AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN KELADI
TIKUS (Typhonium flagelliforme Lodd. Blume) TERHADAP SEL KANKER
KOLON WiDr MELALUI PENEKANAN EKSPRESI PROTEIN COX-2
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Handika Immanuel
NIM : 118114083
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2015
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
i
AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN KELADI
TIKUS (Typhonium flagelliforme Lodd. Blume) TERHADAP SEL KANKER
KOLON WiDr MELALUI PENEKANAN EKSPRESI PROTEIN COX-2
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Handika Immanuel
NIM : 118114083
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2015
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
KOLOSE 3 : 23
“Apapun juga yang kamu perbuat, perbuatlah dengan segenap hatimu
seperti untuk Tuhan dan bukan untuk manusia”
Kupersembahkan Karyaku untuk :
Bapa Di Surga
Papa, Mama, Dede
Para Sahabat
Almamaterku
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PRAKATA
Syukur bagi Allah Tritunggal karena atas anugrah dan rahmat-Nya Penulis
dapat menyelesakan skripsi ini dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi
salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) program studi
Farmasi.
Penulis telah banyak menerima dukungan selama proses perkuliahan,
penelitian dan penyusunan skripsi. Oleh karena itu, Penulis ingin mengucapkan
terima kasih kepada :
1. Aris Widayati selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta
2. Agustina Setiawati, M.Sc, Apt. selaku Dosen Pembimbing yang telah
memberikan waktu, bimbingan, pengarahan, serta masukan kepada Penulis
dalam penyusunan skripsi.
3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., Apt., selaku Dosen Penguji yang telah
memberikan waktu, masukan, kritik dan saran kepada Penulis.
4. Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., selaku Dosen Penguji yang telah
memberikan waktu, masukan, kritik dan saran kepada Penulis.
5. Segenap Dosen dan Karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma yang telah mengajar, membantu dan membimbing penulis selama
perkuliahan.
6. Gigih Prayoga, Tjok Gede Perdana Wiguna, dan Mery Tri Utami sebagai
rekan satu tim atas kerjasama, persahabatan, bantuan dan kebersamaan
selama proses penyusunan skripsi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
7. Angky Glori, Henra, Canly Hansen Sudirman, Andre Salim, Prasetyo
Handy Kurniawan, Andrian, Surya Adhi Nugraha, Vina Alvionita Susilo,
Ester Rina Dwi Astuti, Laurensia Jessie Loreta, Fransisca Andriani, Verni
Emelia, Greta Paulina, Gabriella Septiana, Giacinta Puspananda, atas
dukungan dan doa dalam skripsi ini.
8. Teman-teman angkatan 2011 terkhusus Kelas FSM B 2011 dan FST A
2011 atas keceriaan dan kebersamaan yang tidak akan terlupakan.
9. Teknisi Laboratotium Parasitologi dan Team CCRC UGM yang telah
membantu dalam penelitian ini.
10. Bagian Instalasi Patologi Anatomi RSUP Dr. Sardjito Yogyakarta yang
telah membantu dalam penelitian ini.
11. Pihak lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu oleh Penulis.
Penulis menyadari bahwa didalam skripsi ini masih ada
kekurangan. Oleh karena itu, Penulis mengharapkan saran dan kritik yang
membangun dari seluruh pihak. Semoga skripsi ini memberikan manfaat
bagi kita semua.
Yogyakarta, 29 Januari 2015
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ................................................................................ i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................ ii
HALAMAN PENGESAHAN ................................................................... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................ iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .................................................... v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA
ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ................................... vi
PRAKATA ............................................................................................... vii
DAFTAR ISI ............................................................................................ ix
DAFTAR TABEL .................................................................................... xiv
DAFTAR GAMBAR ................................................................................ xv
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................. xvi
INTISARI ................................................................................................. xvii
ABSTRACT ............................................................................................... xviii
BAB I. PENGANTAR .............................................................................. 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
A. Latar Belakang ................................................................................ 1
1. Perumusan masalah ................................................................. 5
2. Keaslian penelitian .................................................................. 6
3. Manfaat penelitian ................................................................... 6
B. Tujuan Penelitian ............................................................................. 7
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA .............................................................. 8
A. Kanker Kolon. ................................................................................. 8
1. Definisi dan karsinogenesis kanker kolon ................................ 8
2. Jalur APC / -catenin .............................................................. 9
3. Mutasi K-Ras .......................................................................... 9
4. SMAD-4 dan TP53 ................................................................. 10
B. COX-2 dan Kanker Kolon ............................................................... 11
C. WiDr ............................................................................................... 14
D. Tanaman Keladi Tikus ..................................................................... 15
1. Deskripsi tanaman ................................................................... 15
2. Klasifikasi tanaman ................................................................. 16
3. Nama daerah ........................................................................... 16
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
4. Kandungan fitokimia ............................................................... 16
E. Doksorubisin ................................................................................... 17
F. Apoptosis dan Nekrosis .................................................................... 18
G. Uji sitotoksik dengan metode MTT .................................................. 20
H. Uji Apoptosis Double Staining ........................................................ 22
I. Uji Imunositokimia .......................................................................... 23
J. Landasan Teori ................................................................................ 24
K. Hipotesis ......................................................................................... 25
BAB III. METODE PENELITIAN ........................................................... 26
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ....................................................... 26
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ................................... 26
1. Variabel utama ........................................................................ 26
2. Variabel pengacau ................................................................... 26
3. Definisi operasional................................................................. 27
C. Bahan Penelitian .............................................................................. 27
D. Alat Penelitian ................................................................................. 28
E. Tata Cara Penelitian ......................................................................... 28
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
1. Determinasi tanaman keladi tikus. .......................................... 28
2. Sterilisasi alat ......................................................................... 29
3. Pembuatan simplisia. .............................................................. 29
4. Ekstraksi daun keladi tikus dengan maserasi. .......................... 29
5. Pembuatan media kultur ......................................................... 29
6. Uji sitotoksisitas daun keladi tikus dengan metode MTT. ....... 30
7. Uji induksi apoptosis dengan metode double staining ............. 32
8. Pengamatan ekspresi protein dengan metode imunositokimia . 33
F. Tata Cara Analisis Hasil ................................................................... 36
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................. 38
A. Penyiapan Ekstrak Keladi Tikus ...................................................... 38
B. Uji Sitotoksik Ekstrak Etil Asetat Daun Keladi tikus Terhadap
Sel Kanker Widr…………............................................................... 40
C. Uji Apoptosis Ekstrak Etil Asetat Daun Keladi Tikus dengan
Metode Double Staining…………………………………………… 45
D. Uji Imunositokimia COX-2 akibat perlakuan ekstrak……………… 48
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ................................................... 52
A. Kesimpulan ..................................................................................... 52
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
B. Saran ............................................................................................... 52
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 53
LAMPIRAN ............................................................................................. 59
BIOGRAFI PENULIS……………………………………………………... 79
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
DAFTAR TABEL
Tabel I. Distribusi sel WiDr pada uji apoptosis dengan metode
double staining ....................................................................... 48
Tabel II. Jumlah rata-rata sel yang mengekpresikan COX-2
dalam tiap perlakuan ............................................................... 50
Tabel III. Hasil uji statistik kebermaknaan antara perlakuan yang
diberikan dengan kontrol sel……………………………… .... 50
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Tahapan Karsinogenesis pada Kanker Kolon ........................... 11
Gambar 2. Pengaruh ekspresi COX-2 pada kanker kolorektal ................... 13
Gambar 3. Tanaman Keladi Tikus ............................................................ 15
Gambar 4. Struktur kimia doksorubisin…………………………………... 18
Gambar 5. Reaksi MTT menjadi Formazan .............................................. 22
Gambar 6. Kurva hubungan viabilitas sel vs log konsentrasi ekstrak daun
keladi tikus…………………………………………………… 43
Gambar 7. Efek sitotoksik ekstrak daun keladi tikus terhadap sel kanker
kolon WiDr…………………………………………………... 44
Gambar 8. Hasil Uji double staining ekstrak keladi tikus .......................... 46
Gambar 9.Hasil Imunositokimia sel kanker kolon WiDr ........................... 51
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Distribusi sel WiDr pada uji apoptosis dengan metode
double staining………………………………………. 60
Lampiran 2. Hasil Perhitungan Uji Ekspresi Protein dengan metode
Imunositokimia………………………………………… 62
Lampiran 3. Pengolahan data uji sitotoksik MTT assay………........ 63
Lampiran 4. Dokumentasi uji sitotoksik MTT assay……………….. 66
Lampiran 5. Dokumentasi uji double staining……………………… 67
Lampiran 6. Dokumentasi uji imunositokimia……………………… 69
Lampiran 7. Hasil analisis statistik pada uji imunositokimia dengan
Program R………………………………………………. 72
Lampiran 8. Perhitungan IC50 Doksorubisin dengan program R…… 76
Lampiran 9. Perhitungan IC50 ekstrak keladi tikus dengan program R 77
Lampiran 10. Surat keterangan determinasi tanaman keladi tikus…. 78
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvii
INTISARI
Obat antikanker yang sudah beredar sekarang ini memiliki efek samping
yang cukup besar bagi konsumen karena rendahnya selektivitas dari obat-obatan
tersebut. Eksplorasi bahan alam yang lebih aman namun tetap memiliki efek
terapi dapat dijadikan alternatif dari kemoterapi. Banyak tanaman khususnya di
Indonesia yang memiliki potensi antikanker, salah satunya adalah keladi tikus
(Typhonium flagelliforme Lodd. Blume).
Tujuan dari penelitian ini adalah menguji aktivitas antikanker ekstrak
etil asetat daun keladi tikus terhadap sel kanker kolon WiDr dan mengetahui
potensinya dalam menghambat produksi enzim siklooksigenase 2 (COX-2), enzim
yang meningkatkan kemampuan invasi dari kanker kolon. Penelitian ini
merupakan jenis eksperimental murni dengan menggunakan rancangan acak
lengkap pola searah. Uji aktivitas sitotoksik dilakukan dengan menggunakan
metode in vitro MTT assay dan dihitung inhibitory concentration 50 (IC50) dari
ekstrak uji menggunakan program statistik R-2.14.0. Dilakukan uji double staining
untuk mengetahui penyebab kematian sel dan kemudian dilakukan uji
imunositokimia untuk melihat kemampuan ekstrak dalam menghambat ekspresi
enzim COX-2.
Hasil uji sitotoksik terhadap sel WiDr dengan metode MTT menunjukan
nilai IC50 ekstrak etil asetat daun keladi tikus sebesar 102 g/mL. Hasil uji
apoptosis dengan double staining menunjukan ekstrak etil asetat keladi tikus
menginduksi apoptosis, dan hasil uji imunositokimia menunjukan bahwa ekstrak
etil asetat daun keladi tikus menekan ekspresi protein COX-2.
Kata kunci : daun keladi tikus, sel kanker kolon WiDr, COX-2, apoptosis, Uji
sitotoksik, IC50, Double Staining, Imunositokimia
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xviii
ABSTRACT
Anticancer drugs that are marketed today have considerable side effects
for patient because of the low selectivity of these drugs. In terms of reducing these
side effects, exploration of natural materials that are safer but still has a
therapeutic effect can be used as an alternative to chemotherapy. Many plants
especially in Indonesia has the potential anticancer activity, one of which is a
rodent tuber (Typhonium flagelliforme Lodd. Blume).
The purpose of this study was to test the anticancer activity of the ethyl
acetate extract of rodent tuber leaves against WiDr colon cancer cells and to
investigate the potential of the extract in inhibiting the production of the
cyclooxygenase 2 (COX-2), an enzyme that increases the ability of invasion of
colon cancer. This study is a purely experimental design was completely
randomized with a unidirectional pattern. Cytotoxic activity test performed by in
vitro using MTT assay and the IC50 of the extract using the R program. To
investigate the cause of death of the cells, the double staining assay are performed
and then the imunocytochemistry test are performed to investigate whether the
extract has the potential in inhibiting the expression of COX-2 enzyme.
The result of the cytotoxicity MTT assay showed that the value of the
extract is 102 g/mL. The result of double staining assay showed that the exract
of rodent tuber induces apoptosis, and the result of immunocytochemistry assay
showed that the ethyl acetate extract of rodent tuber suppress COX - 2 protein
expression.
Keywords : rodent tuber leaves, WiDr colon cancer, COX-2, apoptosis,
cytotoxicity assay, IC50, double staining, immunocytochemistry
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Kanker kolon merupakan salah satu penyakit yang mematikan. World
Cancer Report WHO melaporkan bahwa sekitar 944.717 kasus ditemukan di
seluruh dunia pada tahun 2000. Insiden yang tinggi pada kasus kanker kolorektal
ditemukan di negara Amerika Serikat, Eropa, Australia, sedangkan insiden yang
rendah ditemukan di negara India dan Aljazair. Diperkirakan sebanyak 153.760
kasus baru yang terdiagnosa kanker kolorektal, yang terdiri dari 112.340 pasien
yang terdiagnosa kanker kolon dan sisanya yaitu 41.420 merupakan pasien
terdiagnosa kanker rektal pada tahun 2007 dan tercatat sekitar 30.000 pasien
meninggal karena kanker kolon pada tahun 2010 (Chang, 2012). American Cancer
Society memperkirakan terdapat 96.830 kasus baru kanker kolon dan 40.000
kasus baru untuk kanker rektal pada tahun 2014 dan diperkirakan menyebabkan
kematian sebanyak 50.310 orang (American Cancer Society, 2014).
Pembentukan dan progresi kanker kolon dipengaruhi oleh enzim
siklooksigenase-2 (COX-2), suatu enzim yang mengatur sintesis prostaglandin
dan di ekspresikan secara berlebih pada daerah inflamasi dan pada beberapa
kanker jaringan epitel (Sinicrope and Gill, 2004). Kakiuchi et al. (2002)
melaporkan bahwa mRNA COX-2 dan tingkat proteinnya meningkat pada
jaringan kolon pasien yang menderita kanker kolon dan penggunaan inhibitor
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
COX-2 dapat mencegah terbentuknya polip baru pada kanker kolon. Hal ini
dibuktikan dalam penelitian yang dilakukan Koehne and Dubois (2004).
Pada umumnya, kanker kolon dapat ditangani dengan pembedahan, dan
harus dilakukan terapi non invasif lainnya. Kemoterapi disertakan apabila
penyakit tersebut telah menyebar ke nodus limfa dan jaringan lain (Yeatman,
2001). Terapi menggunakan sulindac yang merupakan obat golongan Non Steroid
Anti Inflammatory Drug (NSAID) (Waddel and Loughry, 1989) atau inhibitor
COX-2 lainnya menunjukan penurunan jumlah polip sebesar 30% dalam enam
bulan pemakaian (Steinbach et al, 2000).
Kekurangan dalam terapi NSAID untuk pengobatan kanker antara lain
pada penggunaan aspirin dengan dosis relatif yang kecil dapat mengakibatkan
efek samping yang serius pada ginjal dan saluran pencernaan (Ranke et al., 1994).
Efek samping tersebut meningkat pada pasien dengan usia lanjut. Efek samping
yang biasa terjadi adalah dyspepsia, ulkus peptikus, dan perdarahan
gastrointestinal (Scheiman, 1996). Pengobatan kanker merupakan pengobatan
dalam jangka panjang dan oleh sebab itu, terapi dengan NSAID tidak disarankan
dan perlu terus dikembangkan usaha pengembangan obat yang aman dan efektif,
salah satunya melalui eksplorasi bahan alam.
Indonesia memiliki kekayaan bahan alam yang beragam, dan beberapa
diantaranya telah diketahui memiliki aktivitas antikanker, salah satunya tanaman
keladi tikus. Tanaman keladi tikus telah sejak lama digunakan di Malaysia secara
oral dalam bentuk juice atau serbuk untuk mengatasi kanker usus, payudara dan
hati (Chan, 2005). Kemampuan tanaman keladi tikus dalam menyembuhkan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
beberapa kanker seperti kanker payudara dan kanker rahim telah banyak
dibuktikan secara ilmiah, namun sampai saat ini pengujian yang memberikan
bukti ilmiah mengenai kemampuan tanaman keladi tikus yang dapat
menyembuhkan kanker kolon belum banyak dilakukan.
Farida, Wahyudi, Wahono, dan Hanafi (2012) berhasil mengisolasi
glikosida flavonoid dari ekstrak etil asetat daun keladi tikus. Senyawa glikosida
flavonoid yang didapatkan adalah 6-glucosyl apigenine. Wang et al (2011) dalam
penelitiannya membuktikan bahwa apigenin memiliki aktivitas menginduksi
apoptosis terhadap sel kanker kolon namun besarnya nilai inhibitory
concentration (IC50) tidak disebutkan. Penelitian ini menguji aktivitas antikanker
ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel kanker kolon WiDr (Colorectal
adenocarcinoma cell line).
Sel WiDr dipilih karena memiliki kelebihan yaitu mudah dikulturkan dan
memiliki doubling time yang singkat bila dibandingkan dengan kultur sel kanker
kolon lainnya. Sel ini juga memiliki platting efficiency yang tinggi (Noguchi et
al., 1979) dan mengekspresikan COX-2 dengan jumlah yang tinggi (Palozza et
al., 2005).
Uji thiazoyl blue tetrazolium bromide atau uji MTT yang merupakan uji
sitotoksisitas yang dilakukan secara in vitro dilakukan dalam penelitian ini untuk
mengetahui kemampuan antikanker ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap
sel kanker kolon WiDr. Uji ini dipilih karena memiliki tingkat sensitivitas yang
lebih tinggi dari uji sitotoksik lainnya yaitu lactate dehydrogenase (LDH) assay,
neutral red assay, dan protein assay (Fotakis and Timbrell, 2006). Hasil uji ini
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
berupa data absorbansi yang menggambarkan viabilitas dari sel yang diuji dan
kemudian digunakan untuk menentukan inhibitory concentration 50 (IC50), yang
merupakan konsentrasi minimal ekstrak daun keladi tikus yang dapat
menghambat 50% sel kanker kolon.
Kriteria yang perlu diperhatikan dalam eksplorasi bahan alam tidak
hanya potensinya namun juga selektifitasnya. Suatu agen antikanker dikatakan
selektif apabila dapat menginduksi apoptosis pada sel target (Cui, Wang, Wang,
Zhao, and Peng, 2013) sehingga penelusuran jalur kematian sel perlu dilakukan.
Metode yang dilakukan dalam uji apoptosis dalam penelitian ini adalah double
staining, yaitu dengan menggunakan dua buah reagen pewarna sel yang memiliki
karakteristik pewarnaan yang berbeda (Helberstadt and Emerich, 2007).
Apoptosis dalam suatu sel dapat dihambat oleh beberapa faktor antara
lain mutasi yang berakibat ketidaknormalan jalur pengaturan apoptosis dan
keberadaan protein tertentu yang juga menghambat terjadinya apoptosis,
menyebabkan sel berproliferasi secara terus-menerus. Penghambatan apoptosis
yang terjadi pada kanker kolon diperantarai oleh COX-2 yang banyak terkandung
pada kanker kolon. COX-2 yang berlebih meningkatkan prostaglandin (PGE -2)
yang dapat memicu ekspresi BCl -2 antiapoptosis (Damstrup et al., 1999). COX-2
dalam kanker kolon dapat dijadikan sebagai target terapi antikanker. Jika COX-2
dihambat, maka sel kanker kehilangan kemampuannya untuk terhindar dari
apoptosis dan mengalami kematian. Uji imunositokimia dilakukan untuk
mengetahui kemampuan ekstrak etil asetat daun keladi tikus dalam menghambat
ekspresi protein COX-2.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
Doksorubisin merupakan agen kemoterapi yang telah banyak dipakai
dalam pengobatan berbagai jenis kanker. Bersifat sitostatik dan menginduksi
apoptosis pada sel kanker kolon melalui fosoforilasi p53, induksi p21,
penghambatan siklus sel pada fase Gap-2 (G2) dan meningkatkan ekspresi protein
proapoptosis yaitu BCl -2 associated X Protein (BAX) (Lupertz, Watjen, Kahl,
and Chovolou, 2010). Hal tersebut mendasari pemilihan doksorubisin sebagai
kontrol positif dalam penelitian ini. Penelitian ini dilakukan untuk menguji
ekstrak etil asetat daun keladi tikus secara in vitro menggunakan metode uji
sitotoksik MTT assay, yang diperkuat oleh uji apoptosis double staining dan uji
immunocytochemistry (ICC) serta membandingkan kemampuannya dengan
doksorubisin.
1. Perumusan masalah
a. Berapa IC50 ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel kanker kolon
WiDr?
b. Apakah ekstrak etil asetat daun keladi tikus menginduksi apoptosis pada sel
kanker kolon WiDr?
c. Apakah aktivitas antikanker ekstrak etil asetat daun keladi tikus diperantarai
oleh penghambatan ekspresi COX-2?
2. Keaslian penelitian
Penelitian terkait daun keladi tikus :
1. Muhammad Da’i (2007) melaporkan bahwa terdapat aktivitas sitotoksik
pada ekstrak etanolik, etil asetat dan kloroform tanaman keladi tikus
terhadap sel kanker HeLa.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
2. Penelitian yang dilakukan Choo, Chan, Sam, Hitotsunayagi, dan Takeya
(2001) melaporkan bahwa ekstrak kloroform batang dan daun tanaman
keladi tikus menunjukan adanya daya sitotoksisitas dengan IC50 sebesar
15g/mL pada sel kanker leukemia P388.
3. Aksi farmakologis dari keladi tikus telah diteliti oleh Zhong et al (2001).
Semua ekstrak air, alkohol dan ekstrak ester keladi tikus memiliki efek
meredakan batuk, menghilangkan dahak, anti asma, analgesia, anti
peradangan dan obat penenang. Toleransi maksimum untuk toksisitas akut
adalah 720 g/kg (ekstrak etil asetat), 900 g/kg (ekstrak alkohol), dan 3.240
g/kg (ekstrak ester).
Sejauh pengamatan penulis, penelitian mengenai uji aktivitas sitotoksik
ekstrak etil asetat dari tanaman ini terhadap sel kanker kolon WiDr belum pernah
dilakukan.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat teoritis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada para peneliti
khususnya dalam bidang penemuan dan pengembangan obat kanker tentang
potensi daun keladi tikus sebagai salah satu bahan alam yang berpotensi sebagai
pengobatan alternatif kanker kolon.
b. Manfaat praktis
Memberikan bukti ilmiah mengenai kemampuan antikanker daun keladi tikus
berupa nilai IC50, kemampuan menginduksi apoptosis dan kemampuan
menghambat COX-2.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
B. Tujuan Penelitian
Untuk mengetahui nilai IC50, kemampuan induksi apoptosis dan
penghambatan enzim siklooksigenase-2 (COX-2) ekstrak etil asetat daun keladi
tikus terhadap sel kanker kolon WiDr.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Kanker Kolon
1. Definisi dan karsinogenesis kanker kolon
Kanker kolon adalah suatu kanker yang timbul pada sel epitel usus besar
dan rektum dan disebabkan oleh terjadinya mutasi genetik kumulatif yang
merubah proses dalam sel yang secara normal membatasi pembelahan yang
berlebihan, migrasi, dan diferensiasi yang berakibat terjadinya proliferasi, invasi
dan metastatis suatu sel. Ketidakstabilan genetis terus terjadi dan menyebabkan
perubahan yang lebih lanjut, dan mempengaruhi sensitivitas terhadap terapi pada
tumor yang ganas (Steinberg, 2012).
Perkembangan suatu sel menjadi sel tumor yang ganas merupakan proses
yang memilliki tahapan dari mukosa normal menjadi adenoma dan pada akhirnya
menjadi adenoma invasif. Perkembangan malignan pada kolon dapat diketahui
dengan mempelajari sekuen adenoma-karsinoma. Sebagian besar karsinoma
berkembang dari suatu lesi polip pre-neoplastik adenomatous, kemudian
terakumulasi dan terjadi perubahan di dalam sel epitel usus (Brown, 2007).
Perubahan genetik yang paling sering terjadi dalam karsinogenesis
kanker kolon adalah mutasi Adenomatous Polyposis Coli (APC), Kirsten rat
sarcoma (K-Ras), small ‘mothers against’ decapentaplegic4 (SMAD4), tumor
protein p53 (TP53) dan gen mismatch repair (MMR) yaitu Mutl Homolog 1
(MLH1) dan MutS homologue 2 (MSH2) (Arends, 2013).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
2. Jalur Adenomatus Polyposis Coli (APC)/-catenin
APC adalah suatu komponen pembentuk sinyal jalur Drosophila
melanogaster wingless gene (WNT). Sinyal ini memiliki fungsi untuk mengkode
sebuah protein yang mengikat berkas mikrotubulus, meningkatkan migrasi dan
perlekatan sel, dan mengatur kadar β-katenin, suatu mediator penting pada jalur
sinyal Drosophila melanogaster wingless gene (WNT)/β-katenin. Pembentukan
sinyal WNT diperlukan bagi sel-sel induk hematopoietik untuk memperbarui diri.
WNT memberi sinyal melalui suatu famili reseptor permukaan sel yang disebut
frizzled (FRZ), dan merangsang beberapa jalur dengan salah satu jalur sentral
yang melibatkan β-katenin dan APC (Markowitz and Bertagnolii, 2009).
Mutasi APC ditemukan pada 80% adenoma dan karsinoma dan terjadi di
awal rantai urutan karsinogenesis. Mutasi pada protein APC mengakibatkan
terjadinya pemotongan protein APC sehingga kemampuannya berubah dan tidak
lagi dapat mendegradasi β-catenin, sehingga terjadi penumpukan β-catenin
didalam sitoplasma dan nukleus yang mengakibatkan terjadinya WNT signaling
pathway secara terus menerus. Inaktifasi APC merupakan jalur utama
terbentuknya adenoma (Arends, 2013).
β-katenin membentuk suatu kompleks dengan T cell transcription factor
(TCF), yang merupakan faktor transkripsi di dalam nukleus yang mengakibatkan
peningkatkan proliferasi sel dengan meningkatkan transkripsi cellular myc (c-
MYC), SIKLIN D1, dan gen lain yang menyebabkan proliferasi pada sel
(Markowitz and Bertagnolli, 2009).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
3. Mutasi Kirtsten rat sarcoma (K-RAS)
Mutasi yang mengaktivasi kirtsten rat sarcoma (K-Ras) ditemukan pada
40% sampai 45% adenoma dan karsinoma kanker kolon dan diduga muncul pada
tahapan awal pembentukan adenoma. Mutasi biasanya terjadi pada protein kirtsten
rat sarcoma (K-Ras) pada posisi kodon nomor 12, 13 dan 61 dan beberapa bagian
lain. Protein kirtsten rat sarcoma (K-Ras) yang mengalami mutasi memiliki
substitusi asam amino yang asli dengan asam amino yang lain yang berpengaruh
pada fungsi enzimatik protein kirtsten rat sarcoma (K-Ras), yaitu mengurangi
atau mencegah pemotongan enzimatik pada ujung gugus fosfat pada guanosin
trifosfat (GTP), yang secara normal dapat dikonversikan menjadi guanosin
difosfat (GDP) yang merupakan bentuk inaktif.
Gen kirtsten rat sarcoma (K-Ras) mengalami mutasi akan membentuk
protein K-Ras mutan yang teraktivasi secara permanen meskipun tanpa adanya
ikatan antara faktor pertumbuhan dengan reseptor di permukaan membran.
Kirtsten rat sarcoma (K-Ras) mutan menimbulkan pertumbuhan dan penyebaran
tumor yang terus menerus dan tak terkontrol (Sriwidyani, 2013).
4. Gen Small ‘mothers against’ decapentaplegic4 (Smad4) dan Tumor
Supressor Gene 53 (TP 53)
Gen Small ‘mothers against’ decapentaplegic4 (Smad4) mengalami
inaktivasi pada 60% sel kanker oleh adanya mutasi atau delesi dalam jumlah
banyak pada kromosom 18q tempat gen SMAD4 berada. Smad4 berperan dalam
transduksi sinyal pada jalur penghambatan beta-tumor necrosis factor (TNF-),
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
sehingga dengan adanya ketidakmampuan SMAD4 dalam jalur penghambatan
tersebut, sel tumor dapat terus tumbuh (Arends, 2013).
Tumor suppressor gene TP53 mengode protein p53 yang merespon pada
kerusakan DNA dengan upregulation inhibitor Cyclin-Dependent Kinase
Inhibitor (CDK) p21 yang memperbaiki kerusakan DNA atau dengan
upregulation BCl -2 associated X Protein (BAX) dan juga protein apoptosis lain
yang menginduksi kematian sel melalui jalur apoptosis. Mutasi yang
menginaktivasi fungsi protein p53 ditemukan pada lebih dari 60% kanker kolon
dan mutasi ini sering mengakibatkan terjadinya fase akhir yaitu terbentuknya
karsinoma (Arends, 2013). Tahapan karsinogenesis pada kanker kolon secara
ringkas dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1.Tahapan Karsinogenesis pada Kanker Kolon (Arends, 2013).
B. COX-2 dan Kanker Kolon
Prostaglandin merupakan metabolit dari asam arakidonat yang
memainkan peran penting dalam perkembangan kanker kolon. Beberapa
penelitian menunjukan bahwa adanya peningkatan kadar prostaglandin yang
ditemukan dalam kanker kolon. COX-2 merupakan salah satu bentuk enzim yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
bertanggung jawab dalam metabolisme asam arakidonat yang ditemukan dalam
inflamasi dan ditemukan dalam sel kanker. Jumlahnya yang meningkat
dipengaruhi oleh adanya paparan dengan mitogen dan faktor pertumbuhan.
Potensi NSAID spesifik COX-2 dalam pencegahan kanker kolon disarankan
dengan adanya distribusi COX-2 pada polip adenomatus dan keefektifan agen
tersebut dalam uji pada hewan model kanker kolon yang diinduksi karsinogen
(Fournier and Gordon, 2000).
Beberapa sitokin yang diproduksi saat inflamasi (TNFα, IL1β, IL6, dan
IL8) dapat juga mengaktifkan beberapa jalur pertahanan sel, yang mengakibatkan
terhindarnya sel dari kematian sel. Sebagai contoh, TNFα yang diproduksi oleh
tumor dan sel imun, dapat membuat suatu sel bertahan dengan upregulation
protein anti-apoptosis yaitu BCl -2 melalui aktivasi Nuclear Factor kappa B
(NFkB) (Cristofanon, et al., 2009; Chen, et al., 2007; D’Alessio, 2004).
Adanya modulasi protein anti apoptosis menyebabkan ekspresi/aktivasi
mediator inflamasi yang merupakan faktor yang menentukan dalam
chemoresistance. Aktivasi yang berkelanjutan dari faktor inflamasi tersebut telah
berhasil ditemukan pada banyak kanker, contohnya kanker hati, kanker prostat,
dan juga leukemia akut. Pada kasus tersebut, peningkatan BCl -2 anti apoptosis
banyak ditemui (Tricot, 2000).
Peningkatan produksi PGE2 yang berfungsi untuk mengatur proliferasi
sel, kematian sel dan invasi tumor pada banyak kanker seperti kanker kolon,
kanker payudara dan kanker paru diinduksi oleh adanya peningkatan COX-2
(Breyer, Bagdassarian and Breyer, 2001). Pembentukan kanker diartikan sebagai
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
ketidakseimbangan antara proliferasi dan kematian sel. PGE2 dapat menghambat
apoptosis pada sel kanker kolon manusia. Telah dibuktikan bahwa PGE2 dapat
meningkatkan kadar protein anti apoptosis BCl -2 pada sel HCA-7, yang
memproduksi PGE2 dalam jumlah yang banyak dalam penelitian yang dilakukan
Sheng, Shao, Morrow, Beauchamp, and DuBois (1998). PGE2 dapat
memperantarai efek ini melalui reseptor Epidermal Growth Factor (EGF), yang
mengaktivasi Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPK). PGE2 mengaktivasi
EGFR dengan merangsang ekspresi amphiregulin, suatu substrat Epidermal
Growth Factor Receptor (EGFR). Aktivasi MAPK meningkatkan jumlah BCl -2.
Ekspresi amphiregulin berkorelasi dengan banyaknya COX-2 dalam sel
(Damstrup et al.,1999). Efek COX-2 terhadap proliferasi sel dapat dilihat pada
gambar 2.
Gambar 2. Pengaruh ekspresi COX-2 pada kanker kolorektal
(Ghosh, Chaki, Mandal, and Mandal, 2011)
Asam
arakidonat
COX-2
PGH
2
PGE2 MMP
Invasi
P-Akt Pro-
TGFα
TGFα
Sinyal
EGFR
Penghambatan
Apoptosis
K-Ras
Adhesi
Angiogenesis
Migrasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
Prostaglandin juga mengaktivasi phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K)
melalui jalur RAS/MAPK (mitogen- activated protein kinase) dan pengaktifan NF-
кB (Nuclear Factor Kappa B). Aktivasi RAS/MAPK meningkatkan proliferasi sel,
sedangkan aktivasi NF-кB akan menghambat apoptosis dan dapat memicu
ekspresi sitokin inflamasi atau stress oksidatif pada sel inflamatori yang
menyebabkan peningkatan ekspresi COX-2 pada sel epitel. Prostaglandin juga
menginduksi ekspresi matriks metalloproteinase (MMP) yang berperan dalam
proses metastasis. Enzim COX-2 diketahui menstimulasi faktor angiogenik seperti
vascular endothelial growth factor (VEGF) dan basic Fibroblast Growth Factor
(bFGF) yang berperan dalam angiogenesis (pembentukan pembuluh darah baru).
Peningkatan ekspresi COX-2 dapat meningkatkan ekspresi dan aktivasi protein
antiapoptosis serta inaktivasi tumor suppressor factors dan protein proapoptosis.
(Hanahan and Weinberg, 2011; Tenggara and Kurniawati, 2011).
C. WiDr
Colorectal adenocarcinoma cell line (WiDr) merupakan lini sel yang
diderivatisasi dari sel kanker kolon manusia (Chen et al., 1987). Sel ini
mengekspresikan antigen karsinoembrionik dalam kulturnya. Sel ini memiliki
doubling time selama 15 jam dan memiliki efisiensi platting 51% (Noguchi, et al.,
1979) dan berbentuk polygonal (Gander, Gotzos, Fellay and Schwaller, 2013)
WiDr mengekspresikan COX-2 dengan jumlah yang sangat tinggi (Palozza et al.,
2005).
Sel WiDr memiliki sifat resisten terhadap 5-fluorourasil. Usaha
peningkatan sensitivitas dilakukan dengan transfeksi p53 sel normal namun tidak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
menunjukan adanya peningkatan (Giovanneti, et al., 2007) dengan IC50 sebesar
422 µM (Gilang, Hermawan, Fitriasari, and Jenie, 2012). Hal ini mungkin
disebabkan karena adanya peningkatan thymidyl sinthase dalam sel WiDr
(Sigmond, Backus, Wouters, Temmink, Jansen, Peters, 2003) yang memiliki efek
berkebalikan terhadap efektivitas obat penghambat thymidylate synthase
(Giovanneti et al., 2007).
Sel WiDr memiliki kelebihan yaitu dapat membentuk tumor histologis
mendekati 100% setelah diinokulasikan selama 1-4 minggu pada empat host yang
berbeda. Sel WiDr juga mudah dikulturkan dan memiliki doubling time yang
singkat bila dibandingkan dengan kultur sel kanker kolon lainnya. Sel ini juga
memiliki platting efficiency yang tinggi dan mengekspresikan biomarker yang
berguna yaitu CEA (Noguchi et al., 1979).
D. Tanaman Keladi Tikus
1. Deskripsi tanaman
Gambar 3. Tanaman Keladi Tikus
Tanaman keladi tikus (Gambar 3) tergolong dalam famili Araceae,
Bagian tanaman yang digunakan untuk obat adalah semua bagian tanaman.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
Termasuk tanaman yang tumbuh menahun, tingginya bisa mencapai 10 – 45 cm,
hidup diatas permukaan tanah. Tumbuh di tempat terbuka yang terdapat sinar
matahari, tetapi memiliki kelembapan. Tumbuh dalam jumlah banyak dan
biasanya sebagai gulma. Tanaman ini berumbi bulat pepat, berwarna putih dan
beracun (Mangan, 2003).
2. Klasifikasi tanaman
Kingdom : Plantae
Filum : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliae
Ordo : Arales
Famili : Araceae
Genus : Typhonium
Species : Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume
(India Biodiversity Portal, 2013).
3. Nama daerah
Tanaman keladi tikus dikenal dengan nama daerah bira kecil, daun panta
susu, kalamoyang, ileus, ki babi, dan trenggiling mentik (Mangan, 2003).
4. Kandungan fitokimia
Kandungan kimia keladi tikus yang telah teridentifikasi adalah ester
metil asam heksa dekanoat, asam oktadekanoat, asam 9-oktadekanoat dan asam
9,12 oktadekadinoat. Selain itu, beberapa senyawa alifatik yang teridentifikasi
adalah dodekan, tridekan tetradekan, pentadekan, heksadekana, heptadekana,
oktadekan, nonadekan dan eikosan. Tidak satu pun dari senyawa yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
teridentifikasi menunjukkan atau diketahui memiliki perilaku sitotoksik (Choo et
al., 2001).
Senyawa feoforbid a, feoforbid a’ dan metal feoforbid teridentifikasi
sebagai fraksi dari keladi tikus yang paling aktif. Konstituen ini menunjukan
aktivitas anitiproliferatif yang tinggi terhadap sel kanker dan aktivitasnya
meningkat seiring dengan perlakuan fotoaktivasi. Beberapa senyawa lain yang
teridentifikasi adalah asam heksadekanoat, asam oleat, asam linoleat, asam
linolenat, kampesterol, stigmasterol, dan beta-sitosterol (Lai, Mas, Nair, Mansor,
and Navaratnam, 2010). Senyawa glikosida flavonoid dari daun tanaman ini telah
berhasil dilakukan oleh Farida, Wahyudi, Wahono dan Hanafi (2012) dan
memiliki aktivitas antioksidan yang poten, serta agak toksik dengan nilai lethal
concentration (LC50) sebesar 15.84 g/mL terhadap brine shrimp.
E. Doksorubisin
Doksorubisin (Gambar 4) merupakan antibiotik golongan antrasiklin
yang diisolasi dari kultur Streptomyces peucetius var.caesius (Drugbank, 2005)
dan merupakan agen kemoterapi yang secara luas dipakai untuk berbagai macam
kanker. Doksorubisin menginduksi apoptosis dengan fosforilasi p53 pada asam
amino serin 392, menginduksi p21, penghambatan fase Gap-2 (G2) dan
peningkatan protein proapoptosis, BAX (Lupertz, et al., 2010).
Doksorubisin dapat berikatan dengan DNA-associated enzymes, menyisip
pada pasangan basa DNA. Doksorubisin juga mengaktivasi berbagai sinyal
molekular yaitu AMP-activated protein kinase including apoptosis (AMPK) dan
juga terlibat dalam jalur apoptosis BCl-2/Bax. Doksorubisin mengubah rasio BCl-
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
2/Bax didalam sel yang menyebabkan berlangsungnya jalur kaspase yang
mengakibatkan apoptosis. Doksorubisin memiliki kekurangan yaitu menginduksi
apoptosis dan nekrosis pada sel sehat dan menimbulkan toksisitas pada otak, hati,
ginjal dan jantung (Tacar, Sriamornsak, and Dass, 2013).
Gambar 4. Struktur kimia doksorubisin (Drugbank, 2005)
F. Apoptosis dan Nekrosis
Apoptosis yang juga disebut kematian sel tipe satu, didefinisikan sebagai
perubahan karakteristik pada morfologi nukleus, termasuk kondensasi dan
fragmentasi kromatin, penyusutan sel secara keseluruhan, pembengkakan
membran plasma dan pembentukan badan apoptosis yang mengandung nukleus
atau material sitoplasmik (Osthoff, 2008).
Apoptosis dikendalikan oleh rangsangan internal dan eksternal. Beberapa
macam faktor eksternal untuk aktivasi apoptosis, misalnya oleh TNF (tumor
necrosis factor) melalui reseptornya yang akan memicu apoptosis melalui aktivasi
jalur cascade caspase. Jalur ini menyebabkan dikenalnya reseptor TNF sebagai
reseptor kematian. Faktor eksternal lainnya adalah Transforming Growth Factor β
(TGF-β), neurotransmitter tertentu, radikal bebas, sinar UV dan radiasi ionisasi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
Faktor internal antara lain adalah supresor tumor (p53) dan antimetabolit
penghambat nutrien (Subowo, 2011).
Apoptosis dapat dihambat oleh sinyal dari sel lain atau lingkungan
sekitarnya melalui jalur yang disebut survival factors. Hal ini melibatkan faktor
pertumbuhan, hormon seperti estrogen dan androgen, asam amino netral, zink,
dan interaksi dengan matrik protein ekstraseluler. Beberapa sel dan protein virus
dapat beraksi sebagai inhibitor kaspase. Regulator terpenting dalam apoptosis
adalah sinyal internal dari protein BCl -2. Anggota dari keluarga protein ini
memiliki aktivitas antiapoptosis dan proapoptosis yang menentukan kehidupan
dan kematian sebuah sel. Protein-protein ini berinteraksi satu sama lain untuk
menekan atau mempropagasi aktivitasnya sendiri dengan melakukan berbagai aksi
langkah apoptosis. Mereka juga dapat berinteraksi secara independen terhadap
mitokondria untuk mengeluarkan sitokrom c, yang merupakan agen apoptosis
yang paling poten (Ross and Pawlina, 2006).
Nekrosis pada umumnya dianggap sebagai kematian sel yang tidak
terkontrol dan biasanya terjadi karena kecelakaan. Secara biokimiawi, penyebab
yang paling dominan adalah adanya deplesi energi, pembentukan spesies oksigen
reaktif dan aktivasi protease non-apoptosis. Hal-hal tersebut menyebabkan
hilangnya fungsi homeostatis pada pompa ion dan kerusakan pada membrane lipid
serta pembengkakan membran sel dan selanjutnya sel mengalami ruptur (Osthoff,
2008).
Nekrosis merupakan proses kematian sel secara patologik yang dapat
menimbulkan peradangan. Nekrosis dapat disebabkan oleh mikroorganisme,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
virus, bahan kimia dan agen-agen lain yang dapat merusak jaringan (hipotermia,
hipoksia, radiasi, pH rendah, dan trauma). Terjadi influx air dan ion-ion dari celah
ekstraselular, sebagai akibat kerusakan membran sel. Kejadian ini berlanjut
dengan pelepasan kandungan sitoplasma, termasuk enzim-enzim dalam lisosom
ke dalam celah ekstraselular (Subowo, 2011).
Dalam kondisi fisiologis, kerusakan membran plasma dapat juga
disebabkan oleh virus, substansi seperti komplemen, atau protein yang disebut
perforin. Pembengkakan sel yang cepat dan lisis adalah dua karakteristik dalam
proses ini (Ross, 2006).
G. Uji sitotoksik dengan metode MTT
Uji MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 difenil tertazolium bromide)
didasarkan pada konversi MTT menjadi kristal formazan oleh sel hidup, yang
menggambarkan aktivitas mitokondrial. Karena pada umumnya aktivitas
mitokondrial total dalam suatu populasi sel berhubungan dengan jumlah sel yang
hidup, uji ini dipakai secara luas untuk mengukur efek sitotoksik obat secara in
vitro terhadap suatu sel (Meerlo, Kaspers, and Closs, 2011).
Uji MTT dilakukan untuk melihat kemampuan sel hidup untuk
mengonversi garam tetrazolium yang larut dalam air. [3–(4,5-dimethylthiazol-2-
yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] (MTT) diubah menjadi formazan yang tidak
larut dalam air (Gambar 4). Garam tetrazolium menerima elektron dari substrat
yang teroksidasi atau enzim yang sesuai, seperti NADH dan NADPH. MTT
tereduksi pada bagian ubikuinon, sitoktom b dan c pada bagian transpor elektron
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
mitokondria dan merupakan hasil dari aktivitas enzim suksinat dehidrogenase
(Supino, 1995).
Uji sitotoksik selain uji MTT adalah lactate dehydrogenase (LDH) assay.
Uji ini memiliki didasarkan atas deteksi kebocoran lactate dehydrogenase pada
sel yang mati. Uji yang lain adalah neutral red (NR) dengan prinsip pewarnaan
lisosom pada sel hidup, serta uji kandungan protein (protein assay) pada sel
hidup. Diantara keempat uji sitotoksik tersebut, MTT memiliki sensitivitas yang
paling baik (Fotakis and Timbrell, 2006).
Keuntungan penggunaan uji MTT adalah kemampuannya untuk
mengukur dalam waktu yang relatif pendek, bahkan dalam doubling period suatu
sel, dan perbedaan dalam aktivitas metaboliknya (Sieuwerts, Klijin, Peters, and
Foekens, 1995). MTT adalah garam larut dalam air, bermuatan positif bersifat
permeabel terhadap membran sel (Riss et al., 2013) yang dapat diubah menjadi
formazan berwarna ungu yang tidak dapat larut dengan pemotongan cincin
tetrazolium dengan enzim suksinat dehidrogenase didalam mitokondria. Produk
formazan tersebut bersifat impermeabel terhadap membran sel dan juga
terakumulasi dalam sel sehat. Uji MTT telah diuji validitasnya dalam banyak lini /
galur sel (Mossmann, 1983). Beberapa bukti terakhir menyimpulkan bahwa
reduksi MTT juga dapat diperantarai oleh NADH atau NADPH didalam sel dan
diluar mitokondria (Berridge and Tan, 1992).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
Gambar 5. Reaksi MTT menjadi Formazan
H. Uji apoptosis double staining
Sejak awal kemunculannya, metode uji flow cytometric propidum iodide
(PI) telah digunakan secara luas sebagai uji apoptosis pada banyak model
eksperimental. Metode ini didasarkan pada karakteristik sel yang mengalami
apoptosis yaitu adanya fragmentasi DNA dan hilangnya DNA pada inti sel.
Metode ini menggunakan agen fluorochrome, contohnya PI, yang dapat berikatan
dan melabeli DNA. Metode ini mampu mendapatkan hasil uji DNA sel yang cepat
(selesai dalam 2 jam). Sejak publikasinya uji PI telah digunakan secara luas pada
banyak laboratorium (Riccardi and Niccoleti, 2006).
Agen fluorochrome yang lain adalah Acridine orange (AO), yang dapat
berikatan dengan semua asam nukleat dan dapat menembus membran, bersama
dengan propidium iodide (PI) yang merupakan pewarna yang tidak dapat
menembus membran yang juga mengikat semua asam nukleat merupakan
kombinasi pewarna untuk mengetahui integritas sel. PI berflouresensi merah
apabila berikatan dengan asam nukleat dan AO berflouresensi hijau apabila
berikatan dengan DNA untai ganda dan berflouresensi merah apabila berikatan
dengan RNA atau DNA untai tunggal (Helberstadt and Emerich, 2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
Uji viabilitas sel double-staining dengan komponen yang dapat menyisip
DNA yaitu acridine orange dan ethidium bromide (AO/EB) atau propidium
iodide (PI) didasarkan pada prinsip bahwa acridine orange (AO) dapat masuk ke
dalam sel hidup ataupun sel mati, sedangkan EB dan PI hanya dapat menembus
membran sel yang mengalami disintegrasi. Sel hidup berwarna hijau jika dibaca
dibawah mikrokop floresens dan sel mati berwarna merah (Kavanagh, 2007).
I. Uji Imunositokimia
Imunositokimia merupakan cabang dari penelitian mikroskopik dimana
antibodi digunakan untuk mendeteksi keberadaan suatu molekul pada level
mikroskop cahaya maupun elektron. Imunositokimia adalah perbaikan dari
metode sebelumnya yaitu histokimia dan sitokimia enzim dimana molekul reaktif
atau aktivitas enzim dideteksi sebagai reaksi warna (Vaughn, 2013).
Imunositokimia merupakan identifikasi komponen jaringan secara in situ
dengan interaksi antigen-antibodi spesifik dimana antibodi tersebut telah dilabeli.
Cell staining merupakan metode yang kuat untuk mendemonstrasikan keberadaan
suatu molekul spesifik didalam sel. Dalam metode ini, antibodi spesifik yang
berikatan dengan antigen dideteksi dengan reagen sekunder, biasanya berupa
antibodi lain yang sudah dilabeli fluophore atau enzim (Javois, 1999).
Terdapat beberapa jenis imunositokimia, yaitu langsung (direct) dan
tidak langsung (indirect). Imunositokimia langsung menggunakan antibodi primer
berlabel. Sebagai contoh, untuk mendeteksi suatu antigen didalam sel, antibody
primer yang digunakan adalah adalah rabbit anti-antigen yang dilabeli dengan
fluophore. Prosedur ini hanya menggunakan antibody primer dan tidak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
menggunakan antibodi tambahan. Imunositokimia langsung merupakan metode
yang paling sederhana dan merupakan metode imunositokimia pertama yang ada.
Imunositokimia tidak langsung menggunakan antibodi sekunder berlabel yang
berikatan dengan antibodi primer. Antibodi sekunder dibuat dengan cara
menginjeksikan IgG yang dimurnikan dari suatu spesies sebagai antigen (Burry,
2011).
J. LANDASAN TEORI
Kanker kolon merupakan kanker yang terjadi di daerah usus besar dan
daerah rektum. Target karsinogensis pada kolon dan rektum adalah kripta sel
epitel kolon dan 98% adenokarsinoma ada di kolon dan rektum. Penyakit ini
marak terjadi pada negara maju dan berkembang. Pengobatan yang sudah ada
memiliki efek samping yang berat sehingga perlu dilakukan eksplorasi bahan
alam yang poten dan lebih aman.
Tanaman keladi tikus yang tergolong dalam famili Araceace, memiliki
kandungan flavonoid yang tinggi pada daunnya dan senyawa glikosida flavonoid
apigenin, yang memiliki aktivitas antikanker terhadap sel kanker kolon SW480,
telah berhasil diidentifikasi dan diisolasi dari ekstrak etil asetatnya. Hal tersebut
mendasari pemilihan ekstrak etil asetat untuk diuji terhadap sel kanker kolon
WiDr.
Uji sitotoksik dilakukan untuk mengetahui kemampuan antikanker dari
ekstrak uji dengan prinsip kolorimetri. Sel yang masih hidup berkemampuan
untuk mereduksi reagen MTT menjadi kristal formazan berwarna biru karena
masih memiliki enzim suksinat dehidrogenase yang terdapat dalam mitokondria
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
sel hidup, sedangkan enzimnya tidak aktif lagi pada sel yang mati. Hasil yang
diperoleh dari uji ini merupakan absorbansi yang dapat di konversikan menjadi
nilai IC50 yang dapat menggambarkan potensi suatu senyawa antikanker. Hasil
dipertegas dengan uji double staining untuk mengetahui jenis kematian sel secara
apoptosis, atau nekrosis terkait dengan sifat selektifitas ekstrak. COX-2
ditemukan pada sel kanker kolon dan dapat menginduksi apoptosis bila dihambat.
Penghambatan COX-2 ekstrak etil asetat daun keladi tikus pada sel kanker kolon
WiDr dilakukan dengan uji imunositokimia.
HIPOTESIS
Ekstrak etil asetat daun keladi tikus mempunyai aktivitas sitotoksik yang
menginduksi apoptosis diperantarai oleh penekanan ekspresi COX-2 pada sel
kanker kolon WiDr.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian tentang uji aktivitas antikanker ekstrak etil asetat daun keladi
tikus terhadap sel kanker kolon WiDr melalui penekanan ekspresi protein COX-2
ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni dengan menggunakan
rancangan acak lengkap pola searah.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel Utama
a. Variabel bebas
Variabel bebas dari penelitian ini adalah besarnya konsentrasi ekstrak etil
asetat daun keladi tikus (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume pada sel
kanker kolon WiDr.
b. Variabel tergantung
Variabel tergantung dari penelitian ini adalah viabilitas sel WiDr ditandai
dengan nilai IC50 ekstrak etil asetat daun keladi tikus, jumlah sel yang
mengalami apoptosis, dan penekanan ekspresi COX-2.
2. Variabel pengacau
a. Variabel pengacau terkendali :
1) Waktu dan tempat pengambilan tanaman yaitu di Malang, Jawa
Timur pada bulan Agustus 2014
2) Tempat dilakukan percobaan yaitu di Laboratorium Parasitologi
Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
3) Kondisi sel yang digunakan yaitu sel kanker kolon WiDr dalam
keadaan konfluen, tercukupi nutrisinya dan bebas dari kontaminasi.
b. Variabel pengacau tidak terkendali :
Dalam penelitian ini, variable pengacau tak terkendali adalah umur
tanaman yang diambil serta kandungan kimia yang ada di dalam daun
tanaman keladi tikus.
3. Definisi operasional
a. Sitotoksisitas didefinisikan sifat toksik dari ekstrak etil asetat daun keladi
tikus terhadap sel kanker WiDr yang dinyatakan dalam nilai IC50
b. Ekstrak daun keladi tikus didefinisikan ekstrak kental daun keladi tikus
yang diperoleh dengan cara maserasi selama 48 jam menggunakan pelarut
etil asetat.
c. Sel WiDr adalah sel model kanker kolon yang termutasi pada gen p53 dan
mengekspresikan COX-2 dalam jumlah tinggi.
d. IC50 (Inhibition Concentration 50) didefinisikan besarnya konsentrasi
ekstrak daun keladi tikus yang dapat menghambat sejumlah 50%
pertumbuhan sel kanker WiDr.
C. Bahan Penelitian
Pada penelitian ini digunakan daun keladi tikus (diperoleh dari Malang,
Jawa Timur) sel kanker WiDr (diperoleh dari koleksi Laboratorium Parasitologi,
Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada), Pelarut DMSO (Merck), etil
asetat (CV. General Labora) media tumbuh sel kanker WiDr yang terdiri atas
Rosswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 yang mengandung Fetal Bovine
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
Serum (FBS) 10% (v/v) (Gibco), dan antibiotik penisilin-streptomisin 1 %(v/v)
(Gibco), medium pencuci sel WiDr yang terdiri atas RPMI 1640, natrium
bikarbonat, dan hepes. Reagen MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 difenil
tertazolium bromide) (50 mg MTT dan 10mL PBS), pelarut phoshat buffer saline
(PBS) 1X pH 7,4 (dibuat dengan melarutkan 8 g NaCl; 0,2 g KCl; 0,2 g KH2PO4;
dan 1,15 g Na2HPO4 dalam 1 liter akuades), reagen stopper yang mengandung
sodium deodesil sulfat (SDS) 10% dalam 0,01 N HCl dan tripsin 0,5 %, tryptan
blue, dan aquabidest, antibodi anti-human COX-2 (Thermo Scientific Lab
Vision), biotinylated universal secondary antibody (Lab Vision), xylol, etilen dan
hematoxylin (Dako).
D. Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : alat-alat gelas,
blender, timbangan analitik, ayakan, waterbath, aluminium foil, magnetic stirrer,
tabung conical, autoklaf, tangki nitrogen cair, tissue culture flask, swing rotor
sentrifuge, inkubator, mikropipet, lemari pandingin, cell counter, 96-well plate,
24-well plate, ELISA reader, laminar air flow, mikroskop, mikroskop fluoresensi
haemocytometer, oven, yellow tips, blue tips, effendorf, tabung conical 15 mL,
tissue, glove, masker, kamera DSLR.
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman keladi tikus
Determinasi tanaman keladi tikus yang didapatkan di Malang, Jawa
Timur dengan buku acuan menurut Backer, 1963 dilakukan di Fakultas
Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
2. Strerilisasi alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilisasikan
terlebih dahulu. Alat-alat dicuci bersih dibawah air mengalir dengan
menggunakan deterjen. Setelah dikeringkan, alat-alat tersebut dibungkus
menggunakan aluminium foil dan disterilisasikan dalam autoclave selama
20 menit pada suhu 121°C.
3. Pembuatan simplisia
Daun keladi tikus yang telah dikumpulkan kemudian dicuci bersih
dibawah air mengalir. Setelah dicuci daun dikeringkan dibawah terik
matahari dan dilanjutkan dengan menggunakan oven pada suhu 50° C. Daun
kemudian diserbukkan di Merapi Farma, Kaliurang, Yogyakarta.
4. Ekstraksi daun keladi tikus dengan metode maserasi
Sebanyak 25 gram serbuk simplisia daun keladi tikus direndam
dalam 250 mL etil asetat dalam erlenmeyer bertutup dan dibiarkan selama
24 jam terlindung dari cahaya matahari sambil diaduk menggunakan shaker.
Setelah 24 jam maserat diambil dan disaring kemudian ditampung dalam
tabung erlenmeyer tertutup dan disimpan terlindung dari cahaya matahari.
Kemudian ditambahkan pelarut baru dan dilakukan remaserasi selama 24
jam. Setelah 24 jam ekstrak disaring dan ditampung. Ekstrak kemudian
dipekatkan dengan rotary evaporator.
5. Pembuatan media kultur
Disiapkan botol Duran volume 100 mL. Sebelum digunakan, FBS
dan penisilin-streptomisin dicairkan terlebih dahulu pada suhu kamar.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
Setelah itu 10 mL FBS diambil dan dituangkan kedalam botol duran lalu
ditambahkan 1 mL campuran antibiotik-antifungal penisilin-streptomisin.
Kemudian, media RPMI ditambahkan sampai 100 mL (sekitar leher botol).
Diberi penandaan pada botol dengan nama media dan tanggal pembuatan
media kultur.
6. Uji sitotoksisitas ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel
kanker kolon WiDr dengan metode MTT
a. Kultur sel WiDr
Sel WiDr diambil dari tangki nitrogen dan segera dicairkan dalam
penangas air 37° C. Ampul disemprot dengan etanol 70% dan dimasukkan
dalam LAF. Ampul dibuka dan sel WiDr dipindahkan ke dalam conical tube
steril yang telah berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 650 rpm selama 3 menit dan supernatan
yang terbentuk dibuang. Medium RPMI 1640 yang baru ditambahkan
kedalam suspensi sel dan disentrifugasi kembali selama 5 menit hingga
homogen dan dicuci ulang sekali lagi. Setelah suspensi sel WiDr didapatkan,
ditambahkan 1 mL media kultur yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan
kembali secara perlahan hingga homogen. Sel WiDr kemudian ditumbuhkan
dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator CO2
dengan suhu 37° C. Setelah 24 jam, medium kultur WiDr diganti dan sel
WiDr ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian.
b. Panen Sel WiDr
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
Setelah sel WiDr konfluen, medium kultur dibuang kemudian sel
WiDr dicuci dengan 3,5 mL PBS sebanyak 2 kali. Tripsin-EDTA sebanyak
300L ditambahkan dalam sel WiDr dan dilakukan inkubasi selama 3 menit
dalam inkubator CO2. Sebanyak ± 5 mL media kultur ditambahkan kembali
dan sel WiDr diresuspensikan hingga terlepas seluruhnya dari dinding flask.
Suspensi sel dipindahkan ke dalam conical tube steril baru. Sel WiDr
dihitung dengan haemocytometer dan cell counter dan dibuat konsentrasi
suspensi sel yang digunakan untuk penelitian yaitu sebesar 2x104/100 µL.
c. Preparasi larutan uji ekstrak daun keladi tikus
Ekstrak daun keladi tikus ditimbang ± 1 mg dan dimasukkan dalam
tabung effendorf kemudian dilarutkan dalam 1 mL DMSO dan divortex
sampai homogen untuk mendapatkan larutan ekstrak induk dengan
konsentrasi 1 mg/mL. Larutan induk diencerkan dengan media kultur hingga
diperoleh seri konsentrasi 1; 10; 100; 400; 1000; 1200; dan 1500 g/mL.
d. Preparasi larutan kontrol positif doksorubisin
Doksorubisin dengan konsentrasi stok 2000 M dibuat seri
konsentrasi 1; 10; 25; 50; 100; dan 250 M dalam media kultur.
e. Uji sitotoksik dengan MTT assay
Orientasi dilakukan untuk menentukan rentang konsentrasi
yang akan dilakukan dalam uji. Sebanyak 100 µL ekstrak daun keladi
tikus dengan kadar 1; 10; 100; 400; 1000; 1200; dan 1500 g/mL
diteteskan pada suspensi sel WiDr dengan kepadatan 2x104/100 L
dalam sumuran yang berbeda pada well plate. Sebagai kontrol, tiga buah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
well berisi 100 µL suspensi sel ditambahkan 100 µL media kultur.
Doksorubisin sebagai kontrol positif dengan konsentrasi 1; 10; 25; 50;
100; 250 ditambahkan ke dalam sumuran.
Sel yang telah diberi perlakuan kemudian diinkubasi
selama semalam didalam inkubator dengan suhu 37C, kemudian
seluruh larutan uji dan media dibuang seluruhnya dan ditambahkan 100
L reagen MTT ke dalam masing-masing sumuran, diinkubasikan
selama 2-4 jam. Reagen stopper ditambahkan dan kemudian sel
didiamkan selama semalam. Absorbansi setiap sumuran dibaca
menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm.
7. Uji induksi apoptosis dengan metode Double Staining
a. Penanaman sel kanker WiDr
Sel kanker WiDr diambil dari inkubator CO2 kemudian dipanen.
Sel yang digunakan adalah sel yang sudah dalam kondisi 80% konfluen.
Dilakukan perhitungan sel dan dibuat suspensi sel sebanyak 5x104 sel tiap
200 L untuk tiap sumuran. Coverslip dimasukkan kedalam 24-well plate
menggunakan pinset dengan hati-hati. Dua ratus µL suspensi sel
dimasukkan tepat diatas coverslip secara merata dan perlahan, kemudian
didiamkan selama 3-30 menit dalam inkubator agar sel menempel pada
coverslip. Sebanyak 800 µL media kultur sel WiDr ditambahkan kedalam
sumuran secara perlahan. Keadaan sel diamati di mikroskop untuk melihat
distribusi sel. Dilakukan inkubasi sel dalam inkubator selama semalam.
Sebanyak satu konsentrasi sampel pada IC50 terhadap sel kanker kolon
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
WiDr dibuat untuk sampel perlakuan dan media kultur untuk kontrol sel,
masing-masing sebanyak 1000 µL.
b. Perlakuan Double Staining Sampel pada Sel
Sel WiDr dalam 24-well plate diambil dari inkubator. seluruh
media kultur dari tiap-tiap sumuran dibuang dengan mikropipet secara
perlahan. Kemudian, kedalam tiap sumuran diteteskan 500 L PBS untuk
mencuci sel WiDr. Kemudian PBS dibuang dari sumuran dan ditambahkan
sebanyak 1000 µL larutan uji ekstrak etil asetat daun keladi tikus atau
doksorubisin dengan konsentrasi sesuai IC50 terhadap sel kanker kolon
WiDr kedalam sumuran. Media kultur dimasukkan diatas kontrol sel dan
kemudian diinkubasikan didalam inkubator selama 24 jam. Setelah
diinkubasi, semua media dari sumuran dibuang dan masing-masing dicuci
dengan 500 µL PBS. PBS kemudian dibuang dan coverslip diambil
menggunakan pinset dengan bantuan ujung jarum dengan hati-hati.
Letakkan coverslip di atas object glass (kaca obyek) dan diberi label.
Teteskan 10 µL reagen campuran ethidium bromide-akridin oranye di atas
coverslip dan ratakan dengan cara digoyangkan secara perlahan. Preparat
tersebut kemudian diamati di bawah mikroskop fluoresens dan
didokumentasikan.
8. Pengamatan ekpresi protein dengan metode imunositokimia
Sel kanker WiDr diambil dari inkubator CO2 kemudian dipanen.
Sel yang digunakan adalah sel yang sudah dalam kondisi 80% konfluen.
Dilakukan perhitungan sel dan dibuat suspensi sel sebanyak 5x104 sel tiap
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
200 L untuk tiap sumuran. Coverslip dimasukkan kedalam 24-well plate
menggunakan pinset dengan hati-hati. Dua ratus µL suspensi sel
dimasukkan tepat diatas coverslip secara merata dan perlahan, kemudian
didiamkan selama 3-30 menit dalam inkubator agar sel menempel pada
coverslip. Sebanyak 800 µL media kultur sel WiDr ditambahkan kedalam
sumuran secara perlahan. Keadaan sel diamati di mikroskop untuk melihat
distribusi sel. Inkubasi sel dilakukan di dalam inkubator selama semalam.
Sebanyak satu konsentrasi sampel pada IC50 dibuat untuk sampel
perlakuan dan media kultur untuk kontrol sel, masing-masing sebanyak
1000 µL.
Sebuah 24 well plate yang telah berisi sel diambil dari inkubator.
Semua media kultur dari sumuran dibuang dengan mikropipet secara
perlahan. Sel dicuci dengan PBS 500 L kemudian PBS dibuang. Sampel
berupa ekstrak etil asetat daun keladi tikus atau doksorubisin sebanyak
1000 µL dimasukkan kedalam sumuran. Kemudian sebanyak 1000 µL
media kultur sel dimasukkan kedalam sumuran sebagai kontrol sel.
Kemudian diinkubasikan didalam inkubator selama 15 menit. Kondisi sel
WiDr diamati sebelum difiksasi. Media kultur dibuang seluruhnya dari
sumuran dan masing-masing dicuci dengan 500 µL PBS. PBS dibuang
dan coverslip diambil menggunakan pinset dengan bantuan ujung jarum
dengan hati-hati. Coverslip diletakkan di dalam 24-well plate dan diberi
label pada masing-masing perlakuan. Sebanyak 300 µL methanol dingin
ditambahkan dan diinkubasi selama 10 menit dalam freezer. Methanol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
dibuang secara perlahan dan coverslip dijaga agar tidak terbalik.
Sebanyak 500 µL PBS kemudian ditambahkan pada coverslip dan
didiamkan selama 5 menit. PBS kemudian diambil dengan mikropipet
1000 µL kemudian ditambahkan 500 µL akuades. Akuades dibuang
setelah 5 menit dan dilakukan pencucian dengan akudest selama 2 kali.
Larutan hidrogen peroksida (blocking solution) ditambahkan pada
coverslip, lalu diinkubasikan selama 10 menit. Larutan dibuang dengan
mikropipet dan diteteskan predilute blocking serum kemudian
diinkubasikan selama 10 menit. Larutan dibuang dan ditetesi antibodi
monoklonal primer mouse anti-human COX-2. 500 µL PBS ditambahkan
kedalam sumuran dan diinkubasi selama 5 menit. PBS dibuang dan
ditetesi antibodi sekunder rabbit anti-mouse COX-2 yang dilabeli oleh
biotin (biotinylated universal secondary antibody) serta diinkubasi
selama 10 menit. 500 µL PBS ditambahkan dan diinkubasi selama 5
menit. PBS dibuang dan diteteskan dengan reagen yang berisi kompleks
streptavidin-enzim peroksidase lalu diinkubasi selama 10 menit.
Kemudian 500 µL PBS ditambahkan dan diinkubasi selama 5 menit. PBS
dibuang dan diteteskan larutan substrat kromogen DAB lalu diinkubasi
selama 10 menit. Sebanyak 500 µL akuades ditambahkan kemudian
buang kembali. Larutan haemotoxylin diteteskan dan diinkubasi selama 3
menit. 500 µL akuades ditambahkan lalu di buang kembali. Coverslip
diangkat dengan pinset secara hati-hati kemudian dicelupkan dalam
larutan xylol. Coverslip kemudian dicelupkan dalam alkohol dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
dikeringkan. Coverslip kemudian diletakkan di atas object glass dan
ditetesi dengan mounting media. Tutup coverslip dengan coverslip kontak
dan ekspresi protein diamati dengan mikroskop.
F. Tata Cara Analisis Hasil
1. Uji MTT
Dari data yang diperoleh pada uji MTT, dihitung % viabilitas
selnya dengan menggunakan rumus :
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑢𝑎𝑛 −𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑠𝑒𝑙−𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎x 100%
Setelah data % viabilitas di plot pada tabel, IC50 dihitung dengan
menggunakan program R-2.14.0, suatu aplikasi statistika open source yang
dikembangkan oleh Dr. Enade Perdana Istyastono, PhD, Apt.
2. Uji Double Staining
Sel yang berwarna hijau menunjukkan sel yang hidup, sedangkan
sel yang berwarna merah menunjukkan sel yang mati. Sel utuh berwarna
merah menunjukkan sel nekrosis sedangkan sel yang terfragmentasi
menunjukkan sel yang mengalami apoptosis karena pada sel yang
mengalami apoptosis terbentuk badan-badan apoptosis.
Pembacaan data dilakukan dengan bantuan blind reader.
Sebanyak tiga orang responden menghitung jumlah sel yang mengalami
apoptosis, nekrosis atau sel hidup pada preparat yang terdiri dari tiga
bagian tiap preparatnya. Hasil yang didapatkan berupa % rata-rata ± SD.
3. Uji Immunositokimia
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
Ekspresi protein tertentu (misal COX-2) ditunjukkan dengan
warna coklat pada sitoplasma (bukan inti sel). Pembacaan data dilakukan
dengan bantuan blind reader. Sebanyak tiga orang responden menghitung
jumlah sel yang mengekspresikan COX-2 pada preparat yang terdiri dari
tiga bagian tiap preparatnya. Hasil yang didapatkan berupa % rata-rata ±
SD.
Skoring dilakukan dengan cara menghitung persentase sel yang
mengekspresikan COX-2 dalam satu preparat. Hasil negatif didapatkan
apabila sel yang mengekspresikan COX-2 ≤5% dan positif apabila sel
yang mengekspresikan COX-2 >5%. Nilai skor diberikan sesuai dengan
persentase sel yang mengekspresikan COX-2; Skor 0 : 5%; Skor 1 : 6–
25%; Skor 2 : 26–50%; Skor 3: 51–75%; dan Skor 4 : 76–100%. (Vang,
Gown, Barry, Wheeler, and Ronnet, 2006)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Penyiapan Ekstrak Keladi Tikus
Dilakukan determinasi tanaman sebagai langkah pertama yang bertujuan
untuk memastikan kebenaran suatu tanaman yang diuji. Berdasarkan determinasi
yang telah dilakukan di Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta
dengan menggunakan buku acuan Flora of Java (Backer, 1963) daun yang dipakai
dalam penelitian ini adalah benar daun keladi tikus (Typhonium flagelliforme
(Lodd.) Blume (lampiran 10). Daun yang diambil sebaiknya memiliki umur yang
relatif sama agar kadar senyawa aktifnya tidak berbeda. Daun yang sudah dipetik
dicuci dengan air mengalir agar pengotor seperti debu, organisme kecil atau tanah
pada daun dapat dihilangkan. Setelah itu daun ditiriskan dan dikeringkan. Daun
yang diperoleh seberat 950,57 gram.
Pengeringan daun dilakukan dibawah sinar matahari dibawah kain hitam
agar tidak terpapar sinar matahari langsung yang mungkin merusak zat aktif
didalam daun. Pengeringan dilakukan untuk menurunkan kadar air didalam
simplisia agar terhindar dari penjamuran, menjamin kualitas agar tetap baik, dapat
disimpan dalam waktu lama dan terhindar dari kerusakan zat aktif karena
keberadaan air dapat mengaktifkan enzim yang dapat merusak zat aktif dalam
simplisia. Daun dikeringkan didalam oven agar benar-benar kering dan ditandai
dapat hancur ketika digenggam. Daun yang telah kering kemudian diserbukan di
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
Merapi Farma, Yogyakarta. Jumlah serbuk yang didapatkan dalam penelitian ini
adalah sebanyak 25 gram.
Maserasi dilakukan untuk mendapatkan zat-zat aktif yang terdapat dalam
daun keladi tikus. Maserasi merupakan salah satu cara penyarian yang sederhana
yaitu simplisia direndam dengan cairan penyari yang akan menarik senyawa aktif
yang terkandung di dalam daun. Prinsip maserasi yaitu adanya perpindahan massa
dari sel simplisia ke dalam cairan penyari mengikuti derajat konsentrasi. Maserasi
merupakan ekstraksi tanpa pemanasan, sehingga cocok digunakan untuk ekstraksi
senyawa-senyawa yang sensitif pada suhu tinggi.
Maserasi dapat dilakukan dengan atau tanpa adanya penggojogan.
Apabila maserasi yang dilakukan berupa tanpa penggojogan, maserasi
berlangsung selama seminggu. Pada penelitian ini metode maserasi yang dipilih
adalah maserasi dengan penggojogan selama 48 jam. Setelah 24 jam, cairan
penyari diganti dengan yang baru dan ditampung, hal ini dilakukan untuk
menghindari kejenuhan senyawa di dalam cairan penyari. Kecepatan maserasi
yang digunakan adalah 150 rpm, karena pada kecepatan tersebut semua serbuk
dalam wadah sudah dapat teraduk dan terjadi kontak yang terus menerus dengan
cairan penyari.
Hasil maserasi kemudian disaring agar terpisah dari serbuk, kemudian
ditampung dan dipekatkan dengan rotary evaporator dengan suhu 77,1C yang
merupakan titik didih etil asetat. Ekstrak kental yang didapatkan dimasukkan
kedalam cawan porselen dan dipanaskan diatas water bath dan diuji bobot
tetapnya. Bila tidak ada perubahan bobot dalam jangka waktu tertentu,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
diperkirakan bahwa cairan penyari yaitu etil asetat sudah tidak terdapat di dalam
ekstrak kental. Hal ini perlu dilakukan untuk mencegah terjadinya bias, karena
kemungkinan yang menyebabkan kematian sel bukanlah ekstraknya tetapi pelarut
yang tertinggal.
B. Uji Sitotoksik Ekstrak Etil Asetat Daun Keladi Tikus terhadap Sel
Kanker WiDr
Daya antikanker ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel kanker
kolon WiDr dalam penelitian ini diketahui melalui pengujian efek ekstrak
terhadap sel kanker kolon WiDr dengan melihat korelasi antara log konsentrasi
ekstrak dan viabilitas sel. DMSO dipilih sebagai pelarut ekstrak karena telah
digunakan secara luas dan tidak mempengaruhi pertumbuhan sel ataupun bersifat
sitotoksik. Hal ini telah diteliti oleh Violante, Zerrouk, Richard, Provot, Chaumeil,
and Arnaud (2005) yang meneliti tentang daya sitotoksik DMSO terhadap sel
tumor kolon CaCo2 dan hasilnya tidak ditemukan efek sitotoksik terhadap sel
dengan kadar DMSO 10%. Menurut Sarir (2005), kematian sel yang terjadi
setelah penambahan DMSO diakibatkan karena nutrisi dalam media telah habis
atau kepadatan sel yang terlalu rapat.
Biakan sel kanker kolon WiDr ditumbuhkan dalam media kultur yang
mengandung antibiotik (penisilin-streptomisin), dan antifungal (Fungizone) untuk
mencegah terjadinya kontaminasi akibat bakteri dan jamur, FBS yang
mengandung hormone yang mampu memacu pertumbuhan sel dan juga berperan
dalam transport protein, mineral, dan lemak, dan RPMI yang berfungsi untuk
menyediakan nutrient untuk pertumbuhan sel yaitu asam amino, vitamin, garam-
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
garam anorganik dan glukosa agar sel dapat tumbuh dengan baik (Freshney,
2011).
Orientasi dalam uji MTT dilakukan untuk menentukan rentang
konsentrasi sampel yang akan digunakan. Orientasi dilakukan dengan empat
rentang konsentrasi yang berbeda. Rentang konsentrasi yang pertama adalah
10.000; 1000; 100; 10; 10; 1; 0,1; 0,01. Ekstrak yang terlalu pekat pada
konsentrasi tertinggi pada rentang ini menyebabkan terbacanya absorbansi ekstrak
oleh ELISA reader. sehingga hasilnya tidak valid dan kemudian dilakukan
orientasi dengan rentang konsentrasi kedua yang lebih rendah yaitu 5000; 1000;
100; 10; 1; 0,1; 0,01. Hasil yang didapatkan pada rentang konsentrasi ini masih
tidak valid karena ekstrak masih terlalu pekat sehingga absorbansinya terbaca oleh
ELISA reader.
Rentang konsentrasi ketiga dalam penelitian ini dari yang terkecil sampai
terbesar adalah 1; 10; 400; 100; 1000; 1200; dan 1500 g/mL. Pada rentang ini
masih terdapat ekstrak yang terbaca absorbansinya, tetapi tidak sebesar
konsentrasi sebelumnya. Konsentrasi ini dipilih agar kurva antara viabilitas sel
dan log konsentrasi ekstrak yang terbentuk berupa kurva sigmoid, yang
menggambarkan aktivitas enzim suksinat dehidrogenase (Gambar 6). Metode
MTT dilakukan untuk mengetahui pengaruh ekstrak etil asetat daun keladi tikus
terhadap viabilitas sel kanker kolon. Metode ini dipilih karena sensitif, relatif
cepat dan mudah dilakukan (Sieuwerts et al, 1995). Pencucian suspensi sel
dengan PBS dilakukan setelah perlakuan sampel uji terhadap suspensi sel dan
telah diinkubasikan selama 24 jam. Proses metabolisme oleh enzim suksinat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
dehidrogenase dilakukan sel hidup terhadap MTT yang ditambahkan dan setelah
dilakukan inkubasi menghasilkan warna ungu yang berbanding lurus dengan
jumlah sel yang masih hidup. Warna ungu ini menandakan adanya perubahan
MTT menjadi kristal formazan yang berwarna ungu.
Pembacaan hasil dilakukan dengan menggunakan ELISA reader dengan
panjang gelombang 595 nm, yaitu pada panjang gelombang maksimal kristal
formazan. Terdapat nilai minus yaitu pada konsentrasi 1000 g/mL replikasi I dan
II yang kemungkinan hal tersebut disebabkan oleh adanya kontaminasi yang
terjadi pada kontrol media, perbedaan kepadatan sel antar sumuran, dan adanya
sampel yang ikut terbawa masuk ke kontrol media sehingga kontrol media
menunjukan absorbansi yang lebih besar daripada perlakuan, sehingga hasil
perhitungan viabilitas sel bernilai minus.
Nilai IC50 dihitung dengan menggunakan program R, dan didapatkan nilai
IC50 sebesar 102 g/mL. Menurut Ueda et al (2002) nilai IC50 dibawah 100
g/mL menunjukan bahwa ekstrak tersebut memiliki potensi sebagai anti kanker.
Potensi ekstrak sebagai antikanker digolongkan dalam tiga tingkat, yaitu kuat
(IC50<20), sedang (IC50<50) dan lemah (IC50>50) (Ellithey, Lall, Hussein, and
Meyer, 2013). Ekstrak etil asetat daun keladi tikus berpotensi sebagai antikanker
namun memiliki kekuatan yang lemah terhadap sel kanker kolon WIDr.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
Gambar 6. Kurva hubungan viabilitas sel vs log konsentrasi ekstrak keladi tikus
Dilihat dari morfologi selnya, sel yang mati terlihat lebih gelap, terlihat
dekat dengan lensa karena mengambang (tidak menempel pada dasar plate), tidak
saling menempel dan batas antar sel tidak jelas. Sel yang masih hidup memiliki
ciri berwarna lebih cerah karena sitoplasmanya masih mengandung cairan
sitoplasma yang dapat meneruskan cahaya dari mikroskop inverted, menempel
satu dengan yang lain, berbentuk bulat dan terlihat menempel di dasar plate. Sel
yang mengalami perubahan morfologi ditunjukkan oleh anak panah berwarna
merah, sedangkan sel normal ditunjukan oleh anak panah berwarna oranye pada
gambar 7. Aktivitas antikanker ekstrak etil asetat daun keladi tikus memiliki pola
dose dependent, yaitu viabilitas sel akan menurun seiring kenaikan konsentrasi
sampel, kecuali pada seri konsentrasi yang paling tinggi, yaitu didapatkan
viabilitas sel yang justru meningkat. Hal ini disebabkan karena sampel yang
terlalu pekat, sehingga meskipun telah dicuci oleh PBS tetap meninggalkan bekas
di dalam well plate dan menyebabkan absorbansi yang lebih tinggi.
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
via
bil
itas
sel
(%)
log konsentrasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
Setelah pemberian MTT, perbedaan morfologi sel dapat semakin terlihat.
Sel-sel yang masih hidup dapat mengubah MTT menjadi kristal formazan
berwarna biru keunguan sedangkan pada sel yang mati tidak ditemukan adanya
perubahan yang menimbulkan warna. Reagen stopper ditambahkan untuk
melarutkan kristal formazan. Kontrol sel memiliki intensitas warna yang paling
tinggi dan jika dibandingkan dengan perlakuan, intensitas warnanya semakin
menurun seiring kenaikan konsentrasi ekstrak yang diberikan. Intensitas warna ini
akan terbaca oleh ELISA reader, dan hasilnya akan berbanding lurus dengan
viabilitas sel.
(A) (B) (C)
(D)
Gambar 7. Efek sitotoksik ekstrak daun keladi tikus terhadap sel WiDr. Pada konsentrasi ekstrak 1500 g/mL (A), dan 1200 g/mL, (B), tidak teramati bentuk sel karena
tertutup oleh sampel yang pekat. Pada konsentrasi 200 g/mL (C), terlihat beberapa sel mengalami
perubahan morfologi dan pada konsentrasi 1 g/mL (D), tidak ditemukan perubahan morfologi. Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop inverted perbesaran 400x.
Terjadi perubahan morfologi Sel normal
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
Aktivitas antikanker dari tanaman keladi tikus juga dilaporkan oleh
beberapa penelitian sebelumnya, yaitu terhadap sel kanker rahim HeLa (Da’i et al,
2007), dan terhadap sel kanker leukemia P338 (Choo et al., 2001).
C. Uji Apoptosis Ekstrak Etil Asetat Daun Keladi Tikus dengan Metode
Double Staining
Apoptosis adalah kematian sel terprogram yang menghasilkan perubahan
karakteristik morfologi dan biokimia sel. Apoptosis dirangsang oleh kerusakan
DNA, adanya TNF (Tumor Necrosis Factor) atau tidak adanya faktor
pertumbuhan. Peristiwa apoptosis ditandai dengan adanya membran blebbing
tanpa hilangnya integritas membran, kondensasi dan fragmentasi kromatin,
pemadatan organela sitoplasma, dilatasi dari retikulum endoplasma, penurunan
volume sel dan pembentukan badan apoptosis (Subowo, 2011).
Peristiwa apoptosis dapat dideteksi dengan pengecatan akridin oranye –
etidium bromida. Metode ini didasarkan pada perbedaan profil fluoresensi DNA
pada sel mati dan sel hidup yang berikatan dengan akridin oranye atau etidium
bromida. Akridin oranye dapat menembus masuk ke dalam sel yang hidup atau
yang mati. Akridin oranye bila berikatan dengan DNA untai ganda menghasilkan
warna fluorosensi hijau, dan menghasilkan warna merah bila berikatan dengan
DNA untai tunggal. Etidium bromida hanya bisa masuk kedalam sel yang
membran plasmanya sudah rusak. Sel yang mengalami nekrosis mengalami
kerusakan membran sel sehingga etidium bromida dapat masuk kedalam sel
kemudian akan berikatan dengan RNA atau DNA untai tunggal dan menghasilkan
floresensi merah bila dilihat dari mikroskop fluoresens. Warna yang ditimbulkan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
oleh etidium bromida lebih dominan daripada yang ditimbulkan akridin oranye,
sehingga pada sel yang mengalami nekrosis berwarna merah sedangkan sel yang
mengalami apoptosis berwarna oranye kemerahan. Sel yang masih hidup
berwarna hijau merata, sedangkan sel yang mengalami apoptosis memiliki warna
oranye terfragmentasi yang menandakan bahwa sel mengalami fase late apoptosis
atau berwarna hijau seperti sel hidup namun terdapat warna kekuningan di bagian
tengah sel yang berarti terdapat kondensasi kromatin yang menandakan sel
mengalami fase early apoptosis. Sel yang berwarna merah merata adalah sel yang
mengalami nekrosis (Gambar 8).
(A) (B) (C) Gambar 8. Hasil Uji Double Staining Ekstrak Keladi Tikus. Kontrol sel (A), Perlakuan
dengan ekstrak keladi tikus 102 µg/mL (B), Perlakuan dengan Doksorubisin 21 µg/mL (C)
Apoptosis Nekrosis Sel Hidup
Konsentrasi yang digunakan dalam uji ini adalah sesuai dengan nilai IC50
yang didapatkan pada uji MTT yaitu 102 µg/mL untuk ekstrak etil asetat daun
keladi tikus dan 21 µM untuk doksorubisin. Uji double staining merupakan uji
kualitatif, namun dapat dijadikan sebuah uji semi-kuantitatif, dengan pengambilan
beberapa layang pandang yaitu tiga buah foto gambaran keadaan sel tiap satu
preparat, yang dianggap mewakili seluruh keadaan sel dalam preparat tersebut.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
Pembacaan hasil dilakukan dengan bantuan blind reader. Sebanyak tiga
orang pengamat diminta untuk menghitung jumlah sel yang mengalami apoptosis,
nekrosis dan sel yang masih hidup pada foto sel, tanpa mengetahui perlakuan
yang diberikan terhadap sel yang diamati. Tabel I menunjukan bahwa sebanyak
65.275±1.27 % sel mengalami apoptosis. Hal ini menunjukan bahwa ekstrak etil
asetat daun keladi tikus pada IC50 102 g/mL menginduksi terjadinya apoptosis,
meskipun tidak sebesar Doksorubisin yaitu sebesar 92.916±2.204 %
Menurut Mohan, et al. (2010) ekstrak keladi tikus menginduksi apoptosis
sel melalui peningkatan sitokrom c, suatu protein heme yang berperan sebagai
pembawa elektron yang larut dalam air dalam fosforilasi oksidatif mitokondria.
Sitokrom c dapat berinteraksi dengan Apaf-1 membentuk CARD (Caspase
Recruitment Domain). Beberapa CARD kemudian bergabung membentuk
kompleks apoptosome kemudian mengikat pro-caspase 9 dan mengaktivasinya
menjadi caspase 9 (inisiator kaspase). Caspase 9 mengaktivasi procaspase-3
menjadi caspase 3. Caspase 3 membelah gelsolin, suatu protein yang berfungsi
untuk memelihara morfologi sel. Jika gelsolin dibelah, timbul pembelahan
filament aktin didalam sel sehingga sel kehilangan integritasnya. Caspase 3 juga
memotong Poly ADP (Adenosine Diphosphate)-Ribose Polymerase (PARP),
sebuah enzim yang berperan dalam perbaikan dan pemeliharaan DNA. Caspase 3
merupakan caspase efektor yang menimbulkan apoptosis pada sel.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
Tabel I. Distribusi sel WiDr pada uji apoptosis dengan metode double staining
Sel Apoptosis
(%)±SD
Nekrosis
(%)±SD
Hidup (%)±
SD
Ekstrak Keladi Tikus 65.27±1.27 14.16±0.48 20.94±1.42
Doksorubisin 92.91±2.20 2.975±2.59 5.41±0.0005
Kontrol Sel 1.081 0 98.9
D. Uji Imunositokimia COX-2 akibat perlakuan ekstrak
Uji imunositokimia merupakan uji yang dilakukan untuk mendeteksi
keberadaan suatu protein didalam sel. Tujuan dilakukan uji imunositokimia dalam
penelitian ini adalah untuk mengetahui seberapa besar kemampuan ekstrak dalam
menghambat ekspresi siklooksigenase-2 (COX-2), suatu protein yang banyak
diekspresikan oleh sel kanker WiDr (Palozza et al, 2004) dan memiliki aktivitas
memicu proliferasi sel (Breyer, Bagdassarian, Myers, and Breyer, 2001).
Peningkatan COX-2 didalam sel kanker kolon WiDr dapat menurunkan
kemampuan apoptosis sel dan melindungi sel dari apoptosis yang di induksi oleh
berbagai sinyal. Oleh sebab itu, hal ini dapat meningkatkan potensi tumorigenik
sel (Richter, Weiss, Weinberger, Furstenberger, and Marian, 2001). COX-2 dapat
memicu proliferasi sel dengan meningkatkan produksi PGE-2 yang dapat
menghambat terjadinya apoptosis dengan meningkatkan protein anti apoptosis
yaitu BCl -2 (Sheng, Shao, Morrow, Beauchamp, and DuBois,1998) serta
mengikat protein pro apoptosis BAX. Pemberian inhibitor COX-2 pada jaringan
atau sel karsinoma dan adenoma dapat menurunkan populasi sel, menghambat
ekspresi COX-2, dan BCl -2 (Richter et al, 2001). Pengobatan dengan inhibitor
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
COX-2 seperti NSAID tidak disarankan karena dapat berbahaya bagi ginjal dan
saluran pencernaan bila digunakan dalam waktu yang lama.
Sel yang tidak mengekspresikan COX-2 berwarna keunguan, sedangkan
yang mengekpresikan COX-2 berwarna coklat pekat, hal ini dikarenakan adanya
staining secara enzimatis oleh peroksidase pada uji imunositokimia (Gambar 9).
Skoring secara semi kuantitatif dilakukan dalam pengujian imunositokimia untuk
menentukan hasil positif atau negatif (ada tidaknya suatu protein). Skoring
dilakukan dengan cara menghitung persentase sel yang mengekspresikan COX-2
dalam suatu preparat. Hasil negatif didapatkan apabila sel yang mengekspresikan
COX-2 ≤5% dan positif apabila sel yang mengekspresikan COX-2 >5%. (Vang,
Gown, Barry, Wheeler, and Ronnet, 2006). Skor COX-2 dalam penelitian ini
adalah 3+ (51% -75% sel mengekpresikan COX-2) untuk kontrol sel, dan 2+
(26% - 50% sel mengekspresikan COX-2) untuk perlakuan dengan ekstrak keladi
tikus dan doksorubisin.
Pembacaan hasil penelitian dilakukan dengan melibatkan 3 (tiga) orang
blind reader untuk menghitung jumlah sel yang mengekspresikan COX-2 dalam
suatu preparat tanpa mengetahui perlakuan yang diberikan terhadap sel yang
diamati. Hasil yang diperoleh menunjukan bahwa ekstrak etil asetat daun keladi
tikus dan doksorubisin memiliki kemampuan dalam menghambat ekspresi protein
COX-2, dan keduanya memiliki potensi yang berbeda tidak bermakna secara
statistik dengan uji t (α = 0.05). Tabel II menunjukan jumlah rata-rata sel yang
mengekspresikan COX-2 mengalami penurunan pada perlakuan ekstrak etil asetat
daun keladi tikus dan pada perlakuan kontrol positif (doksorubisin) bila
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
dibandingkan dengan kontrol sel tanpa perlakuan. Pada Tabel III terlihat adanya
perbedaan bermakna antara jumlah COX-2 pada kontrol sel dengan jumlah COX-
2 pada sel kanker yang telah diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat daun
keladi tikus dan doksorubisin.
Hasil uji imunositokimia menunjukan bahwa aktivitas antikanker yang
dimiliki oleh ekstrak etil asetat daun keladi tikus diperantarai oleh penekanan
ekspresi protein COX-2. COX-2 merupakan biomarker yang dapat dijadikan
molekul target dalam antikanker. Sel WiDr yang mengalami penghambatan COX-
2 akan mengalami apoptosis karena sifat tumorigeniknya menurun akibat tidak
lagi terlindungi dari peristiwa apoptosis yang diinduksi berbagai sinyal.
Tabel II. Jumlah rata-rata sel yang mengekpresikan COX-2 dalam tiap perlakuan
Preparat %Rata-rata ± SD
Kontrol Sel 69.36 ± 10.20
Perlakuan Ekstrak 39.22 ± 3.63
Doxorubicin 34.32 ± 4.24
Tabel III. Hasil uji statistik t-test COX-2 antara doksorubisin, ekstrak etil asetat daun keladi
tikus dan kontrol sel pada uji imunositokimia
Perlakuan yang
diberikan
Kontrol Sel Doksorubisin Ekstrak Keladi
Tikus
Kontrol Sel BB BB
Doksorubisin BB BTB
Ekstrak Keladi
Tikus
BB BTB
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
( I ) ( II ) ( III )
( IV )
Gambar 9. Hasil Imunositokimia Sel Kanker Kolon WiDr
(I) Kontrol Sel (II) Kontrol Sel tanpa antibodi (III) Perlakuan ekstrak 102 µg/mL dan (IV)
Perlakuan dengan Doksorubisin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Ekstrak etil asetat daun keladi tikus memiliki aktivitas sitotoksik
dengan IC50 sebesar 102 g/mL terhadap sel kanker kolon WiDr
2. Ekstrak etil asetat daun keladi tikus menginduksi apoptosis pada sel
kanker kolon WiDr
3. Apoptosis yang diakibatkan oleh ekstrak etil asetat daun keladi tikus
terhadap sel kanker kolon WiDr diperantarai oleh penekanan ekspresi
protein COX-2.
B. Saran
1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut berupa skrining dan pencarian
fraksi aktif dari daun keladi tikus.
2. Perlu dilakukan pengujian efek sitotoksik terhadap sel normal.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
53
DAFTAR PUSTAKA
American Cancer Society, Colorectal Cancer Facts & Figures,
www.cancer.org/research/cancerfactsstatistics/colorectal-cancer-facts-
figures, diakses tanggal 9 Pebruari 2015.
Arends, M.J., 2013, Pathways of colorectal carcinogenesis, Appl Immunohistochem
Mol Morphol, 21 (2), 97-102.
Berridge, M.V., and Tan , A.S., 1992, Characterization of the cellular reduction of 3-
(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT):
subcellular localization, substrate dependence, and involvement of
mitochondrial electron transport in MTT reduction, Arch Biochem Biophys,
303 (2), 474-482.
Breyer, R.M., Bagdassarian, C.K., Myers, S.A., and Breyer, M.D., 2001, Prostanoid
receptors: subtypes and signaling, Annual Review of Pharmacology and
Toxicology, 41, 661–690.Brown, G., 2007, Colorectal Cancer, Cambridge
University Press, UK, p. 4.
Burry, R.W., 2011, Immunocytochemistry: A Practical Guide for Biomedical
Research, Springer, New York, pp. 66-67.
Chen, T.R., Drabkowski, D., Hay, R.J., Macy, M., Peterson, W., 1987, WiDr is a
derivative of another colon adenocarcinoma cell line, HT-29, Cancer genetic
and cytogenetics, 27 (1), 125-134.
Burry, R.W., 2011, Immunocytochemistry: A Practical Guide for Biomedical
Research, Springer, New York, pp. 66-67.
Chen, T.R., Drabkowski, D., Hay, R.J., Macy, M., Peterson, W., 1987, WiDr is a
derivative of another colon adenocarcinoma cell line, HT-29, Cancer genetic
and cytogenetics, 27 (1), 125-134.
Choo, C.Y., Chan, K.L., Sam, T.W., Hitotsuyanagi, Y., and Takeya, K., 2001, The
cytotoxicity and chemical constituents of the hexane fraction of Typhonium
flagelliforme (Araceae), Journal of Ethnopharmacology, 77, 129-131.
Cristofanon, S. F., Morceau, A. I., Scovassi, M., Dicato, L., Ghibelli, and Diederich,
M., 2009, Oxidative, multistep activation of the noncanonical NF-κB
pathway via disulfide BCl-3/p50 complex , FASEB Journal, 23, 45–57.
Cui, C., Wang, Y., Wang, Y., Zhao, M., Peng, S., 2013, Exploring the Relationship
between the Inhibition Selectivity and the Apoptosis of Roscovitine-Treated
Cancer Cells, Journal of Analytical Methods in Chemistry, 2013, 7.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
54
D’Allesio, M., Cerella, C.M., D'Alessio, C., Cerella, C., and Amici, et al.,
Glutathione depletion up-regulates BCl-2 in BSO-resistant cells, FASEB
Journal, 18 (13), 1609–1611.
Da’I, M., Fiveri, A., Meiyanto, E., 2007, Efek Sitotoksik Ekstrak Tanaman Keladi
Tikus (Typhonium divaricatum (L.) Terhadap Sel HeLa, Jurnal Farmasi
Indonesia, 3 (4), 163-167.
Dampstrup, L., Kuwada, S.K., Dempsey, P.J., Brown, P.J., Hawkey C.J., Poulsen,
H.S., et al., 1999, Amphiregulin acts as an autocrine growth factor in two
human polarizing colon cancer lines that exhibit domain selective EGF
receptor mitogenesis, British Journal of Cancer, 80 (7), 1012–1019.
Ellithey, M.S., Lall, N., Hussein, A., and Meyer, D., 2013, Cytotoxic and HIV-1
inhibitory activities of Red Sea marine organisms, http://www.biomedcentral.com/1472-6882/14/77, diakses tanggal 7 Maret
2015.
Farida, Y., Wahyudi, P.S., Wahono, S., Hanafi, M., 2012, Flavonoid Glycoside From
Ethyl Acetate Extract Of Keladi Tikus Typhonium flageliiforme (Lodd)
Blume Leaves, Asian Journal Of Natural & Applied Sciences, 1 (4), 16-21.
Fotakis, G., and Timbrell, J.A., 2005, In vitro cytotoxicity assays : Comparison of
LDH, neutral red, MTT and protein assay in hepatoma cell lines following
exposure to cadmium chloride, Toxicology Letters, 160, 171-177.
Fournier, D.B., and Gordon, G.B., 2000, Cox-2 and Colon Cancer : potential
targets for chemoprevention, J Cell Biochem Suppl., 34, 97 – 102.
Freshney, R.I., 2011, Animal Cell Culture, a Practical Approach, 1st ed., IRL Press,
Washington DC, pp. 3-5, 8, 73, 193.
Gander, J.C., Gotzos, V., Fellay, B., Schwaller, B., 1996, Inhibition of the
proliferative cycle and apoptotic events in WiDr cells after down-regulation
of the calcium-binding protein calretinin using antisense
oligodeoxynucleotides, Experimental Cell Research, 225 (2), 339-410.
Ghosh, N., Chaki, R., Mandal, V.,and Mandal, S.C., 2011, COX-2 as a target for
cancer chemotherapy, Pharmacological Reports, 62, 233-244.
Gilang, Y., Hermawan, A., Fitriasari, A., and Jenie, R.I., 2012, Hesperidin Increases
Cytotoxic Effect of 5-Fluorouracil on WiDr Cells, Indonesian Journal of
Cancer Chemoprevention, 3 (2), 405-410.
Giovanneti, E., Backus, H.H., Wouters, D., Ferreira, C.G., van Houten, V.M.,
Brakenhoff, R.H., et al, 2007, Changes in the status of p53 affect drug
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
55
sensitivity to thymidylate synthase (TS) inhibitors by altering TS levels, Br J
Cancer, 96 (5), 769-775.
Hanahan and Weinberg, 2011, Hallmarks of Cancer: The Next Generation, Cell,
144(4), 646-650.
Helberstadt, C., and Emerich, D.F., 2007, Cellular Transplantation : From
Laboratory to Clinic, Elsevier Inc, USA, p. 107.
India Biodiversity Portal, 2013, http://indiabiodiversity.org/species/show/244514,
Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume diakses tanggal 7 Februari 2015.
http://www.bookoncancer.com/images/video/website%20rodent%20tuber.jpg, book
on cancer diakses tanggal 14 Mei 2014.
Javois, C.L., 1999, Immunocytochemical Methods and Protocols, Second Edition,
Humana Press Inc., New Jersey, p. 3
Kakiuchi, Y., Tsuji, S., Tsujii, M., Murata, H., Kawai, N., Masakazu, Y., et al., 2002,
Cyclooxigenase-2 Activity Altered the Cell-Surface Carbohydrate Antigens
on Colon Cancer Cells and Enchanced Liver Metastasis, Cancer Research,
62, 1567-1572.
Kavanagh, K., 2007, New Insight in Medical Mycology, Springer, The Netherlands, p.
32.
Koehne, C.H., Dubois, R.N., 2004, COX-2 inhibition and colorectal, Semin Oncol, 31
(7), 12-21.
Lai, C.S., Mas, R.H., Nair, N.K., Mansor, S.M., and Navaratnam, V., 2010,
Chemical constituents and in vitro anticancer activity of Typhonium
flagelliforme (Lodd.) Blume (Araceae), J Ethnopharmacol, 127(2), 486-494
Lupertz, R., Watjen, W., Kahl, R., Chovolou, 2010, Dose-and time-dependent effects
of doxorubicin on cytotoxicity, cell cycle and apoptotic cell death in human
colon cancer cells, Toxicology, 271, 115-121.
Mangan, Y., 2008, Cara Bijak Menaklukan Kanker, Agromedia Pustaka, Jakarta, hal.
43-44.
Markowitz, S.D., and Bertagnolli, M.D., 2009, Molexular Basis of Colorectal Cancer,
The New England Journal of Medicine, 361, 2449-2460.
Meerlo, J., Kaspers, G.J., and Cloos, J., 2011, Cell sensitivity assays: the MTT assay,
Methods Mol Bio, 731, 237-245.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
56
Mohan, S., Abdul, A.B., Abdelwahab, S.I., Al-Zubairi, A.S., Sukari, M.A., Abdullah,
R., et al., 2010, Typhonium flageliiforme induces apoptosis in CEMss cells
via actvation of caspase-9, PARP cleavage and cytochrome c release : Its
activation coupled with G0/G1 phase cell cycle arrest, Journal of
Ethnopharmacology, 131, 592-600.
Mossmann, T., 1983, Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assays, J.Immunol. Meth, 65,
55–63.
Noguchi, P., Wallace, J.J., Earley, M.E., O’Brien S., Ferrone, S., Pellegrino, A.M., et
al., 1979, Characterization Of WiDr : A Human Colon Carcinoma Cell Line,
In Vitro, 15 (6), 401-408.
Osthoff, S.K., 2008, How cells die: Apoptosis and other cell death pathways,
Apoptosis, Cytotoxicity and Cell Proliferation, Roche Diagnostic GmbH,
Germany, 4, 6.
Palozza, P., Serini, S., Maggiano, N., Tringali G., Navarra, P., Ranelleti, F.O., et al.,
2005, beta-Carotene downregulates the steady-state and heregulin-alpha-
induced-COX-2 pathways in colon cancer cells, J Nutr, 135(1), 129-136.
Ranke, C., Creutzig, A., Luska, G., Wagner, H.H., Galanski, M., Bode-Boger, S., et
al., 1994, Controlled Trial of high-versus low-dose aspirin treatment after
percutaneous transluminal angioplasty in patients with peripheral vascular
disease, Clin Investig, 72, 673-680.
Riccardi, C., and Nicoletti, I., 2006, Analysis of apoptosis by propidium iodide
staining and flow cytometry, Nat Protoc, 1 (3), 1458-1461.
Richter, M., Weiss, M., Weinberger, I., Furstenberger, G., and Marian, B., 2001,
Growth inhibition and induction of apoptosis in colorectal tumor cells by
cyclooxygenase inhibitors, Carcinogenesis, 22 (1), 17-25.
Riss, T.L., 2013, Cell Viability Assays, Assays Guidance Manual, 2-13.
Ross, H.M., and Pawlina W., 2006, Histology : A text and Atlas With correlated cell
and molecular biology, Fifth Edition, Lippincot Williams & Wilkins,
Philadelphia, pp. 88-89.
Sarir, T., 2005, Uji Daya Antiproliferasi Pentagamafunon-1 (PGV-1) terhadap Sel
Kanker Payudara T47D, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada,
Yogyakarta, 38-43, 61.
Scheiman, J.M., 1996, NSAIDs, gastrointestinal injury, and cytoprotection,
Gastroenterol Clin North Am, 25 (2), 279-298.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
57
Sheng, H., Shao, J., Morrow, D.J., Beauchamp, D.R., and DuBois, N. R., 1998,
Modulation of apoptosis and BCl-2 expression by prostaglandin E2 in
human colon cancer cells, Cancer Research, 58 (2), 362–366.
Sigmond, J., Backus, H.H., Wouters, D., Temmink, O.H., Jansen, G., and Peters,
G.J., 2003, Induction of resistance to the multitargeted antifolate Pemetrexed
(ALIMTA) in WiDr human colon cancer cells is associated with thymidylate
synthase overexpression, Biochem Pharmacol, 66 (3), 431-438.
Sinicrope, F.A., and Gill, S., 2004, Role of cyclooxygenase-2 in colorectal cancer,
Cancer Metastasis Rev, 23 (1-2), 63-75.
Sieuwerts, M.A., Klijn, M. G. J., Peters, A. H., and Foekens, A. J., 1995, The MTT
Tetrazolium Salt Assay Scrutinized : How to Use this Assay Reliably to
Measure Metabolic Activity of Cell Cultures in vitro for the Assesment of
Growth Characteristics, IC50-Values and Cell Survival, Eur J Clin Chem
Clin Biochem, 33, 813-823.
Sriwidiyani, N.P., 2013, Mutasi K Ras pada Karsinogenesis Kanker Kolorektal,
Jurnal Ilmiah kedokteran, 44(2), 97-100.
Steinbach, G., Lynch, P.M., Philips R.K., Wallace, M.H., Hawk, E., et al., 2000,
The effect of celecoxib, a cyclooxygenase-2 inhibitor, in familial
adenomatus polyposis, N.Engl. J. Med, 342, 1946-1952.
Steinberg, M., 2012, Colorectal Cancer, Screening Guidelines Update, US
Pharmacist, http://www.medscape.com/viewarticle/776784_3, diakses
tanggal 2 Mei 2014.
Supino, R., 1995, MTT Assays, Methods in Molecular Biology, 43, pp. 137-138.
Subowo, 2011, BIOLOGI SEL, EDISI 6, Sagung Seto, Jakarta, hal. 306-307
Tacar, O., Sriamornsak, P., and Dass, C.R., 2013, Doxorubicin: an update on
anticancer molecular action, toxicity and novel drug delivery systems, J
Pharm Pharmacol, 65 (2), 157-170.
Tricot, G., 2000, New insights into role of microenvironment in multiple
myeloma, The Lancet, 355 (9200), 248–250.
Tenggara , R., and Kurniawati, A., 2011, Pengaruh Asam Asetil Salisilat terhadap
Penurunan Prevalensi Kanker Kolorektal, CDK Kalbemed, 186 (38), 350-
358.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
58
Ueda, J.Y., Tezuka, Y., Banskota, A.H., Tran, Q.L., Tran, Q.K., Harimaya, Y., Saiki,
I. and Kadota, S., 2002, Antiproliferative Activity of Vietnamese Medicinal
Plants, Biol. Pharm. Bull, 25(6), pp. 753-760
Vang, R., Gown, A.M., Barry, T.S., Wheeler, D.T., Ronnet, B.M., 2006,
Immunohistochemistry for estrogen and progesterone receptors in the
distinction of primary and metastatic mucinous tumors in the ovary : an
analysis of 124 cases, Mod Pathol, 19 (1), 97-105.
Vaughn, K., 2013, Immunocytochemistry of Plant Cells, Springer Science+Bussiness
Media, London, p. 1.
Violante, D.G., Zerrouk, N., Richard, I., Provot, G., Chaumeil, J.C., Arnaud, P.,
2002, Evaluation of the cytotoxicity effect of dimethyl sulfoxide (DMSO) on
Caco2/TC7 colon tumor cell cultures, Biol Pharm Bull, 25 (12), 1600-1603.
Waddel, W.R., and Loughry, R.W., 1983, Sulindac for polyposis of the colon, J.
Surg. Oncol, 83, 87.
Wang, Q.R., Yao, X.Q, Wen, G., Fan, Q., Li, Y., Fu, X.Q, et al., 2011, Apigenin
suppreses the growth of colorectal cancer xenografts via phosphorylation
and up-regulated FADD expression, ONCOLOGY LETTERS, 2, 43-47.
Yeatman, T. J., 2001, Colon Cancer, Encyclopedia Of Life Sciences, 1-6.
Zhong, Z., Zhou, G., Chen, X., Huang, P., 2001, Pharmacological study on the
extracts from Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume Blume,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11822289, diakses tanggal 4 Mei 2014
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
59
Lampiran
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
60
Lampiran 1.
Distribusi sel WiDr pada uji apoptosis dengan metode double staining
1. Perlakuan dengan esktrak etil asetat keladi tikus
Sel Pengamat 1 Pengamat 2 Pengamat 3
Bagian Apoptosis Nekrosis Hidup Apoptosis Nekrosis Hidup Apoptosis Nekrosis Hidup
1 (Total Sel
: 30) 9 (30%)
11
(36.67%)
10
(33.33%) 12 (40%)
8
(26.67%)
10
(33.33%) 9 (30%)
11
(36.67%)
10
(33.33%)
2 (Total Sel
: 20) 17 (85%) 0 (0%) 3 (15%) 16 (80%) 0 (0%) 4 (20%) 18 (90%) 0 (0%) 2 (10%)
3 (Total Sel
: 40)
31
(77.5%) 3 (7.5%) 6 (15%) 30 (75%) 5 (15%) 5 (15%) 32 (80%) 2 (5%) 6 (15%)
Rata-rata
(%) 64.16 14.72 21.11 65 13.89 22.77 66.66 13.89 19.44
Apoptosis Nekrosis Hidup
Rata-Rata Pengamat 1 64.16 14.723 21.11
Rata-Rata Pengamat 2 65 13.89 22.776
Rata-Rata Pengamat 3 66.667 13.89 19.443
Rata-Rata Keseluruhan(%)
±SD 65.27±1.27 14.16±0.48 20.94±1.423
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
61
2.2 Perlakuan dengan kontrol positif doksorubisin
Sel Pengamat 1 Pengamat 2 Pengamat 3
Bagian Apoptosis Nekrosi
s Hidup
Apoptosi
s
Nekrosi
s Hidup
Apoptosi
s
Nekrosi
s Hidup
Doksorubisin 1 93.75 0 6.25 93.75 0 6.25 81.25 12.5 6.25
Doksorubisin 2 100 0 0 85.71 14.28 0 100 0 0
Doksorubisin 3 90 0 10 90 0 10 90 0 10
Rata-rata 94.58 0 5.41 93.75 4.76 5.41 90.41 4.16 5.41
Apoptosis Nekrosis Hidup
Rata-Rata Pengamat 1 94.583 0 5.417
Rata-Rata Pengamat 2 93.75 4.76 5.417
Rata-Rata Pengamat 3 90.417 4.167 5.416
Rata-Rata Keseluruhan(%)
±SD 92.916±2.20 2.975±2.59 5.4167±0.0005
2.3 Kontrol Sel
Apoptosis Nekrosis Hidup
Rata-Rata Pengamat 1 1.08 0 98.9
Rata-Rata Pengamat 2 1.08 0 98.9
Rata-Rata Pengamat 3 1.08 0 98.9
Rata-Rata Keseluruhan(%)
±SD 1.08 0 98.9
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
62
Lampiran 2.
Hasil Perhitungan Uji Ekspresi Protein dengan Imunositokimia
Preparat
Reader
1
Reader
2
Reader
3 Total Sel % Reader 1
% Reader
2 %Reader 3 Rata2
Rata-Rata
Seluruh
Kontrol Sel 1 96 111 94 150 64 74 62.66 66.88
Kontrol sel 2 104 98 89 160 65 61.25 55.62 60.62 69.36
Kontrol sel 3 110 90 107 127 86.61 70.86 84.25 80.57
Ekstrak 1 73 62 54 177 41.24 35.02 30.50 35.59
Ekstrak 2 25 20 15 51 49.01 39.21 29.41 39.21 39.22
Ekstrak 3 55 60 47 126 43.65 47.61 37.30 42.85
Doxo 1 49 45 34 127 38.58 35.43 26.77 33.59
Doxo 2 45 34 40 102 44.11 33.33 39.21 38.88 34.32
Doxo 3 43 51 45 152 28.28 33.55 29.60 30.48
Preparat %Rata-rata ± SD
Kontrol Sel 69.36 ± 10.203
Perlakuan Ekstrak 39.22 ± 3.63
Doxorubicin 34.33 ± 4.24
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
63
Lampiran 3. Pengolahan data uji sitotoksik MTT assay
1. Data konsentrasi ekstrak vs Absorbansi
No. konsentrasi
log
konsentrasi absorbansi
(ug/mL)
1 2 3
rata -
rata
1 1500 3.176091259 0.108 0.107 0.119 0.111
2 1200 3.079181246 0.072 0.089 0.086 0.082
3 1000 3 0.079 0.095 0.095 0.090
4 400 2.602059991 0.196 0.205 0.211 0.204
6 100 2 0.430 0.432 0.389 0.417
7 10 1 0.723 0.771 0.777 0.757
8 1 0 0.717 0.812 0.781 0.770
2. Data konsentrasi ekstrak vs viabiitas sel
konsentrasi
ekstrak
keladi tikus
viabilitas
sel
1500 0.259 99.741
1200 -3.203 103.203
1000 -2.328 102.328
400 11.321 88.679
100 36.749 63.251
10 77.338 22.662
1 78.890 21.110
3. Data Absorbansi Kontrol Media dan Kontrol Sel
kontrol
media
konsentrasi
ekstrak
keladi tikus
viabilitas
sel
0.09 1500 0.259 99.741
0.095 1200 -3.203 103.203
0.094 1000 -2.328 102.328
0.167 400 11.321 88.679
0.101 100 36.749 63.251
0.108 10 77.338 22.662
0.109 1 78.890 21.110
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
64
4. Data viabilitas sel dengan tiga replikasi
viabilitas sel
v1 v2 v3
rata -
rata SD
-0.139 -0.259 1.174 0.259 0.795
-4.437 -2.407 -2.766 -3.203 1.083
-3.601 -1.691 -1.691 -2.328 1.103
10.366 11.441 12.157 11.321 0.901
38.301 38.540 33.406 36.749 2.897
73.279 79.009 79.725 77.338 3.533
72.563 83.904 80.203 78.890 5.783
5. Grafik konsentrasi vs % rata-rata sel hidup
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
65
6. Grafik log lonsentrasi VS viabilitas sel
-10.0
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
80.0
90.0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
via
bil
itas
sel
(%)
log konsentrasi
log konsentrasi vs viabilitas sel
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
66
Lampiran 4. Dokumentasi uji sitotoksik MTT assay
Konsentrasi (µg/mL) Sebelum diberi MTT Sesudah diberi MTT
200
1200
1500
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
67
Lampiran 5. Dokumentasi uji double staining
Keterangan Gambar
Double staining Kontrol Sel
Double staining Ekstrak Keladi Tikus (1)
Double staining Ekstrak Keladi Tikus (2)
Double staining Ekstrak Keladi Tikus (3)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
68
Double staining Doksorubisin (1)
Double staining Doksorubisin (2)
Double staining Doksorubisin (3)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
69
Lampiran 6. Dokumentasi uji imunositokimia
Keterangan Gambar
Kontrol sel (1)
Kontrol sel (2)
Kontrol sel (3)
Perlakuan dengan ekstrak keladi tikus (1)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
70
Perlakuan dengan ekstrak keladi tikus (2)
Perlakuan dengan ekstrak keladi tikus (3)
Perlakuan dengan Doksorubisin (1)
Perlakuan dengan Doksorubisin (2)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
71
Perlakuan dengan Doksorubisin (3)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
72
Lampiran 7.
Hasil analisis statistik pada uji imunositokimia dengan R
a. Uji Normalitas
Rata-rata Kontrol vs Rata-rata Ekstrak
Nilai p>0.05 maka kedua data berdistribusi normal
Rata-rata Kontrol vs Rata-rata Dokso
Nilai p>0.05 maka kedua data berdistribusi normal
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
73
Rata-rata Ekstrak keladi tikus VS Rata-rata Doksorubisin
Nilai p-value > 0,05 berarti kedua data terdistribusi normal
b. Uji Kesamaan Varian
Rata-rata kontrol VS Rata rata Ekstrak
Nilai p-value > 0,05 berarti kedua data memiliki kesamaan varian
Rata-rata kontrol VS Rata-rata Doksorubisin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
74
Nilai p-value > 0,05 berarti data memiliki kesamaan varian.
Rata-rata ekstrak VS rata-rata Doksorubisin
Nilai p-value > 0,05 berarti data memiliki kesamaan varian
c. Uji t-berpasangan
Kontrol Sel vs Pemberian Ekstrak keladi tikus
Nilai p-value < 0,05 berarti data berbeda signifikan
Kontrol sel vs doksorubisin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
75
Nilai p-value < 0,05 berarti data berbeda signifikan
Ekstrak VS doksorubisin
Nilai p-value < 0,05 berarti data tidak berbeda signifikan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
76
Lampiran 8. Perhitungan IC50 Doksorubisin dengan program R
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
77
Lampiran 9. Perhitungan IC50 ekstrak keladi tikus dengan program R
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
78
Lampiran 10. Surat keterangan hasil determinasi tanaman keladi tikus
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
79
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi dengan judul “UJI AKTIVITAS
ANTIKANKER EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN
KELADI TIKUS (Typhonium flagelliforme (Lodd.)
Blume) TERHADAP SEL KANKER KOLON WiDr
MELALUI PENEKANAN EKSPRESI PROTEIN
COX-2” dengan nama lengkap Handika Immanuel
merupakan anak pertama dari dua bersaudara pasangan
Bapak Nanang Handoko dan Ibu Hanny Buntoro. Penulis dilahirkan di Cirebon, pada
tanggal 11 Pebruari 1993. Penulis menempuh pendidikan formal di TK Kristen BPK
Penabur Cirebon (1997-1999), SD Kristen BPK Penabur Cirebon (1999-2005), SMP
Kristen 1 BPK Penabur Cirebon (2005-2008), dan SMA Kristen 1 BPK Penabur
Cirebon (2008-2011). Penulis melanjutkan studi di Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2011. Semasa perkuliahan, penulis memiliki
pengalaman sebagai Asisten Dosen Praktikum Kimia Dasar (2012). Penulis aktif
dalam mengikuti kegiatan kepanitiaan seperti anggota dari seksi P3K dalam acara
Pharmacy Performance (2011), dan sebagai seksi perlengkapan dalam acara Latihan
Kepemimpinan I ISMAFARSI (2013). Penulis juga aktif dalam kegiatan organisasi
seperti Persekutuan Mahasiswa Kristen Apostolos sebagai seksi creativity and care
(2012-2013), Ikatan Senat Mahasiswa Farmasi Seluruh Indonesia), serta Dewan
Perwakilan Mahasiswa Fakultas (DPMF) Farmasi sebagai anggota dari divisi Quality
Control (2014-2015).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI