
en
t
u
a
n
El
e
kt
r
o
f
o
r
es
i
s
(+
)
Va
r i
a
n
T
1
61
8
9
Pe
n
en
t
u
a
n
(-
)
Va
r
i
a
n
T
16
1
8
Pe
n
en
t
u
a
n
U j
i
6
Pe
n
en
t
u
a
n
El
e
kt
r
o
f
o
r
es
i
s
(+
)
Va
r i
a
n
T
1
61
8
9
Pe
n
en
t
u
a
n
(-
)
Va
r
i
a
n
T
16
1
8
Pe
n
en
t
u
a
n
U j
i
hidrogen peroksida pada motilitas spermato/oa. *dapun kerangka operasional seperti
diba7ah ini@
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
18/30
ntuk dapat dilakukan analisa #F") restriction fragment length polymorphism,
diperlukan sampel berupa 46*, sehingga semen harus dipreparasi untuk mengisolasi
46*, dengan cara diba7ah ini.
I&ola&i DNA
Prin&i) i&ola&i tDNA#
mt46* yang terdapat dalam mitokondria, di dalam sel pada sampel semen
diisolasi dengan cara osmotic shok untuk melisis membrane sel, kemudian melisis
protein semen menggunakan en/im proteinnase , 4, dan S4S. Setelah protein dan
membrane sel lisis, mt46* akan keluar dari sel dan berada di larutan. ntuk
memisahkan protein, lemak, dan mt46* dilakukan ekstraksi menggunakan fenol-
chloroform dalam buffer tris Al. Sehingga lemak dan protein yang telah lisis akan
cenderung berada di fasa organik dan mt46* yang bersifat lebih polar akan berada di
fasa air. 4engan bantuan sentrifugasi kedua fasa Ini dipisahkan, dan untuk
menghilangkan pengotor yang terlarut difasa air dan memekatkan mt46* dilakukan
pengendapan 46* menggunakan etanol pada suhu rendah. 4an untuk menghilangkan
sisa pelarut, pengeringan pelarut dilakukan dengan menggunakan 9acuum speed9ac,
hal ini dilakukan untuk menghindari degradasi mt46*. *dapun diagram alir isolasi
mt46* adalah seperti diba7ah ini @
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
19/30
A)li'ika&i DNA
ntuk dapat dilanutkan ke proses penentuan 9arian 11('A, diperlukan
mt46* dalam konsentrasi yang tinggi, maka dilakukan )A# dari hasil isolasi mt46*
sperma.
Prin&i) PR %nt%k enga)li'ika&i arian T1/10#
mt46* sebagai template 46* diperbanyak secara in9itro sebanyak 3> kali
siklus, dengan temperature denaturasi 46* untai ganda pada '> A selama 10 menit,⁰
tahap penempelan primer spesifik untuk 9arian ini menggunakan pasangan primer
"1>'0 >KA***A*AA*
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
20/30
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
21/30
Setelah diamplifikasi, 46* dideteksi secera elektroforesis pada 1,>% gel
agarosa dengan 9oltase 100D selama 30 menit dan di7arnai dengan etidium bromide
dan diamati diba7ah sinar u9. Disualisasi mobilitas 46* hasil amplifikasi dilakukan
dengan membandingkan terhadap 46* standar yang dibuat dari 46* lamda phage
yang dipotong dengan aeIII sehingga menghasilkan beberapa potongan 46* dengan
ukuran tertentu yang diketahui. *dapun skema 9isualisasi hasil )A# adalah sebagai
berikut@
Penent%an arian T1/10 tDNA
1 lg fragmen 46* yang telah diamplifikasi didigesi menggunakan en/im
restriksi !n"1 pada temperature 3?9A semalam 1-1( am. asil digesti dipisahkan
dengan cara elektroforesis agarosa dan di9isualisai dengan cara mengamati fragmen
hasil elktroforesis yang telah diba7arnai dengan etidium bromide di ba7ah sinar D.
Penent%an kon&entra&i -idrogen )erok&ida
Prin&i) )enent%an kon&entra&i -idrogen )erok&ida#"uminol adalah >-amino-+,3-dihidro-1,-phthala/inedione. etika digunakan bersama
hidrogen peroksida, salah satu cincin pada molekul luminol akan terbuka, melepaskan gas
nitrogen dan menghasilkan senya7a yang dikenal sebagai 3-aminophthlate dalam keadaan
$:ati ;ita %.$
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
22/30
tereksitasi. Seenak kemudian, 3-*)*L melepaskan photon dan menghasilkan cahaya 9iolet
kebiruan berpendar. es dilakukan pada ruangan gelap agar cahaya yang dihasilkan dapat
dilihat dengan elas. *dapun diagram kera sebagai berikut @
2. Anali&a kadar 04-idrok&i4deok&ig%ano&in engg%nakan etoda HPL.
Sebelum dilakukan analisa (-hidroksi-deoksiguanosin, sampel diambil secara acak dari donor
sprma pada poli infertilitas rumah sakit ;udi !ulia, Surabaya, ditentukan konsentrasi dan
motilitasnya menurut petunuk $&, dan dilakukan isolasi 46* dengan cara yang sama
seperti metode sebelumnya.
Penent%an 04-idrok&i4deok&ig%ano&in
Prin&i)#
mt46* yang telah diisolasi difragmentasi dengan natrium asetat dan didigesti dengan
nuclease-)1, hasil fragmentasi dianalisa dengan menggunakan )"A. orelasi antara (-
hidroksi-deoksiguanosin dengan motilitas spermato/oa menggunakan ui korelasi dan ui
beda makna menggunakan t-test dan nilai batas denan #&A cur9e. *dapun alur kera
sebagai berikut@
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
23/30
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
24/30
I3
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Anali&a kadar -idrogen )erok&ida )ada &een dengan arian T1/10
engg%nakan etoda keil%i&en&i.
Penent%an arian T1/10 tDNA
*nalisa 9arian digunakan dengan metode )A#-#F") dengan menggunakan
en/im restriksi !n"I pada fragmen mt46* sepanang 3 pb denganpasang primer
"1>'0-1>0. *da tidaknya situs restriksi ditentukan oleh ukuran fragmen 46*.
asil dinyatakan dengan tanda positif dan negati9e, diba7ah ini pada alur 1 dan 3
menunukkan mt46* dengan 9arian sepanang 11( dan 3+1 pb. Sedangkan tandanegati9e menunukkan mt46* bukan 9arian11('A sepanang +( dan 11( pb
pada alur 1 dan +. eteroplasmi diperoleh apabila ada ketiga fragmen 11(,+(, dan
3+1 pb pada laur seperti yang terlihat pada gambar diba7ah.
asil analisis 9arian menunukkan dari 1 semen astheno/oospemia yang
mengalami 9ariasi 11('A sebanyak ? sampel dan yang tidak ? sampel. Sedangkan
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
25/30
untuk semen normo/oospermia yang mengalami 9ariasi 11('A sebanyak 1'
sampel dan yang lain tidak.
)ada analisis 9ariasi 11('A mt46a, sampel semen normospermia
diperoleh hasil positi9e hal ini karena sampel semen normospermia dan
asteno/oospermia terdiri dari campuran motilitas spermato/oa tanpa dipisahkan
dahulu.
Penent%an kadar Hidrogen Perok&ida
ntuk persen motilitas spermato/oa motil terlihat seperti tabel diba7ah ini@
)ada normospermia dan asteno/oospermia teradi perbedaan yang bermakna, dapat
dielaskan bah7a adanya 9arian 11('A mt46* mempunyai hubungan dengan
meningkatnya total hidrogen peroksida. Sifat #&S dari hidrogen peroksida adalah
oksidator yang dapat mengoksidasi 46*, dan berpengaruh pada motilitas
spermato/oa yang merupakan salah satu penyebab fertilitas.
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
26/30
2. Anali&a kadar 04-idrok&i4deoki&g%ano&in engg%nakan etoda HPL.
*nalisa konsentrasi dan motilitas sperma
4ari >3 sampel yang diambil secara acak, 1 tergolong asthenospermia motilitas rendah,
oligospermia umlah sperma kurang, dan 3> normo/oospermia, dengan kossentrasi dan
motilitas seperti berikut.
abel diatas menunukkan motilitas dan kualitas sperma yang rendah pada
asthenospermia dan oligospermia bila dibandingkan dengan normo/oospermia.
Selanutnya dilakukan penentuan konsentrasi (-hidroksi-deokisguanosin menggunakan
metoda )"A, dengan data seperti tabel diba7ah ini@
abel diatas menunukkan bah7a konsentrasi (-hidroksi-deokisguanosin paling tinggi
pada oligospermia, diikuti dengan asthenospermia dan normo/oospermia. al ini
dielaskan bah7a kelainan sperma dapat dilihat dari konsentrasi (-hidroksi-
deokisguanosin dan menunukkan bah7a kerusakan 46* dalam hal ini guanine
menghasilkan (-hidroksi-deokisguanosin akibat oksidasi #&S lebih tinggi di
oligospermia dan asthenospermia daripada normo/oo/permia.
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
27/30
4ari gambar 1 diatas, terlihat hubungan antara konsentrasi (-hidroksi-deokisguanosin
dengan % motilitas sperma yang berbanding terbalik.
*dapun nilai batasnya, bah7a sperma dengan kadar (-hidroksi-deokisguanosin di
atas nilai ambang 3,?' fmolGng 46* termasuk sperma yang tidak normal. al
ini disebabkan kadar (-hidroksi-deokisguanosin berbanding terbalik dengan motilitas
sperma, dan tingginya (-hidroksi-deokisguanosin merupakan salah satu indicator
kerusakan 46*. *dapan kur9a nilai batas terlihat pada gambar diba7ah ini.
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
28/30
3
PENUTUP
,.1 "e&i)%lan
a. !utasi mt46* merupakan salah satu faktor penyebab infertilitas pada pria, yang
dapat menyebabkan astheno(oospermia, oligo(oospermia, dan terato(oospermia.
!utasi ini antara lain menyebabkan berkurangnya energi dari proses fosforilasi
oksidatif &2)&S yang sangat diperlukan dalam proses spermatogenesis dan
motilitas sperma.
b. *danya mutasi mt46* di samping mengakibatkan menurunnya *), akan
diperoleh "eacti'e )xygen %pecies#&S antara lain hidrogen peroksida yang
tinggi. ingginya konsentrasi hidrogen peroksida pada semen dengan 9arian
11('A mempunyai hubungan dengan menurunnya motilitas spermato/oa.
c. asil akhir dari oksidasi 46* adalah senya7a (-&-d
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
29/30
DA$TAR PUSTA"A
*rtika, I!. +003. %truktur, fungsi dan biogenesis mitokondria. Cikman "ecture Series I@
!itochondrial medicine. "embaga ;iologi !olekul Cikman =akarta@1?-+.
;ro7n !4 dan $allace 4A, 1''3. *enetic approaches to mitochondria DNA disease of
oxidati'e phosphorylation.
olstein *F, Schul/e $, 4a9idoff !. +003. -nderstanding spermatogenesis is a
prere+uisite for treatment . #eprod ;iol Cndocrinol 1@10?.
orai S dan ayasaka , 1''0, ntraspecific nucleotide se+uence difference in the ma/or
noncoding region of human mitochondria DNA, *merican =ournal of uman . !itochondrial deoxyribonucleic acid 0122bp deletion
is associated with diminished fertility and motility of human sperm, 3iology of
"eproduction, >+@ ?1+'8?3.
"odish , ;erk *S, Bipursky ", !atsudaira ), ;altimore 4, 4arnell =. +000. !olecular
4ell 3iology. $. . Freeman and Aompany.
St. =ohn =A, =okhi #), ;arratt A"#. +00>. The impact of mitochondrial genetics on male
infertility. Int. =. *ndrol +(@>-?3.
Sies dan !enck, 1''+. %inglet oxygen induced DNA damage,!utation "esearch, +?>@ 3?8
3?>.
Sohal #S dan ;runk , 1''+. !itochondrial production of prooxidants and cellular
senescence, !utation "esearch, +?>@ +'>830.
Sudoyo, . +003. Polimorfisme DNA mitokondria dan kedokteran forensik . Cikman
"ecture Series I@ !itochondrial medicine. "embaga ;iologi !olekul Cikman
=akarta@3->.
-
8/9/2019 PERAN DNA MITOKONDRIA PADA INFERTILITAS PRIA
30/30
Sudar7o,+00. 5hidroksideoksiguanosin %ebagai %alah %atu ndikator nfertilitas Pria.
Fakultas Farmasi ni9ersitas *irlangga, Surabaya.
Sudar7o,+00. !eningkatnya Hidrogen Peroksida Pada 6arian T&7&514 mtDNA %emen
!anusia. Fakultas Farmasi ni9ersitas *irlangga, Surabaya.
Sumiarsih, . +010. Peran *enetik DNA !itokondria 8mtDNA9 Pada !otilitas
%permato(oa, !aalah esehatan )harma!edika, =akarta.
ipto, +00(. :a/ian nfertil Pria di #aboratorium nfertil; Andrologi Puslitbang %istem dan
:ebi/akan :esehatan%urabaya, T ahun