UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK HEKSAN
DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)
TERHADAP KULTUR SEL RAJI
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh:
Clara Sinta NIM : 058114024
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2009
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK HEKSAN
DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)
TERHADAP KULTUR SEL RAJI
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh:
Clara Sinta
NIM : 058114024
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2009
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
Pengesahan Skripsi Berjudul
UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK HEKSAN
DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)
TERHADAP KULTUR SEL RAJI
Oleh :
Clara Sinta
NIM : 058114024
Dipertahankan di Hadapan Panitia Penguji Skripsi
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
pada tanggal 23 April 2009
Mengetahui Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Dekan
Rita Suhadi, M.Si., Apt.
Pembimbing :
drh. Renny Kusumastuti, M. P.
Panitia Penguji : Tanda tangan
1. drh. Renny Kusumastuti, M. P. …………….
2. Yohanes Dwiatmaka, M. Si. …………….
3. C. M. Ratna Rini Nastiti, M. Si., Apt. …………….
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
Kita hidup dengan apa yang kita dapat,
kita membangun kehidupan dengan yang kita beri
(Sir Winston Churchill)
Skripsi ini kupersembahkan untuk :
Bapak & Ibuku tercinta
Kakak, Adik-adikku
Cinta, teman-teman & alamamaterku
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PRAKATA
Puji syukur penulis haturkan pada Tuhan Yang Maha Pengasih dan
Penyayang atas segala rahmat dan penyertaan-Nya sehingga penulis dapat
menyelesaikan laporan akhir yang berjudul Uji Sitotoksisitas Ekstrak Heksan
Daun Sirih Merah (Piper Crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel Raji
dengan baik. Laporan ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh
gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi.
Laporan akhir ini tidak akan dapat terselesaikan tanpa dukungan dan
bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dala kesempatan ini penulis ingin
mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma Yogyakarta.
2. drh. Renny Kusumastuti, M. P. selaku Dosen Pembimbing yang telah
memberikan ilmu, bimbingan dan pengetahuan baru kepada penulis dengan
penuh kesabaran dan ketulusan.
3. Yohanes Dwiatmaka, M. Si. dan C. M. Ratna Rini Nastiti, M. Si., Apt. selaku
dosen penguji yang telah berkenan menguji dan memberikan saran dan kritik
yang membangun bagi penulis.
4. Bu Haryati, Mas Anief dan Mba Yuli LPPT UGM atas pendampingan dan
pengarahannya selama penelitian.
5. Bapak, Ibu, Mas Pandu, Imel, Dewa dan Yoyo untuk segala dukungan baik
material maupun cinta yang diberikan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
6. Erlin, Presti dan Rini buat kerjasama, suka duka, dan kebersamaannya selama
di laboratorium.
7. Teman-teman UKKA dan teman-teman Farmasi Sains dan Teknologi buat
persahabatan kita di farmasi.
8. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah membantu
dalam penyusunan laporan akhir ini.
Penulis menyadari sepenuhnya bahwa penulisan laporan akhir ini masih
banyak kekurangan dan kesalahan yang tidak terlepas dari keterbatasan dan
kekurangan penulis. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang
membangun dari semua pihak. Semoga laporan ini dapat memberikan manfaat
dalam perkembangan ilmu pengetahuan.
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak
memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali telah disebutkan dalam
kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Yogyakarta, 18 April 2009
Penulis,
Clara Sinta
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
INTISARI
Kanker limfoma merupakan salah satu penyakit penyebab kematian utama di dunia. Pengobatan kanker dengan obat tradisional telah banyak dikembangkan, salah satunya adalah daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui nilai LC50 ekstrak heksan daun sirih merah terhadap kultur sel Raji (sel kanker limfoma).
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan rancangan lengkap pola satu arah. Metode ekstraksi yang dilakukan adalah perkolasi dan uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah yang diperoleh dilakukan dengan metode direct counting. Dari hasil penelitian ini dapat dihitung persen kematian sel yang kemudian dilakukan analisis probit untuk menentukan nilai LC50.
Berdasarkan hasil penelitian diperoleh nilai LC50 ekstrak heksan daun sirih merah terhadap sel Raji sebesar 150,583µg/ml.
Kata kunci : sitotoksisitas, ekstrak heksan, daun sirih merah, sel Raji, LC50
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
ABSTRACT
Lymphoma Cancer is one of the diseases which causes death. Piper crocatum leaves have been used for traditional cancer treatment. The aim of this research was to determine LC50 value of hexane extract of Piper crocatum Ruiz & Pav leaves on Raji cell culture.
This research was pure experimental with one way completely randomized design. Extraction method was conducted with percolation and cytotoxicity assay was carried out by using direct counting method. Percentage of death cells was calculated and the LC50 value was analyzed with probit statistic.
From the result we revealed that the hexane extract of Piper crocatum Ruiz & Pav leaves showed cytotoxicity effect on Raji cell culture with the LC50
value of 150,583 μg/ml.
Key words : cytotoxicity, hexane fraction, Piper crocatum Ruiz & Pav, Raji cell culture, LC50
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
DAFTAR ISI
HALAMAN SAMPUL...........................................................................…. i
HALAMAN JUDUL.................................................................................... ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING....................................... .. iii
HALAMAN PENGESAHAN ................................................................ ... iv
HALAMAN PERSEMBAHAN.................................................................. v
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI………………………… vi
PRAKATA.................................................................................................. vii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA..................................................... ix
INTISARI...............................................................................................…. x
ABSTRACT............................................................................................ ….. xi
DAFTAR ISI......................................................................................... ….. xii
DAFTAR TABEL................................................................................. ….. xv
DAFTAR GAMBAR................................................................................... xvi
DAFTAR LAMPIRAN............................................................................. .. xviii
BAB I PENGANTAR............................................................................... .. 1
A. Latar Belakang............................................................................... 1
1. Permasalahan............................................................................ 3
2. Keaslian penelitian.................................................................... 3
3. Manfaat penelitian..................................................................... 3
B. Tujuan Penelitian………………………………………………… 3
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA…………………………………….. 4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
A. Tanaman Sirih Merah................................................................... . 4
1. Keterangan Botani.................................................................... 4
2. Deskripsi Tanaman................................................................... 4
3. Kandungan Kimia..................................................................... 5
4. Khasiat dan Penggunaan........................................................... 5
B. Ekstraksi..…………..…………..................................................... 5
C. Perkolasi......................................................................................... 6
D. Minyak Atsiri................................................................................. 7
E. Kanker............................................................................................ 8
F. Sel Raji........................................................................................... 9
G. Senyawa Antikanker …………………………………………… 9
H. Uji Sitotoksisitas....................…………………………………… 10
1. Metode MTT……………………………………………….… 10
2. Metode direct counting.......................................................... .. 10
I. Landasan Teori…………………………………………………… 11
J. Hipotesis………………………………………………………… 12
BAB III METODOLOGI PENELITIAN................................................… 13
A. Jenis dan Rancangan Penelitian...............................................….. 13
B. Variabel dan Definisi Operasional................................................ 13
1. Variabel.................................................................................. .. 13
2. Definisi operasional.................................................................. 13
C. Alat dan Bahan............................................................................... 14
1. Alat.......................................................................................... . 14
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
2. Bahan........................................................................................ 14
D. Tata Cara Penelitian....................................................................... 15
1. Pengumpulan dan Determinasi Daun Sirih Merah................... 15
2. Pembuatan Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah....................... 15
3. Ekstraksi Simplisia Daun Sirih Merah….................................. 16
4. Propagasi dan Panen Sel Raji................................................... 16
a. Propagasi Sel Raji............................................................. 16
b. Panen Sel Raji ................................................................. 17
5. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah Pada Sel Raji.. 17
a. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT..................…….. 17
b. Uji sitotoksisitas dengan metode Direct Counting........... 18
6. Analisis Hasil............................................................................ 18
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN..................................................... 20
A. Pengumpulan dan Determinasi Daun Sirih Merah........................ 20
B. Pembuatan Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah........................... 20
C. Ekstraksi Simplisia Daun Sirih Merah........................................... 21
D. Propagasi dan Panen Sel Raji…………………………………… 24
D. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah Pada Sel Raji... 26
1. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT.................................. .. 26
2. Uji sitotoksisitas dengan metode Direct Counting.................. . 29
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan………………………………………….. ...……….. 39
B. Saran………………………………. ……………………………. 39
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
DAFTAR PUSTAKA…………………………………………….………. 40
BIOGRAFI PENULIS………………………………………………….… 56
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
DAFTAR TABEL
Tabel I Hasil pengamatan profil KLT ekstrak heksan daun sirih merah …... 23
Tabel II Tabel nilai absorbansi ekstrak heksan daun sirih merah pada ber-
bagai konsentrasi dengan metode MTT.......................................... 27
Tabel III Hasil perhitungan sel Raji pada masing-masing konsentrasi ekstrak
heksan daun sirih merah dengan metode Direct Counting ............. 32
Tabel IV Hasil perhitungan sel Vero pada masing-masing konsentrasi ekstrak
heksan daun sirih merah dengan metode Direct Counting.............. 32
Tabel V Data % kematian sel Raji dan harga probitnya setelah inkubasi
24jam dengan perlakuan ekstrak heksan daun sirih merah.............. 34
Tabel VI Data % kematian sel Vero dan harga probitnya setelah inkubasi
24 jam dengan perlakuan ekstrak heksan daun sirih
merah ........................................................................................... 34
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Reaksi reduksi MTT oleh enzim dehidrogenase mitokondria …… 26
Gambar 2. Kurva konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah terhadap
hasil perhitungan % kematian sel.................................................... 28
Gambar 3. Sel yang hidup dan sel yang mati setelah pemberian trypan
blue pada haemocytomoter di bawah pengamatan mikroskop
dengan perbesaran 100x ................................................................. 30
Gambar 4. Kontrol sel Raji dan kontrol sel Vero di bawah
pengamatan mikroskop dengan perbesaran 100x ........................... 31
Gambar 5. Kurva Konsentrasi Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah
terhadap % Kematian Sel Raji dan Sel Vero .................................. 33
Gambar 6. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah terhadap
harga probit pada sel Raji................................................................ 34
Gambar 7. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah terhadap
harga probit pada sel Vero .............................................................. 35
Gambar 8. Tanaman Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) …………… 42
Gambar 9. Laminar Air Flow…………………………………………………. 42
Gambar 10. Inverted Microscope…………………………………………….. 42
Gambar 11. 96well plate, tabung conical steril dan flask ……………………. 43
Gambar 12. Cell counter dan haemocytometer ………………………………. 43
Gambar 13. Pengamatan sel Raji pada perlakuan 300 µg/ml ………………... 44
Gambar 14. Pengamatan sel Raji pada perlakuan 275 µg/ml ………………... 44
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvii
Gambar 15. Pengamatan sel Raji pada perlakuan 250 µg/ml ………………... 44
Gambar 16. Pengamatan sel Raji pada perlakuan 225 µg/ml ………………... 44
Gambar 17. Pengamatan sel Raji pada perlakuan 200 µg/ml ………………... 44
Gambar 18. Pengamatan sel Raji pada perlakuan 175 µg/ml ………………... 44
Gambar 19. Pengamatan sel Raji pada perlakuan 150 µg/ml ………………... 45
Gambar 20. Pengamatan sel Raji pada perlakuan 125 µg/ml ………………... 45
Gambar 21. Pengamatan sel Vero pada perlakuan 800 µg/ml ………………... 45
Gambar 22. Pengamatan sel Vero pada perlakuan 700 µg/ml ………………... 45
Gambar 23. Pengamatan sel Vero pada perlakuan 600 µg/ml ………………... 45
Gambar 24. Pengamatan sel Vero pada perlakuan 500 µg/ml ………………... 45
Gambar 25. Pengamatan sel Vero pada perlakuan 400 µg/ml ………………... 45
Gambar 26. Pengamatan sel Vero pada perlakuan 300 µg/ml ………………... 45
Gambar 27. Pengamatan sel Vero pada perlakuan 200 µg/ml ………………... 46
Gambar 28. Pengamatan sel Vero pada perlakuan 100 µg/ml ………………... 46
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xviii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Bahan dan Peralatan yang Digunakan dalam Penelitian ……….. 42
Lampiran 2. Hasil Pengamatan Sel Raji dan Sel Vero dengan Mikroskop
dengan Perbesaran 100x Setelah Pemberian Ekstrak Heksan
Daun Sirih Merah pada Inkubasi 24 jam ………………………. 44
Lampiran 3. Tabel Probit …………………………………………………… 47
Lampiran 4. Perhitungan LC50 Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah terhadap
Sel Raji Dan Sel Vero …………………………………………. 48
Lampiran 5. Hasil Uji Signifikansi Antara Perlakuan dengan Kontrol dengan
Z-test…………………………………………………….. …….. 52
Lampiran 6. Hasil Uji KLT Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah……………… 54
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar belakang
Kanker merupakan penyakit nomor satu yang mematikan di dunia dan
angka kematian yang disebabkan penyakit kanker juga terus bertambah. Kanker
adalah suatu penyakit yang berhubungan dengan pertumbuhan sel tubuh yang tak
terkendali, dimana sel yang tak terkendali ini juga menyebabkan kerusakan
jaringan tubuh yang sehat lainnya. Kanker dapat muncul di setiap jenis organ
tubuh, ada yang ganas dan ada yang jinak (Anita, 2008).
Efek merugikan dari pertumbuhan kanker adalah gangguan aktivitas sel
normal, jaringan, dan organ atau sampai pada kematian sel karena terjadinya
perubahan sel yang fungsional menjadi sel yang tidak fungsional. Tumor
menghancurkan jaringan normal dengan tekanan dan gangguan pada darah dan
saraf serta menembus barrier kulit, internal membran atau epitelia (Wolfe,1993).
Salah satu jenis kanker yang banyak menyerang adalah kanker limfoma
Limfoma adalah kanker sel darah putih yang disebut juga limfosit-B atau Non-
Hodgkin Limfoma (NHL). Tumor NHL dapat terjadi di tulang, perut, hati, otak,
atau bagian tubuh yang lain. Tanda pertama NHL adalah bengkak pada kelenjar
getah bening, demam, keringat malam dan hilang berat badan lebih dari sepuluh
persen. Resiko NHL ditingkatkan oleh infeksi virus Epstein-Barr dan oleh faktor
genetik (Anonim, 2009a). Kultur sel Raji merupakan kultur sel kanker yang
diturunkan dari penyakit Limfoma Burkitt (Anonim, 2009b).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
Banyak bukti empiris orang sembuh dengan beragam penyakit setelah
mengkonsumsi daun sirih merah. Sirih merah dipakai untuk mengobati diabetes,
kanker, peradangan, hipertensi, hepatitis, leukimia dan ambeien. Senyawa
fitokimia yang terkandung dalam daun sirih merah telah diketahui meliputi
flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin, dan minyak atsiri (Sudewo, 2005).
Suatu penelitian menggunakan ekstrak etanolik daun sirih merah terbukti
bersifat sitotoksik terhadap kultur sel Raji dengan nilai LC50 sebesar 395,5µg/ml
(Kusumaningtyas, 2008). Mengacu pada penelitian tersebut, maka perlu dilakukan
penelitian untuk mengetahui nilai LC50 ekstrak heksan daun sirih merah. Heksan
merupakan pelarut dengan kepolaran yang rendah (non polar). Dalam ekstrak
heksan tersebut diharapkan agar kandungan senyawa-senyawa non polar yang
tersari mempunyai konsentrasi lebih besar daripada dalam ekstrak etanol. Hal ini
dikarenakan dalam ekstrak etanol senyawa yang tersari lebih banyak, dengan
range kepolaran yang cukup jauh, sehingga tidak hanya senyawa non polar saja
yang akan tersari, namun senyawa polar dan semipolar pun akan ikut tersari,
sehingga konsentrasi senyawa non polar dalam ekstrak etanol ini akan lebih kecil.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah senyawa-senyawa nonpolar
yang berada dalam ekstrak heksan tersebut lebih berpotensi sebagai senyawa
sitotoksik terhadap kultur sel Raji yang ditunjukkan dengan nilai LC50. Dengan
adanya hasil tersebut diharapkan ekstrak heksan dari daun sirih merah ini akan
memberikan daya sitotoksik yang lebih besar dan lebih berpotensi sebagai
antikanker.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
1. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan di atas, maka
dirumuskan permasalahan yaitu berapakah nilai LC50 ekstrak heksan daun sirih
merah terhadap kultur sel Raji?
2. Keaslian penelitian
Sejauh pengetahuan penulis, belum pernah dilakukan penelitian
mengenai uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah terhadap kultur sel
Raji. Adapun penelitian yang sudah pernah dilakukan adalah Uji Sitotoksisitas
Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah terhadap Kultur Sel Raji (Kusumaningtyas,
2008).
3. Manfaat penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai khasiat
dan efek sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah terhadap kultur sel Raji.
Diharapkan dengan adanya informasi ini, penggunaan bahan alam sebagai obat
kanker semakin dikembangkan.
B. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi sitotoksik ekstrak
heksan daun sirih merah dengan mencari nilai LC50 ekstrak heksan daun sirih
merah terhadap sel Raji.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Tanaman Sirih Merah
1. Keterangan botani
Famili : Piperaceae
Genus : Piper
Spesies : Piper crocatum Ruiz & Pav
Sinonim : Piper ornatum N. E. Br.
Nama daerah : Sirih merah
Nama Inggris : Red betle vine (Anonim, 2007)
2. Deskripsi Tanaman
Tanaman sirih merah tumbuh menjalar seperti halnya sirih hijau.
Batangnya bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga. Daunnya
bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi rata, dan
permukaannya mengkilap dan tidak berbulu. Panjang daunnya bisa mencapai 15-
20 cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak putih keabu-abuan bagian bawah
daun berwarna merah hati cerah. Daunnya berlendir, berasa sangat pahit, dan
beraroma wangi khas sirih. Batangnya beruas dengan jarak buku 5-10 cm. Di
setiap buku tumbuh bakal akar (Sudewo, 2005).
Sirih merah bisa tumbuh dengan baik di tempat yang teduh dan tidak
terlalu banyak terkena sinar matahari. Jika terkena sinar matahari langsung pada
siang hari secara terus-menerus warna merah daunnya bisa menjadi pudar, buram
dan kurang menarik (Sudewo, 2005).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
3. Kandungan Kimia
Berdasarkan penelitian yang pernah dilakukan menunjukkan bahwa sirih
merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak
atsiri (Sudewo, 2005).
4. Khasiat dan penggunaan
Tumbuhan sirih merah digunakan sebagai obat di masyarakat, antara lain
sebagai anti diabetes, jantung koroner, radang prostat, TBC, asam urat dan
antikanker (Sudewo, 2005).
Secara empiris ekstrak daun sirih merah dalam pemakaian secara tunggal
atau diformulasikan dengan tanaman obat lainnya mampu membasmi aneka
penyakit. Efek zat aktif yang terkandung dalam daun sirih merah dapat
merangsang saraf pusat dan daya pikir. Di samping itu, juga memiliki efek
pencegah ejakulasi dini, antikejang, antiseptik, analgetik, antiketombe, pelindung
organ hati, antidiare, antikoagulan, mempertahankan kekebalan tubuh, dan
penghilang bengkak. Daun sirih merah juga mampu mengatasi penyakit seperti
peradangan akut pada organ tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara
dan kanker rahim, tifus, leukemia, TBC, lemah syahwat, ambeien, batuk, maag
kronis, jantung koroner, dan darah tinggi (Sudewo, 2005).
B. Ekstraksi
Ekstraksi atau penyarian adalah kegiatan penarikan kandungan kimia
yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan
pelarut cair (Anonim, 2000). Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan
pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan
(Anonim, 1995).
Faktor yang mempengaruhi kecepatan penyarian adalah kecepatan difusi
zat yang larut melalui lapisan-lapisan batas antara cairan penyari dengan bahan
yang mengandung zat tersebut. Proses penyarian dapat dipisahkan menjadi
pembuatan serbuk, pembasahan, penyarian dan pemekatan. Cara penyarian dapat
dibedakan menjadi infundasi, maserasi, perkolasi, dan penyarian
berkesinambungan (Anonim, 1986).
C. Perkolasi
Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan
cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Kekuatan yang
berperan dalam perkolasi antara lain kekentalan, daya larut, tegangan permukaan,
difusi, osmosa, daya kapiler dan daya geseran (friksi). Cara perkolasi lebih baik
dibandingkan dengan cara maserasi karena aliran cairan penyari menyebabkan
adanya pergantian larutan yang terjadi dengan larutan yang konsentrasinya lebih
rendah, sehingga meningkatkan derajat perbedaan konsentrasi (Anonim, 1986).
Alat yang digunakan untuk perkolasi disebut perkolator, cairan yang
digunakan untuk menyari disebut cairan penyari atau menstrum, larutan zat aktif
yang keluar dari perkolator disebut perkolat, sedangkan sisa setelah dilakukannya
penyarian disebut ampas atau sisa perkolasi (Anonim, 1986).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
D. Minyak Atsiri
Minyak atsiri terdiri dari molekul-molekul hidrokarbon yang terdiri dari
10-15 atom karbon. Kelarutan minyak atsiri ini adalah pada pelarut nonpolar
sehingga ekstraksinya pun juga dilakukan dengan pelarut nonpolar (Houghton &
Raman, 1998).
Berbagai alkohol, aldehida, keton dan ester yang mudah menguap atau
atsiri terdapat dalam tumbuhan walaupun biasanya terdapat hanya sedikit sekali.
Walaupun konsentrasinya rendah, senyawa ini penting dari segi estetika oleh
karena perannya pada citarasa, dan bau makanan, bunga, parfum dan sebagainya.
Minyak atsiri berperan pada daya tariknya untuk serangga penyerbuk serta hewan
penyebar biji. Selain itu, senyawa ini juga bertindak sebagai antibiotika, hormon
luka, dan perangsang perkecambahan biji (Robinson, 1995).
Minyak atsiri dalam tumbuhan terdapat dalam jumlah yang sangat kecil
sehingga diperlukan bahan awal yang sangat besar jumlahnya untuk mengisolasi
senyawa yang memadai untuk diteliti. Ada tiga cara umum untuk mengambil
komponen atsiri dalam tumbuhan yaitu destilasi, ekstraksi memakai pelarut, dan
pengaliran udara atau aerasi. Destilasi pada tekanan dan suhu rendah
memungkinkan terjadinya penguraian oleh enzim, sehingga menimbulkan
perubahan kandungan jaringan. Cara ekstraksi dengan pelarut dapat dilakukan
pada keadaan khusus terutama untuk senyawa yang tidak begitu polar. Pada
proses aerasi hanya senyawa senyawa yang dikeluarkan ke udara saja yang
terisolasi dengan mengalirkan udara melalui bahan tumbuhan untuk jangka waktu
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
yang lama dan mengembunkan senyawa yang terbawa udara dalam penampung
yang didinginkan (Robinson, 1995).
E. Kanker
Kanker adalah kelainan genetik yang merupakan akibat dari peristiwa-
peristiwa mutasional berganda. Mutasi-mutasi tersebut mengubah fungsi normal
suatu sel sehingga sel itu menjadi memiliki ciri-ciri sebagai berikut : (1) sel
menjadi immortal, yaitu mampu melakukan pembelahan sel secara tak terbatas,
(2) sel menjadi independen dari kontrol-kontrol selular normal yang membatasi
pertumbuhan dan pembelahan, dan (3) sel itu menjadi invasif dengan menyebar ke
jaringan-jaringan lain, dalam sebuah proses yang disebut metastatis. Satu sel
kanker mampu membelah menjadi massa klonal sel yang disebut tumor.
Onkogenesis adalah proses perubahan sel normal menjadi sel kanker. Sedangkan
neoplasma adalah populasi sel-sel berpotensi kanker yang yang tumbuh secara
lepas kendali. Jika neoplasma terbatas di tempat asalnya dan tak memiliki
kecenderungan untuk tumbuh lagi setelah disingkirkan, maka neoplasma itu
disebut jinak (benign). Jika neoplasma bermetastatis dari tempat asalnya, maka
neoplasma itu menjadi ganas (malignant) dan membahayakan jiwa (Elfrod and
William, 2007).
Untuk mempelajari kanker secara in vitro, sel-sel dapat ditumbuhkan
menggunakan teknik-teknik kultur yang disebut kultur sel atau kultur jaringan.
Sejumlah sel ditempatkan dalam vial berdasar datar yang terbuat dari gelas atau
plastik. Vial tersebut sudah diberi perlakuan dan berisikan medium kaya nutrien.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
Sel-sel kemudian turun dan melekat ke dasar wadah, sel-sel itupun mulai tumbuh
dan disebut sebagai kultur primer (Elfrod and William, 2007).
F. Sel Raji
Sel Raji merupakan kultur sel kanker yang diturunkan dari penyakit
Limfoma Burkitt ( Anonim, 2009b). Limfoma adalah kanker sel darah putih yang
disebut limfosit-B atau disebut juga dengan NHL. Sel tersebut cepat
menggandakan diri dan membentuk tumor. NHL disebabkan oleh rangsangan
jangka panjang sistem kekebalan tubuh. Jika sel-B menggandakan diri dengan
cepat selama bertahun-tahun, makin banyak mutasi atau perubahan terjadi pada
sel ini. Beberapa mutasi ini dapat menyebabkan kanker (Anonim, 2009a).
Resiko NHL ditingkatkan oleh infeksi virus Epstein-Barr dan oleh faktor
genetis. Tumor NHL dapat terjadi pada tulang, perut, hati, otak, atau bagian tubuh
lain. Tanda pertama NHL adalah bengkak pada kelenjar getah bening, demam,
keringat malam, dan hilang berat badan lebih dari sepuluh persen. Gejala ini
terjadi dengan beberapa penyakit lain yang berhubungan dengan AIDS (Anonim,
2009a).
G. Senyawa Antikanker
Menurut National Institute of Health (NIH), senyawa antikanker
dikategorikan dalam lima klasifikasi berdasarkan nilai LC50. Klasifikasi tersebut
meliputi Kategori 1, senyawa antikanker dengan strongest LC50 = 0,19-0,528
mg/ml; Kategori 2, senyawa antikanker dengan moderate to strong LC50 = 0,528-
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
1,197 mg/ml; Kategori 3, senyawa antikanker dengan moderate LC50 = 1,259-
2,515 mg/ml; Kategori 4, senyawa antikanker dengan weak to moderate LC50 =
2,528-4,939 mg/ml; dan Kategori 5, senyawa antikanker dengan weak LC50 > 5,0
mg/ml (Mazzio,2009).
H. Uji Sitotoksisitas
1. Metode MTT
Metode MTT merupakan uji sitotoksik yang cepat, sensitif, akurat dan
sejumlah besar sampel dapat diukur secara otomatis dengan spektrofotometer.
Metode ini didasarkan pada aktivitas enzim dehidrogenase mitokondria untuk
mengubah substrat MTT yang larut air (berwarna kuning), menjadi formazan
berwarna biru tua yang tidak larut air (Doyle and Griffiths, 2000).
Pada metode MTT dilakukan pengukuran absorbansi sampel dengan
menggunakan ELISA plate reader pada panjang gelombang 570 nm. Hasil
pengukuran bersifat kuantitatif, dimana terdapat hubungan yang linier antara
aktivitas sel dengan absorbansi, dan pertumbuhan atau kematian sel dapat diukur
(Anonim, 2009c).
2. Metode Direct counting
Metode yang paling umum digunakan dalam perhitungan sel yang
efisien dan akurat adalah menggunakan haemocytometer. Dalam metode ini
digunakan suatu bilik hitung dengan kedalaman 0,1 mm dan berbentuk persegi
untuk mempermudah penghitungan. Suspensi sel yang diisikan ke dalam chamber
dapat diamati di bawah mikroskop dan sel yang terhitung terdapat pada angka
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
skala. Dari hasil perhitungan ini, jumlah sel per ml suspensi dapat dihitung.
Menggunakan zat warna seperti trypan blue, penghitungan sel yang hidup dan sel
yang tidak hidup dapat dilakukan. Trypan blue ini hanya bisa menembus
membran pada sel yang mati. Ketika suspensi sel dilemahkan dengan trypan blue,
sel yang sehat akan tetap kecil dan bergerak, sedangkan sel yang rusak atau mati
akan membengkak, lebih luas dan berwarna biru tua (Doyle and Griffiths, 2000).
Perhitungan sel menggunakan haemocytometer cukup murah dan dapat
melihat langsung sel yang kita hitung. Namun prosedur ini cukup lama dan mudah
terjadi kesalahan pada sampling dan jumlah sel yang dihitung pada saat transfer
sel ke dalam chamber, sehingga harus dipastikan sel tercampur dengan baik dalam
suspensi dan sel dalam suspensi tidak membentuk agregat yang dapat membuat
perhitungan tidak akurat (Freshney, 1986).
I. Landasan Teori
Kanker terjadi karena perubahan sel yang mengalami pertumbuhan tidak
normal dan tidak terkontrol. Kanker limfoma termasuk penyakit kanker yang
paling banyak diperbincangkan karena keganasannya. Limfoma berhubungan
dengan AIDS dan sering juga disebut Limfoma Non-Hodgkin (NHL). NHL
disebabkan oleh rangsangan jangka panjang sistem kekebalan tubuh. Jika sel-B
menggandakan diri dengan cepat selama bertahun-tahun, makin banyak mutasi
atau perubahan terjadi pada sel ini. Beberapa mutasi ini dapat menyebabkan
kanker. Resiko NHL ditingkatkan oleh infeksi virus Epstein-Barr dan oleh faktor
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
genetis. Tumor NHL dapat terjadi pada tulang, perut, hati, otak, atau bagian tubuh
lain.
Pengobatan kanker dengan obat tradisional telah banyak dikembangkan,
salah satunya adalah daun sirih merah (Piper crocatum). Sekilas bila dilihat dari
bentuk dan namanya, sirih merah dan sirih terlihat sama. Banyak fungsi daun sirih
merah ini yang tidak dimiliki daun sirih biasa. Banyak bukti empiris orang
sembuh dengan beragam penyakit setelah mengkonsumsi sirih merah. Senyawa
fitokimia yang terkandung dalam daun sirih merah meliputi alkaloid, saponin,
tannin, flavonoid dan minyak atsiri. Selain bersifat antiseptik seperti sirih hijau,
sirih merah juga bisa dipakai mengobati diabetes, kanker, peradangan, hipertensi,
hepatitis, leukimia dan ambeien.
Mengacu pada hasil penelitian sebelumnya bahwa ekstrak etanolik daun
sirih merah bersifat sitotoksik terhadap sel Raji , maka perlu dilakukan penelitian
untuk mengetahui potensi ekstrak heksan daun sirih merah sebagai senyawa yang
sitotoksik terhadap kultur sel Raji. Ekstrak heksan daun sirih merah diharapkan
mengandung senyawa-senyawa nonpolar yang lebih berpotensi sitotoksik
terhadap kultur sel Raji. Dengan adanya hasil tersebut diharapkan ekstrak heksan
dari daun sirih merah ini akan memberikan daya sitotoksik yang lebih besar dan
lebih berpotensi sebagai antikanker.
J. Hipotesis
Ekstrak heksan daun sirih merah (Piper crocatum) bersifat sitotoksik
terhadap kultur sel Raji.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian daya sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah terhadap
kultur sel Raji ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan
acak lengkap pola searah.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel
a. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak heksan
daun sirih merah yang disajikan dalam bentuk log konsentrasi.
b. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah % kematian sel Raji
yang disajikan dalam bentuk probit.
c. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah suhu, pH,
media, kualitas pereaksi, umur sel Raji dan pelaku penelitian.
d. Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah kematian
alami sel Raji.
2. Definisi operasional
a. Ekstrak heksan daun sirih merah ialah hasil ekstraksi daun sirih merah
(Piper crocatum Ruiz & Pav) dengan pelarut heksan yang dibuat sesuai
prosedur dalam penelitian ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
b. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari ekstrak heksan daun sirih
merah terhadap sel Raji.
c. Sel Raji adalah kultur sel kanker yang diturunkan dari penyakit Limfoma
Burkitt.
d. Kematian sel Raji ditunjukkan dengan terjadinya pembengkakan sel yang
dilanjutkan perubahan warna sel yang transparan menjadi biru tua oleh
penambahan trypan blue.
C. Alat dan Bahan
1. Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas
(Pyrex), timbangan analitik (Denver Instrument XL-610), mesin penyerbuk
(Modifikasi LPPT UGM), perkolator, seperangkat alat KLT, vacuum rotary
evaporator, Mikropipet 0,5 – 10 µl dan 100 – 1000 µl, vortex (Max Mix II
Therolyne), inkubator (Memmer), tabung conical (Nunc), tissue culture flask
(Nunc), lemari pendingin (Sharp), cell counter (Nunc), 96-well plate (Nunc),
spektrofotometer UV, laminar air flow (Labconco), mikroskop (Olympus IMT-2),
haemocytometer (Neubauer).
2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah daun sirih merah
segar ( diambil di pekarangan warga Dusun Ngangkrik, Sleman), kultur sel Raji
(diambil dari stok di Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta),
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
kultur sel Vero (diambil dari stok di Laboratorium Hayati Universitas Gadjah
Mada, Yogyakarta).
Pereaksi-peraksi yang digunakan untuk preparasi ekstraksi dan uji KLT
kandungan senyawa daun sirih merah antara lain heksan, toluen, etil asetat,
metanol, air, amonia, asam asetat, asam formiat, dan semprot vanilin. Sedangkan
untuk uji sitotoksisitas antara lain RPMI 1640 (Sigma), natrium bikarbonat,
Hepes, FBS (Fetal Bovine Serum) 10%, Penisilin-Streptomisin 1% (Gibco), dan
Fungison 0,5% (Gibco); Reagen Stopper : SDS (sodium dodeksil sulfat) dalam
HCl 0,01 N (Merck); MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium
bromide) (Sigma).
D. Tata Cara Penelitian
1. Pengumpulan dan determinasi daun sirih merah
Daun sirih merah yang digunakan diambil dari pekarangan warga Dusun
Ngangkrik, Sleman. Determinasi daun sirih merah dilakukan di laboratorium
Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
2. Pembuatan serbuk simplisia daun sirih merah
Simplisia dibuat dengan memilih daun sirih merah yang masih segar,
dibersihkan dari pengotor dan bagian lain yang tidak diinginkan seperti tanah,
akar, atau batang. Daun sirih merah yang telah dikumpulkan selanjutnya dicuci
dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang melekat,
kemudian ditiriskan sampai sisa-sisa air menghilang. Daun kemudian dikeringkan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
dalam lemari pengering dengan suhu 65-70˚C. Setelah kering, dibersihkan lagi
dari partikel asing lalu diserbuk dengan mesin penyerbuk sampai halus.
3. Ekstraksi simplisia daun sirih merah (Piper crocatum)
Serbuk simplisia sebanyak 100 gram diekstraksi secara perkolasi dengan
pelarut heksan. Perkolasi dilakukan dengan mengalirkan pelarut heksan melalui
serbuk simplisia dalam perkolator. Proses ini dilakukan berulang dengan pelarut
yang baru sampai tetesan terakhir pada perkolasi tidak berwarna lagi. Ekstrak
heksan yang didapat kemudian dipekatkan menggunakan vacum rotary
evaporator kemudian kandungan senyawa diidentifikasi secara KLT.
4. Propagasi dan panen sel Raji
a. Propagasi sel Raji
Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam
penangas air 37oC, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70%. Ampul
dibuka dan sel Raji dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium
RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang,
diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan perlahan.
Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang
sekali lagi. Supernatan dibuang, lalu endapan sel ditambahkan 1 ml medium
penumbuh yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai
homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan
diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37oC dengan aliran 5% CO2. Setelah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan
jumlahnya cukup untuk penelitian (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979;
Sambrook et al, 1989).
b. Panen sel Raji
Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), sel
dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai
volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang
dan sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung
menggunakan haemocytometer dan siap dipakai untuk penelitian (Freshney, 1986;
Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).
5. Uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah pada sel Raji
a. Uji sitotoksisitas menggunakan metode MTT
Pada uji sitotoksisitas ini sebanyak 100 μl ekstrak heksan daun sirih
merah pada tiap konsentrasi dimasukkan ke dalam sumuran 96 well plate yang
telah berisi 100 μl suspensi sel Raji. Untuk kontrol digunakan 100 μl suspensi sel
Raji dalam media penumbuh. Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan selama 24
jam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 (Freshney, 1986;
Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).
Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10
μl MTT 5 μg/ml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu
37oC dalam inkubator dengan aliran CO2 5%. Sel hidup akan bereaksi dengan
MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 100
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
μl reagen stopper SDS pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu
kamar. Serapan setiap sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang
gelombang 570 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang
hidup.
b. Uji Sitotoksisitas dengan Metode Direct Counting
Seratus μl suspensi sel Raji dimasukkan ke dalam sumuran berisi media
RPMI 1640 pada 96-well plate, kemudian ditambah dengan ekstrak heksan daun
sirih merah pada masing-masing konsentrasi. Untuk kontrol digunakan 100 μl
suspensi sel Raji dalam media penumbuh. Selanjutnya plate diinkubasi dalam
inkubator dengan aliran 5% CO2 selama 24 jam pada suhu 37oC. Pada akhir masa
inkubasi, media tiap sumuran diganti dengan 200 μl Trypan blue kemudian
diresuspensi untuk homogenisasi dan diambil 10 μl untuk pengamatan.
Ditempatkan dalam haemocytometer, sel siap dihitung dengan counter dibawah
mikroskop. Pada uji sitotoksisitas terhadap sel Vero, perlakuan dilakukan sama
dengan langkah di atas, namun sebelum penambahan Trypan blue perlu dilakukan
penambahan tripsin terlebih dahulu untuk melepas sel dari dinding well.
6. Analisis hasil
Harga persentase kematian sel pada metode MTT dapat ditentukan
dengan modifikasi rumus Abbot :
% kematian sel = %100×−A
BA ,
Ket : A = Rata-rata absorbansi kontrol
B = Rata-rata absorbansi perlakuan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
Sedangkan untuk menghitung persentase kematian sel pada metode direct
counting, dapat ditentukan dengan :
% kematian sel= %100×+
−+
∑∑ ∑
selmatihidupselhidupselselmatihidupsel
Analisis signifikansi antara perlakuan dan kontrol dilakukan pengolahan data
dengan statistik Z-test
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pengumpulan dan Determinasi Daun Sirih Merah
Daun sirih merah yang digunakan untuk penelitian ini adalah daun sirih
merah segar yang dipetik dari pekarangan rumah warga di Dusun Ngangkrik,
Sleman. Kualitas dan kesamaan kandungan kimia dalam daun sirih merah
dipastikan dengan memanen daun sirih merah dalam satu kali panen di tempat
tumbuh yang sama. Kriteria pemilihan daun sirih merah yang digunakan dalam
penelitian ini adalah daun yang umurnya cukup, dipetik setelah daun ketiga dari
ujung sulur daun agar kandungan senyawa kimianya optimal.
Sebelum digunakan untuk penelitian, daun sirih merah yang sudah
dipanen harus dipastikan terlebih dahulu kebenarannya. Determinasi tanaman
dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah
Mada, Yogyakarta. Berdasarkan determinasi, tanaman ini merupakan daun sirih
merah (Piper crocatum Ruiz & Pav).
B. Pembuatan Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah
Daun sirih merah yang telah dipanen dan dideterminasi lalu dilakukan
sortasi basah yaitu daun sirih merah dibersihkan dari batang, kotoran-kotoran,
debu, tanah, dan partikel asing lainnya. Kemudian daun sirih merah dicuci dengan
air mengalir kemudian dikeringkan dibantu dengan kipas angin. Setelah itu,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
proses pengeringan dilanjutkan ke dalam lemari pengering bersuhu 70°C serta
dipastikan bersih dari cemaran partikel asing.
Daun sirih merah yang sudah kering kemudian diserbuk dengan
menggunakan mesin penyerbuk. Dalam bentuk serbuk, luas permukaan partikel
yang kontak dengan cairan penyari semakin besar sehingga kandungan kimia
dalam sirih merah yang dapat tersari akan lebih maksimal.
C. Ekstraksi Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah
Ekstraksi serbuk simplisia daun sirih merah dalam penelitian ini
dilakukan secara perkolasi dengan menggunakan alat yang disebut perkolator.
Pada metode perkolasi, material atau serbuk simplisia yang akan disari dikemas
dalam sebuah kolom yang mempunyai kran pada bagian dasarnya dengan suatu
filter yaitu kertas saring untuk menahan material dalam kolom tersebut. Pada
proses ekstraksi, kran dibuka kemudian cairan penyari dituangkan dari atas
melewati serbuk simplisia yang akan disari.
Dalam penelitian ini, 100 gram serbuk simplisia diekstraksi dengan
cairan penyari heksan. Heksan merupakan pelarut dengan kepolaran yang sangat
rendah (non polar), sehingga dengan pelarut heksan diharapkan kandungan
senyawa dalam daun sirih merah yang akan tersari nantinya adalah senyawa-
senyawa non polar, dimana senyawa-senyawa non polar tersebut akan dibuktikan
efek sitotoksiknya. Serbuk simplisia daun sirih merah yang sudah dikemas dalam
kolom perkolator tidak langsung dialiri dengan cairan penyari heksan, namun
serbuk simplisia daun sirih merah ini terlebih dahulu direndam dengan penyari
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
heksan selama 24 jam. Hal ini bertujuan untuk memaksimalkan kontak heksan
terhadap pori-pori serbuk simplisia, sehingga diharapkan kandungan senyawa non
polar dalam daun sirih merah dapat tersari secara maksimal dalam pelarut heksan.
Setelah perendaman selama 24 jam, cairan penyari dalam kolom kemudian
dikeluarkan dan ditampung dalam labu Erlenmeyer. Kemudian dilanjutkan dengan
perkolasi, dimana cairan penyari langsung dialirkan melalui serbuk simplisia dan
langsung diteteskan untuk ditampung dalam labu erlenmeyer dengan kecepatan 2-
3 tetes per detik. Proses perkolasi ini dihentikan sampai tetes terakhir yang keluar
dari perkolator sudah bening. Hal ini diasumsikan bahwa kandungan senyawa non
polar telah tersari seluruhnya.
Keuntungan dari metode perkolasi adalah metode ini menggunakan
cairan penyari yang selalu baru. Sedangkan kelemahan metode yang dilakukan
pada penelitian ini adalah cairan penyari yang digunakan selama proses
dibutuhkan dalam jumlah yang banyak.
Kandungan senyawa-senyawa non polar yang ada dalam daun sirih
merah dimungkinkan adalah senyawa-senyawa yang tergolong minyak atsiri.
Minyak atsiri sebagian besar terdiri dari monoterpen, sesquiterpen dan senyawa
fenolik. Sedangkan senyawa-senyawa lain yang bersifat polar seperti alkaloid dan
flavonoid tidak tersari dalam heksan karena hanya larut dalam pelarut yang polar.
Untuk memastikan bahwa senyawa-senyawa yang tersari dalam pelarut
heksan adalah senyawa non polar yaitu minyak atsiri, maka perlu dibuat profil
KLT dari ekstrak heksan daun sirih merah.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
Tabel I. Hasil pengamatan profil KLT ekstrak heksan daun sirih merah Uji Baku
pembanding Hasil
Cineol + Caryophylen - Cavicol -
Minyak Atsiri
Carvacrol - Kinin - Alkaloid Tanin -
Flavonoid Rutin -
Profil KLT ekstrak heksan daun sirih merah menunjukkan hasil positif
mengandung minyak atsiri dengan pembanding baku cineol, sedangkan untuk uji
adanya alkaloid dengan pembanding kinin dan tanin serta uji adanya flavonoid
dengan pembanding rutin hasil ketiganya negatif.
Identifikasi minyak atsiri juga dilakukan dengan menggunakan baku
pembanding yang lain yaitu caryophilen, cavicol dan carvacrol. Namun dari hasil
KLT ternyata hasil ketiganya negatif. Hal ini mungkin disebabkan kadar senyawa-
senyawa tersebut dalam daun sirih merah cukup kecil sehingga senyawa tersebut
tidak dapat terdeteksi dengan uji KLT.
KLT memiliki sensitivitas yang cukup kecil, sehingga senyawa-senyawa
dalam ekstrak heksan yang dimungkinkan memiliki konsentrasi yang kecil tidak
dapat terdeteksi. Untuk penelitian selanjutnya, maka disarankan menggunakan
kromatografi gas. Kromatografi gas mempunyai sensitivitas yang lebih baik
dibandingkan dengan KLT. Batas deteksi senyawa menggunakan KLT hanya
sebesar 0,1-0,01 μg sedangkan pada kromatografi gas memiliki batas deteksi 0,1-
0,01 ng (Wijesekera, 1991). Dengan tingkat sensitivitas yang lebih tinggi ini,
maka diharapkan agar senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun sirih merah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
dapat terdeteksi baik kualitatif maupun kuantitatif. Selain dari segi sensitivitas,
kromatografi gas ini sesuai untuk identifikasi minyak atsiri karena minyak atsiri
mempunyai sifat mudah menguap yang merupakan syarat utama dalam
kromatografi ini.
D. Propagasi dan Panen Sel Raji
Sel Raji diambil dari tangki nitrogen cair dalam keadaan beku sehingga
tidak merubah kondisi sel dari bentuk aslinya. Sesaat setelah pencairan, ampul
disemprot dengan etanol sehingga kontaminasi dari luar dapat dicegah.
Sel Raji dipanen setelah pertumbuhannya cukup kira-kira setelah
berumur 7 hari. Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan sel antara lain
media pertumbuhan, parameter-parameter fisiologi, bebas dari efek toksik, dan
pemilihan serum.
Media yang digunakan untuk kultur sel harus mengandung ketersediaan
nutrien yang cukup, meliputi raw materials yang dibutuhkan untuk sintesis sel
baru, ketersediaan substrat sebagai energi metabolisme, vitamin dan mineral, serta
ion-ion inorganik yang berperan penting dalam proses katalitik maupun fisiologik.
Kultur sel Raji ditumbuhkan dalam media RPMI 1640, dimana media ini
mengandung FBS (Foetal Bovine Serum) dengan berbagai macam asam amino
assential antara lain arginin, glutamin, histidin, isoleusin, leusin, lysin, metionin,
fenilalanin, treonin, triptopan, tirosin dan valin; asam amino nonessential seperti
asparagin, aspartat, glutamat, glisin, prolin, dan serin serta asam amino derivatif
seperti glutation dan hidroksiprolin. Selain itu, RPMI juga mengandung vitamin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
dan koenzim seperti biotin, asam folat, asam p-amino benzoat, nikotinamid,
piridoksin, riboflavin, tiamin, dan vitamin B12 serta mengandung lemak yaitu
kolin dan inositol, ion-ion inorganik seperti kalsium, magnesium, potasium,
natrium, klorit, nitrat, fosfat dan sulfat, glukosa, buffer bikarbonat dan CO2 5%.
Parameter-parameter fisiologi juga penting diperhatikan dalam media
kultur sel. Parameter-parameter tersebut diantaranya temperatur, pH, tekanan
karbondioksida, buffer, dan kelembaban inkubator (humidification of incubators).
Pada temperatur yang sesuai, sel dapat tumbuh dengan baik. Sel Raji yang
digunakan dalam penelitian ini dapat tumbuh dengan baik pada suhu 37°C, serta
pada kondisi pH antara 7,2-7,4. Selain itu, kultur sel membutuhkan
karbondioksida dan/atau ion bikarbonat sebagai substrat biosintesis. Asam
karbonat maupun asam bikarbonat dapat terbentuk dari air dan karbondioksida,
oleh karena itu tekanan CO2 yang cukup dalam media sangat penting dibutuhkan
oleh sel. Pada kultur sel Raji tekanan CO2 yang dibutuhkan sebesar 5%, dimana
pada konsentrasi tersebut sesuai dengan konsentrasi CO2 pada cairan tubuh.
Kebutuhan akan penggunaan CO2 dalam chamber inkubasi seperti
dijelaskan di atas, dapat menimbulkan masalah terhadap pH. Buffer bikarbonat
dapat berfungsi sebagai kontrol pH selama kultur sel berada dalam inkubator.
Namun, media yang mengandung bikarbonat tersebut akan mengalami perubahan
pH menjadi alkali bila dipindahkan dari inkubator karena kehilangan CO2. Oleh
karena itu, digunakan pula suatu buffer organik yaitu HEPES yang dapat
memperkecil kemungkinan perubahan pH saat kultur dipindahkan dari inkubator.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
E. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah pada Sel Raji
Ekstrak heksan daun sirih merah diujikan efek sitotoksiknya dengan dua
metode yaitu metode MTT dan metode Direct Counting. Parameter uji
sitotoksisitas yang digunakan adalah LC50 (Lethal Concentration 50 %) yang
menunjukkan potensi ketoksikan suatu senyawa, dimana konsentrasi tersebut
dapat membunuh 50% populasi sel Raji.
1. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT
Metode MTT didasarkan pada aktivitas enzim yang dapat diukur secara
kolorimetri, dimana enzim dehidrogenase mitokondria mereduksi substrat MTT
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) yang larut air
(berwarna kuning), menjadi kristal formazan berwarna biru tua. Reaksi reduksi
MTT oleh enzim dehidrogenase mitokondria ditunjukkan dalam gambar di bawah
ini :
NN
NN
S
N
CH3
CH3
NHN
NN
S
N
CH3
CH3
NADH
NAD+
MTT
Br
Formazan
Gambar 1. Reaksi reduksi MTT oleh enzim dehidrogenase mitokondria
Metode ini merupakan uji sitotoksik yang cepat, sensitif, akurat dan
sejumlah besar sampel dapat diukur secara otomatis dengan spektrofotometer.
Jumlah sel yang hidup dapat diketahui dari absorbansi hasil pembacaan ELISA
reader berdasarkan intensitas warna kristal formazan yang terbentuk, dimana
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
korelasi antara absorbansi dan jumlah sel hidup berbanding lurus. Semakin besar
absorbansi maka semakin banyak sel hidup, begitu pula sebaliknya, semakin kecil
absorbansi maka jumlah sel yang hidup semakin sedikit. Hal ini dikarenakan pada
sel yang hidup, berarti enzim dalam sel tersebut masih beraktivitas mereduksi
MTT menjadi kristal formazan berwarna biru tua. Semakin besar aktivitas enzim
tersebut, maka semakin besar kristal formazan yang direduksi dan warna biru tua
yang dihasilkan semakin pekat sehingga absorbansinya pun semakin besar. Hal ini
juga berlaku sebaliknya pada sel yang mati.
Dalam penelitian ini, dilakukan pengukuran absorbansi pada kelompok
perlakuan maupun pada kontrol. Kelompok perlakuan adalah sel Raji dengan
perlakuan ekstrak heksan daun sirih merah sebanyak 10 konsentrasi. Sedangkan
pada kelompok kontrol adalah sel Raji tanpa perlakuan ekstrak heksan daun sirih
merah. Masing-masing kelompok perlakuan dan kontrol dilakukan replikasi
sebanyak tiga kali. Hasil pembacaan absorbansi ELISA reader dapat dilihat dalam
tabel dan gambar di bawah ini :
Tabel II. Tabel nilai absorbansi ekstrak heksan daun sirih merah pada berbagai konsentrasi dengan metode MTT
Replikasi I II III
Konsentrasi (µg/ml)
Absorbansi Absorbansi Absorbansi
Rata-rata absorbansi
% kematian sel Raji
Kontrol 1,563 1,825 1,792 1,727 62,50 1,457 1,462 1,406 1,442 16,50 31,25 1,537 1,569 1,474 1,527 11,58 15,63 1,529 1,477 1,398 1,468 14,99 7,81 1,500 1,547 1,595 1,547 10,42 3,91 1,502 1,555 1,528 1,528 11,52 1,95 1,450 1,476 1,441 1,456 15,69 0,98 1,517 1,542 1,489 1,516 12,22 0,49 1,618 1,596 1,600 1,605 7,06 0,24 1,552 1,549 1,428 1,510 12,57 0,12 1,453 1,556 1,522 1,510 12,57
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
uji MTT ekstrak heksan daun sirih merah pada sel raji
-5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
konsentrasi (ug/ml)
% k
emat
ian
Gambar 2. Kurva konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah terhadap hasil
perhitungan % kematian sel
Berdasarkan pembacaan absorbansi dengan ELISA reader di atas, dapat
dilihat bahwa perbedaan absorbansi pada tingkat konsentrasi ekstrak heksan daun
sirih merah yang berbeda tidak menunjukkan hasil yang benar. Intensitas warna
ungu dari kristal formazan tidak terbaca, dimana seharusnya semakin besar
konsentrasi senyawa uji (ekstrak heksan daun sirih merah) maka absorbansi yang
terbaca semakin kecil karena semakin sedikit sel yang hidup. Namun, absorbansi
yang terbaca justru fluktuatif tidak menentu.
Kesalahan pembacaan absorbansi pada ELISA tersebut mungkin
dikarenakan oleh adanya interferensi terhadap MTT, dimana terjadi interaksi
senyawa alami pada ekstrak heksan daun sirih merah dengan MTT sehingga
mengganggu terbentuknya kristal formazan sehingga membuat intensitas warna
formazan tidak terbaca dengan benar pada ELISA reader. Kemungkinan tersebut
didukung oleh penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya (Regina, B., 2002
dan Ulukaya, E., 2004) yang mengemukakan bahwa pada beberapa senyawa
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
antikanker seperti kaempferol dan resveratrol dapat berinteraksi dengan MTT
sehingga menyebabkan pembacaan absorbansi kristal formazan menjadi tidak
benar. Berdasarkan hasil tersebut, maka sebelum metode MTT digunakan untuk
uji sitotoksisitas selanjutnya maka perlu dilakukan cek terlebih dahulu untuk
mengetahui adanya kemungkinan senyawa dalam ekstrak uji yang berinteraksi
dengan MTT.
Kesalahan pembacaan absorbansi pada metode MTT juga dapat
dikarenakan oleh media sel yang digunakan. Kontaminasi mikroba dalam media
dapat mengganggu terbentuknya formazan dan kandungan protein yang tinggi
dalam media dapat mengendap bila reagen MTT ditambahkan, sehingga hal
tersebut dapat mengganggu pembacaan absorbansi. Selain itu, penyimpanan
reagen MTT yang tidak benar dapat menyebabkan terjadinya dekomposisi reagen
MTT sehingga menghasilkan pembacaan absorbansi yang salah (Anonim, 2009d).
Namun cukup kecil kemungkinan bahwa kesalahan pembacaan absorbansi pada
metode MTT di penelitian ini dikarenakan oleh kandungan protein yang terlalu
tinggi ataupun kesalahan penyimpanan. Dalam penelitian ini, protein yang
terkandung dalam media sudah disesuaikan kebutuhannya. Protein ini terdapat
dalam FBS (Fetal Bovine Serum) dimana jumlah optimum yang diberikan ke
dalam media adalah 10%. Sedangkan penyimpanan reagen MTT ini sudah
dilakukan sesuai prosedur yaitu pada suhu 4°C.
2. Uji sitotoksisitas dengan metode direct counting
Metode yang selanjutnya dipakai untuk uji sitotoksisitas adalah metode
direct counting. Perhitungan sel dilakukan dengan haemocytometer yaitu suatu
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
chamber dengan kedalaman 0,1 mm, dan terbagi dalam persegi-persegi untuk
mempermudah pengamatan dan perhitungan di bawah mikroskop. Pada metode
ini, sel diperlakukan dengan penambahan Trypan blue untuk dapat menghitung sel
baik sel yang hidup maupun sel yang mati. Trypan blue ini hanya bisa menembus
membran pada sel yang mati. Ketika suspensi sel dilemahkan dengan Trypan
blue, sel yang hidup akan tetap kecil dan bergerak, sedangkan sel yang rusak atau
mati akan membengkak, lebih luas dan berwarna biru tua. Metode perhitungan sel
secara direct counting cukup menguntungkan karena metode ini cukup murah dan
dapat dilakukan pengamatan dan perhitungan langsung terhadap sel yang diamati.
(i)
(ii)
Gambar 3. Sel yang hidup (i) dan sel yang mati (ii) setelah pemberian trypan blue pada haemocytomoter di bawah pengamatan mikroskop dengan perbesaran 100x
Uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah selain dilakukan pada
sel Raji, juga dilakukan pada sel Vero. Sel Raji adalah sel kanker yang diturunkan
dari penyakit limfoma Burkitt. Sedangkan sel Vero merupakan sel normal yang
diambil dari sel ginjal kera. Perbedaan perlakuan pada kedua sel ini adalah adanya
penambahan tripsin yang dilakukan pada sel Vero. Fungsi tripsin ini adalah untuk
melepaskan sel yang melekat di dinding well. Sel Raji tidak diberi penambahan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
tripsin karena sel ini tidak melekat pada dinding well, namun mengambang dalam
medium.
Pada uji sitotoksisitas ini, diperlukan kontrol baik pada sel Raji maupun
pada sel Vero. Kontrol berisi medium dan sel yang sama dengan sampel namun
tanpa diberi perlakuan ekstrak heksan daun sirih merah. Kontrol ini berfungsi
untuk membandingkan kondisi sel yang diberi perlakuan dengan sel tanpa
perlakuan. Setelah inkubasi, tidak terjadi kematian baik pada kontrol sel Raji
maupun pada kontrol sel Vero.
(i) (ii)
Gambar 4. Kontrol sel Raji (i) dan kontrol sel Vero (ii) di bawah pengamatan mikroskop dengan perbesaran 100x
Pada uji sitotoksisitas ekstrak heksan terhadap sel Raji, digunakan
delapan konsentrasi ekstrak heksan sebesar 300, 275, 250, 225, 200, 175, 150, dan
125 µg/ml. Sedangkan pada sel Vero, uji sitotoksisitas juga dilakukan dengan
delapan konsentrasi ekstrak heksan yaitu 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, dan
100 µg/ml. Pada perlakuan masing-masing konsentrasi ekstrak heksan tersebut,
dilakukan perhitungan jumlah sel mati dan jumlah sel hidup dengan perhitungan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
langsung (direct counting). Metode ini subyektivitasnya cukup tinggi, sehingga
perhitungan dilakukan sebanyak tiga kali.
Tabel III. Hasil perhitungan sel Raji pada masing-masing konsentrasi ekstrak
heksan daun sirih merah dengan metode Direct Counting Replikasi
I II III Konsentrasi
ekstrak heksan daun sirih merah
(µg/ml) Sel
Hidup Sel Mati Sel
Hidup Sel Mati Sel
Hidup Sel
Mati 300 0 41 0 41 0 41 275 0 41 0 42 0 41 250 5 38 5 39 5 38 225 10 34 10 35 10 35 200 17 30 16 31 16 32 175 18 28 20 28 19 29 150 25 25 25 25 25 25 125 31 21 32 20 32 20
kontrol 76 0 75 0 76 0
Tabel IV. Hasil perhitungan sel Vero pada masing-masing konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah dengan metode Direct Counting
Replikasi I II III
Konsentrasi ekstrak heksan
daun sirih merah (µg/ml)
Sel Hidup
Sel Mati Sel Hidup
Sel Mati Sel Hidup
Sel Mati
800 0 42 0 42 0 43 700 5 37 6 37 6 37 600 13 34 13 33 13 33 500 19 30 18 30 18 30 400 26 26 26 26 26 26 300 31 23 32 23 33 23 200 37 20 38 20 38 20 100 44 18 45 18 46 17
kontrol 75 0 75 0 75 0 Data hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa semakin besar
konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah maka jumlah sel mati semakin
meningkat, dimana pada konsentrasi tertinggi ekstrak heksan mampu membunuh
seluruh polulasi sel. Pada kedua kontrol baik pada kontrol sel Raji maupun
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
kontrol sel Vero yang tidak diberi perlakuan dengan ekstrak heksan daun sirih
merah, tidak terjadi kematian pada populasi sel. Hal ini menunjukkan bahwa
kematian sel pada kelompok perlakuan memang disebabkan oleh ekstrak heksan
daun sirih merah. Dari data jumlah sel yang hidup dan mati tersebut, dapat
diketahui % kematian sel yang disebabkan ekstrak heksan daun sirih merah.
0
20
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah (mikrogram/ml)
Rat
a-ra
ta %
kem
atia
n
sel Raji sel Vero
Gambar 5. Kurva Konsentrasi Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah terhadap %
Kematian Sel Raji dan Sel Vero
Persen kematian sel yang disebabkan oleh masing-masing konsentrasi
ekstrak heksan daun sirih merah dapat digunakan untuk mencari harga probit
masing-masing konsentrasi sehingga nantinya dapat diperoleh LC50 ekstrak
heksan daun sirih merah baik terhadap sel Raji maupun sel Vero.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
Tabel V. Data % kematian sel Raji dan harga probitnya setelah inkubasi 24 jam dengan perlakuan ekstrak heksan daun sirih merah
% kematian Konsentrasi ekstrak heksan
daun sirih merah (µg/ml)
Rep I Rep II Rep III Rata-rata Probit
300 100 100 100 100 - 275 100 100 100 100 - 250 88,37 88,64 88,37 88,46 6.18 225 77,27 77,78 77,78 77,61 5.77 200 63,83 65,96 66,67 65,48 5.39 175 60,87 58,33 60,42 59,87 5.25 150 50 50 50 50 5 125 40,38 38,46 38,46 39,10 4.72
Tabel VI. Data % kematian sel Vero dan harga probitnya setelah inkubasi 24 jam
dengan perlakuan ekstrak heksan daun sirih merah % kematian Konsentrasi
ekstrak heksan daun sirih
merah (µg/ml)
Rep I Rep II Rep III Rata-rata Probit
800 100 100 100 100 - 700 88,10 86,05 86,05 86,73 6,13 600 72,34 71,74 71,74 71,94 5,58 500 61,22 62,5 62,5 62,07 5,31 400 50 50 50 50 5 300 42,59 41,82 41,07 41,83 4,80 200 35,09 34,48 34,48 34,68 4,61 100 29,03 28,57 26,98 28,19 4,42
y = 4,5687x - 4,9458
0
1
2
3
4
5
6
7
1,5 2 2,5 3log konsentrasi
harg
a pr
obit
Gambar 6. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah terhadap harga
probit pada sel Raji
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
y = 1,8099x + 0,5443
0
1
2
3
4
5
6
7
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
log konsentrasi
harg
a pr
obit
Gambar 7. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah terhadap harga
probit pada sel Vero
Berdasarkan data nilai probit yang diperoleh dari persen kematian pada
tiap-tiap konsentrasi ketiga replikasi, diperoleh persamaan regresi linier antara log
konsentrasi terhadap nilai probit. Dari persamaan ini dapat dihitung nilai LC50
ekstrak heksan daun sirih merah terhadap sel Raji dan sel Vero. Hasil perhitungan
didapatkan nilai LC50 ekstrak heksan daun sirih merah terhadap sel Raji sebesar
150,583 µg/ml sedangkan nilai LC50 terhadap sel Vero adalah sebesar 289,514
µg/ml. Menurut NIH (National Institute of Health) suatu bahan dapat dikatakan
berpotensi sitotoksik kuat apabila memiliki nilai LC50 = 0,19-0,528 mg/ml
(Mazzio,2009), dengan demikian dapat dikatakan bahwa ekstrak heksan daun sirih
merah bersifat sitotoksik kuat terhadap sel Raji.
Untuk memastikan efek sitotoksisitas dari ekstrak heksan daun sirih
merah, maka dilakukan analisis statistik Z-test. Analisis ini bertujuan untuk
mengetahui apakah pemberian ekstrak heksan daun sirih merah dalam berbagai
konsentrasi pada sel raji, memiliki perbedaan bermakna terhadap kontrol.
Berdasarkan hasil perhitungan statistik tersebut diketahui bahwa Z hitung pada
semua konsentrasi ekstrak heksan lebih besar daripada Z tabel dengan taraf
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
kepercayaan 95%. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak heksan daun
sirih merah dalam berbagai konsentrasi pada sel raji memiliki perbedaan
bermakna terhadap kontrol.
Pada konsentrasi 150,583 µg/ml ekstrak heksan daun sirih merah
dimungkinkan masih cukup aman terhadap sel normal. Keamanan terhadap sel
normal ini belum bisa dipastikan walaupun berdasarkan hasil penelitian diketahui
bahwa nilai LC50 ekstrak heksan daun sirih merah terhadap sel normal (sel Vero)
hampir dua kali lipat dibandingkan LC50 terhadap sel kanker (sel Raji) yang
berarti bahwa sifat sitotoksik terhadap sel normal hampir setengah kali lipat lebih
kecil daripada sel kanker. Hal ini disebabkan karena sel Raji dan sel Vero tidak
diambil dari organ yang sama. Sel Raji merupakan sel kanker yang diambil dari
kanker limfoma yang sering terdapat di tulang, perut atau hati, sedangkan sel Vero
merupakan sel normal yang diambil dari organ ginjal. Tiap-tiap sel dalam tubuh
mempunyai karakteristik yang berbeda. Sel Raji maupun sel Vero terletak di
lokasi yang berbeda, maka karakteristiknya pun akan berbeda. Perbedaan
karakteristik sel mempengaruhi aktivitas ekstrak heksan daun sirih merah sebagai
agen sitotoksik, sehingga interaksi antara sel dengan ekstrak uji pun berbeda.
Untuk perkembangan penelitian selanjutnya, maka disarankan untuk
menggunakan sel Raji dan sel limfosit normal.
Keterbatasan lain dari penelitian ini adalah tidak dilakukannya uji
sitotoksisitas dengan kontrol pelarut. Pelarut heksan diketahui bersifat toksik,
sehingga dikhawatirkan bahwa efek sitotoksik ekstrak heksan ini dipengaruhi oleh
pelarut heksan. Pada penelitian selanjutnya disarankan agar menggunakan kontrol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
pelarut agar efek toksik daun sirih merah yang diteliti dalam uji sitotoksisitas
menjadi lebih akurat.
Pada penelitian sebelumnya, diketahui bahwa ekstrak etanolik daun sirih
merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) mempunyai nilai LC50 sebesar 395,5 µg/ml.
Hal ini membuktikan bahwa daun sirih merah dalam bentuk ekstrak heksan
mempunyai efek sitotoksik yang lebih besar daripada dalam bentuk ekstrak
etanolik. Efek sitotoksik yang lebih besar ini dapat dipengaruhi oleh metode
penyarian yang dilakukan maupun besarnya kandungan senyawa sitotoksik dalam
daun sirih merah yang dapat tersari. Metode penyarian yang dilakukan
sebelumnya dilakukan secara maserasi, sedangkan pada penelitian ini dilakukan
secara perkolasi. Cara perkolasi lebih baik dibandingkan dengan cara maserasi
karena aliran cairan penyari menyebabkan adanya pergantian larutan yang selalu
baru, sehingga meningkatkan derajat perbedaan konsentrasi. Dengan demikian,
dapat dipastikan bahwa senyawa sitotoksik yang tersari akan lebih optimal dengan
perkolasi.
Selain metode penyarian, besarnya kandungan senyawa sitotoksik juga
berpengaruh. Pelarut etanol yang digunakan pada ekstrak etanolik daun sirih
merah mempunyai range kepolaran yang jauh, sehingga banyak senyawa-senyawa
yang akan tersari dalam pelarut tersebut, seperti alkaloid, flavonoid, maupun
minyak atsiri. Sedangkan pada pelarut heksan yang mempunyai kepolaran rendah
(non polar) hanya dapat menyari senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah
pula yakni minyak atsiri, sehingga konsentrasi senyawa tersebut akan lebih besar
bila dibandingkan dengan konsentrasi senyawa tersebut dalam ekstrak etanol yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
mengandung bermacam-macam senyawa. Semakin besar konsentrasi senyawa
sitotoksik yang tersari maka sifat sitotoksik yang dihasilkanpun akan lebih besar.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Ekstrak heksan daun sirih merah memiliki efek sitotoksik dengan harga LC50
sebesar 150,583 µg/ml.
B. Saran
1. Identifikasi kandungan senyawa atsiri dalam ekstrak heksan daun sirih merah
penting dilakukan untuk mengetahui senyawa apa yang beraktivitas sitotoksik
terhadap sel kanker. Disarankan pada penelitian selanjutnya untuk melakukan
identifikasi kandungan senyawa menggunakan kromatografi gas yang
sensitivitasnya lebih tinggi.
2. Penelitian sitotoksisitas pada sel Raji dilanjutkan dengan menggunakan metode
selain MTT dan direct counting, seperti neutral red, methylene blue, XTT, Acid
Phosphatase, Lactate dehydrogenase (LDH) atau Resazurin.
3. Dilakukan optimasi jumlah sel dalam 96-well plate pada metode MTT, sehingga
intensitas warna Kristal formazan dapat terbaca dengan baik oleh ELISA reader.
4. Uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah perlu dilakukan dengan
menggunakan kontrol pelarut heksan.
5. Untuk pengembangan uji sitotoksisitas, disarankan untuk meneliti efek
sitotoksisitas dari isolat daun sirih merah baik terhadap kultur sel Raji maupun sel
limfosit normal.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 2009a, Limfoma, Lembaran Informasi 509 Yayasan Spirita, http://www.i-
base.info/itpc/Indonesian/spirita/docs/Lembaran-Informasi/LI509.pdf, diakses pada tanggal 12 Maret 2009
Anonim, 2009b, Raji Cell, http://www.mondofacto.com/facts/dictionary?Raji+cell,
diakses pada tanggal 8 Maret 2009 Anonim, 2009c, MTT Cell Proliferation Assay,
http://www.atcc.org/common/products/MttCell.cfm, diakses pada tanggal 12 Maret 2009
Anonim, 2009d, In Vitro Toxicology Assay Kit MTT Based, Product Information,
Sigma-Aldrich, Inc. Anita, 2008, Kanker, http://bima.ipb.ac.id/anitakanker.htm, diakses pada tanggal 4
Oktober 2008
Anonim, 2007, Piper crocatum taxonomy, http://zipcodezoo.com/plants/p/piper_crocatum.asp, diakses pada tanggal 31 Agustus 2008
Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, cetakan pertama,
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, 7, Departemen Kesehatan Republik
Indonesia, Jakarta Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 1-2, 10, Departemen Republik Indonesia, Jakarta Backer, C. A., dan Backuizen van den Brink, R. C.,1965, Flora of Java, Volume I
dan II, N. V. Noordhoff, Graningen. Doyle, A., and Griffiths, J.B., 2000, Cell and Tissue Culture for Medical Research,
John Willey and Sons Ltd, New York Elfrod, S. and William, S., 2007, Genetika, edisi keempat, 261-263, Penerbit
Erlangga. Freshney, R.I., 1986, Animal Cell Culture A Practical Approach, 1st Edition, 71-73,
IRL Press, Washington DC. Houghton & Raman, 1998, Laboratory Handbook for The Fractionatio of Natural
Extracts, Coldspring Harbor Laboratory Press. Jacoby, W.B., and Pastan, I.H., 1979, Methods in Enzymology Cell Culture, Volume
VIII, Academia Press Inc, New York.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
Kusumaningtyas, 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi,Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
Mazzio, E. A., 2009, In Vitro Screening for The Tumoridical Properties of
International Medicinal Herbs, Phytother Res. , NIH Public Access. Mursyidi, A., 1985, Statistika Farmasi Dan Biologi, 157, Ghalia Indonesia, Jakarta Regina, B., Katrin, V. D., Gernot, J., Willi, S., Tullberg-Reinert, 2002, Interference
Of Plant Extracts, Phytoestrogens And Antioxidants With The MTT Tetrazolium Assay, Planta Medica Journal, University Clinics, Bassel.
Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, terjemahan oleh Kosasih
Padmawinata, edisi keenam, 132-134, Penerbit ITB, Bandung. Sambrook, Fritsch, E.F., Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, 2nd Edition, Coldspring Harbor Laboratory Press. Sudewo, B., 2005, Basmi Penyakit dengan Sirih Merah, Agromedia Pustaka, Jakarta Tjindarbumi, D., 2005, Deteksi Dini Kanker, Fakultas Kedokteran Universitas
Indonesia Ulakaya, E., 2004, Interference by Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents in the
MTT-Tumor Chemosensitivity Assay, Experimental Chemotherapy Journal,
Uludag University, Turki.
Wijeksera, 1991, The Medicinal Plant Industry, 101, CRC Press, New York. Wolfe S.L.,1993, Molecular and Cellular Biology, 939, A division of Wadsworth,
Inc., California.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
Lampiran 1. Bahan dan Peralatan yang Digunakan dalam Penelitian
Gambar 8. Tanaman Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)
Gambar 9. Laminar Air Flow
Gambar 10. Inverted Microscope
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
Gambar 11. 96well plate, tabung conical steril dan flask
Gambar 12. Cell counter dan haemocytometer
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
Lampiran 2. Hasil Pengamatan Sel Raji dan Sel Vero dengan Mikroskop dengan Perbesaran 100x Setelah Pemberian Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah pada Inkubasi 24 jam
Pengamatan Sel Raji
Gambar 13. Perlakuan ekstrak uji 300µg/ml Gambar 14. Perlakuan ekstrak uji275µg/ml
Gambar 15. Perlakuan ekstrak uji 250µg/ml Gambar 16. Perlakuan ekstrak uji225µg/ml
Gambar 17. Perlakuan ekstrak uji 200µg/ml Gambar 18. Perlakuan ekstrak uji175µg/ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
Gambar 19. Perlakuan ekstrak uji 150µg/ml Gambar 20. Perlakuan ekstrak uji125µg/ml
Pengamatan Sel Vero
Gambar 21. Perlakuan ekstrak uji 800µg/ml Gambar 22. Perlakuan ekstrak uji700µg/ml
Gambar 23. Perlakuan ekstrak uji 600µg/ml Gambar 24. Perlakuan ekstrak uji500µg/ml
Gambar 25. Perlakuan ekstrak uji 400µg/ml Gambar 26. Perlakuan ekstrak uji300µg/ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
Gambar 27. Perlakuan ekstrak uji 200µg/ml Gambar 28. Perlakuan ekstrak uji100µg/ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
Lampiran 3. Tabel Probit
Probit Persen
tase 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 - 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66
10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12
20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45
30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72
40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97
50 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23
60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50
70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81
80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23
90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 99
7,33 7,37 7,41 7,46 7,51 7,58 7,65 7,75 7,88 8,09
(Mursyidi, 1985)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
Lampiran 4. Perhitungan LC50 Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah terhadap Sel Raji Dan Sel Vero
SEL RAJI • Data jumlah sel dari perhitungan di haemocytometer
Replikasi I II III
Konsentrasi ekstrak heksan
daun sirih merah (µg/ml)
Sel Hidup
Sel Mati
Sel Hidup
Sel Mati
Sel Hidup
Sel Mati
300 0 41 0 41 0 41 275 0 41 0 42 0 41 250 5 38 5 39 5 38 225 10 34 10 35 10 35 200 17 30 16 31 16 32 175 18 28 20 28 19 29 150 25 25 25 25 25 25 125 31 21 32 20 32 20
kontrol 76 0 75 0 76 0 • Data jumlah sel mati dan hidup sebenarnya
Jumlah sel sebenarnya = 200104
××x
x = jumlah sel dari perhitungan sel di haemocytometer 4 = jumlah bilik pada haemocytometer 10 = volume yang diambil untuk pengamatan di haemocytometer 200 = volume total dari well
Replikasi I II III
Konsentrasi ekstrak
heksan daun sirih merah
(µg/ml)
Sel Hidup
Sel Mati Sel Hidup
Sel Mati Sel Hidup
Sel Mati
300 0 20500 0 20500 0 20500 275 0 20500 0 21000 0 20500 250 2500 19000 2500 19500 2500 19000 225 5000 17000 5000 17500 5000 17500 200 8500 15000 8000 15500 8000 16000 175 9000 14000 10000 14000 9500 14500 150 12500 12500 12500 12500 12500 12500 125 15500 10500 16000 10000 16000 10000
kontrol 38000 0 37500 0 38000 0
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
• Perhitungan % kematian
% kematian = ( ) %100×⊕∑
∑−⊕∑selhidupselmati
selhidupselhidupselmati
% kematian Rep I Rep II Rep III Rata-rata
kontrol 0 0 0 0
% kematian Konsentrasi ekstrak heksan
daun sirih merah (µg/ml)
Rep I Rep II Rep III Rata-rata Probit
300 100 100 100 100 - 275 100 100 100 100 - 250 88,37 88,64 88,37 88,46 6.18 225 77,27 77,78 77,78 77,61 5.77 200 63,83 65,96 66,67 65,48 5.39 175 60,87 58,33 60,42 59,87 5.25 150 50 50 50 50 5 125 40,38 38,46 38,46 39,10 4.72
Persamaan regresi linier log konsentrasi vs probit
A = - 4,9458
B = 4,5687
r = 0,9740
Y = Bx + A
Y = 4,5687 x – 4,9458
Y = LC50 , LC50 = 50% mempunyai harga probit 5, maka
Y = 4,5687 x – 4,9458
5 = 4,5687 x – 4,9458
X = 2,1769
LC50 = antilog 2,1769
= 150,2796
LC50 terhadap sel Raji = 150,2796 µg/ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
SEL VERO
• Data jumlah sel dari perhitungan di haemocytometer
Replikasi I II III
Konsentrasi ekstrak heksan
daun sirih merah (µg/ml)
Sel Hidup
Sel Mati
Sel Hidup
Sel Mati
Sel Hidup
Sel Mati
800 0 42 0 42 0 43 700 5 37 6 37 6 37 600 13 34 13 33 13 33 500 19 30 18 30 18 30 400 26 26 26 26 26 26 300 31 23 32 23 33 23 200 37 20 38 20 38 20 100 44 18 45 18 46 17
kontrol 75 0 75 0 75 0 • Data jumlah sel mati dan hidup sebenarnya
Jumlah sel sebenarnya = 200104
××x
x = jumlah sel dari perhitungan sel di haemocytometer 4 = jumlah bilik pada haemocytometer 10 = volume yang diambil untuk pengamatan di haemocytometer 200 = volume total dari well
Replikasi I II III
Konsentrasi ekstrak
heksan daun sirih merah
(µg/ml)
Sel Hidup
Sel Mati
Sel Hidup
Sel Mati
Sel Hidup
Sel Mati
800 0 21000 0 21000 0 21500 700 2500 18500 300 18500 3000 18500 600 6500 17000 6500 16500 6500 16500 500 9500 15000 9000 15000 9000 15000 400 13000 13000 13000 13000 13000 13000 300 15500 11500 16000 11500 16500 11500 200 1850 10000 19000 10000 19000 10000 100 22000 9000 22500 9000 23000 8500
kontrol 37500 0 37500 0 37500 0
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
• Perhitungan % kematian
% kematian = ( ) %100×⊕∑
∑−⊕∑selhidupselmati
selhidupselhidupselmati
% kematian Rep I Rep II Rep III Rata-rata
kontrol 0 0 0 0
% kematian Konsentrasi
ekstrak heksan daun sirih
merah (µg/ml)
Rep I Rep II Rep III Rata-rata Probit
800 100 100 100 100 - 700 88,10 86,05 86,05 86,73 6,13 600 72,34 71,74 71,74 71,94 5,58 500 61,22 62,5 62,5 62,07 5,31 400 50 50 50 50 5 300 42,59 41,82 41,07 41,83 4,80 200 35,09 34,48 34,48 34,68 4,61 100 29,03 28,57 26,98 28,19 4,42
Persamaan regresi linier log konsentrasi vs probit
A = 0,5443
B = 1,8099
r = 0,9025
Y = Bx + A
Y = 1,8099x +0,5443
Y = LC50 , LC50 = 50% mempunyai harga probit 5, maka
Y = 1,8099x +0,5443
5 = 1,8099x +0,5443
X = 2,4618
LC50 = antilog 2,4618
= 289,6010
LC50 terhadap sel Vero = 289, 6010 µg/ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
Lampiran 5. Uji Signifikansi Antara Perlakuan dan Kontrol dengan analisis Z-Test
Po = 21
2211nn
pnpn++
Z =
2)1(
1)1(
21
nPoPo
nPoPo
PP−
+−
−
Hi = perlakuan dan kontrol berbeda secara signifikan Ho = perlakuan dan kontrol tidak berbeda secara signifikan Ho diterima jika Z Hitung < Z tabel (1,96) SEL RAJI
Replikasi I II III
Konsentrasi ekstrak heksan
daun sirih merah (µg/ml)
Sel Hidup
Sel Mati
Sel Hidup
Sel Mati
Sel Hidup
Sel Mati
300 0 41 0 41 0 41 275 0 41 0 42 0 41 250 5 38 5 39 5 38 225 10 34 10 35 10 35 200 17 30 16 31 16 32 175 18 28 20 28 19 29 150 25 25 25 25 25 25 125 31 21 32 20 32 20
kontrol 76 0 75 0 76 0
Rata-rata Konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah (µg/ml)
Sel Hidup
Sel Mati
Proporsi (P)
Po
Z
Keterangan
300 0 41 1 0,35 10,847 Berbeda signifikan 275 0 41 1 0,35 10,847 Berbeda signifikan 250 5 38 0,884 0,32 9,945 Berbeda signifikan 225 10 35 0,778 0,29 9,106 Berbeda signifikan 200 16 31 0,660 0,25 8,186 Berbeda signifikan 175 19 28 0,596 0,23 7,631 Berbeda signifikan 150 25 25 0,5 0,20 6,868 Berbeda signifikan 125 32 20 0,385 0,16 5,804 Berbeda signifikan
kontrol 76 0 0
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
53
SEL VERO
Replikasi I II III
Konsentrasi ekstrak heksan
daun sirih merah (µg/ml)
Sel Hidup
Sel Mati
Sel Hidup
Sel Mati
Sel Hidup
Sel Mati
800 0 42 0 42 0 43 700 5 37 6 37 6 37 600 13 34 13 33 13 33 500 19 30 18 30 18 30 400 26 26 26 26 26 26 300 31 23 32 23 33 23 200 37 20 38 20 38 20 100 44 18 45 18 46 17
kontrol 75 0 75 0 75 0
Rata-rata Konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah (µg/ml)
Sel Hidup
Sel Mati
Proporsi (P)
Po
Z
Keterangan
800 0 42 1 0,36 10,783 Berbeda signifikan 700 6 37 0,860 0,31 9,676 Berbeda signifikan 600 13 33 0,717 0,27 8,632 Berbeda signifikan 500 18 30 0,625 0,24 8,207 Berbeda signifikan 400 26 26 0,5 0,20 6,934 Berbeda signifikan 300 32 23 0,418 0,18 6,097 Berbeda signifikan 200 38 20 0,345 0,15 5,524 Berbeda signifikan 100 45 18 0,286 0,13 4,979 Berbeda signifikan
kontrol 75 0 0
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
54
Lampiran 6. Hasil Uji KLT Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah
Keterangan gambar : Cp = standar aryophyllen Ca = standar cavicol H = ekstrak heksan daun sirih merah Fase diam = silika GF 254 Fase gerak = toluen:etil asetat (93:7) Deteksi = semprot vanilin
Keterangan gambar : Cr = standar carvacrol H = ekstrak heksan daun sirih merah Fase diam = silika GF 254 Fase gerak = toluen:etil asetat (93:7) Deteksi = semprot vanilin
Cp Ca H Cr H
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
55
Keterangan gambar : Ci = standar cineol H = ekstrak heksan daun sirih merah Fase diam = silika GF 254 Fase gerak = toluen:etil asetat (93:7) Deteksi = semprot vanilin
Keterangan gambar : T = standar tanin H = ekstrak heksan daun sirih merah Fase diam = silika GF 254 Fase gerak = BAW (4:1:5)
Ci H T H
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
56
Keterangan gambar : R = standar rutin H = ekstrak heksan daun sirih merah Fase diam = selulosa Fase gerak = etil asetat:asan asetat: asam formiat:air (100:11:11:27) Deteksi = uap amonia
Keterangan gambar : K = standar kinin H = ekstrak heksan daun sirih merah Fase diam = silika GF 254 Fase gerak = metanol:amonia (100:1,5) Deteksi = semprot vanilin
H R HK
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
56
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK
HEKSAN DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum
Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL RAJI,
dengan nama lengkap Clara Sinta, dilahirkan di
Gunungkidul pada tanggal 11 Desember 1987. Penulis
merupakan anak kedua dari pasangan Bapak Heronimus
Yuana Sutanta, S.Pd., dan Ibu Yulia Titik Dwi Suatmini.
Penulis menyelesaikan pendidikan di Taman Kanak-
Kanak Pertiwi IV Karangmojo pada tahun 1993, kemudian pendidikan di Sekolah
Dasar Candibaru I Karangmojo pada tahun 1993-1999. Penulis melanjutkan
pendidikan di SMP Kanisius Wonosari pada tahun 1999-2002 dan di SMA Negeri
6 Yogyakarta pada tahun 2002-2005, dilanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2005-2009. Semasa kuliah,
penulis pernah menjadi pengurus Badan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi
periode 2005-2006 dan 2006-2007, UKF Basket, serta menjadi panitia pada
beberapa kepanitiaan lepas di Fakultas. Penulis juga pernah menjadi asisten dosen
Praktikum Biofarmasetika dan Praktikum Formulasi dan Teknologi Sediaan Steril
pada tahun 2009.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI