Download - Plūsmas citometrija
![Page 1: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/1.jpg)
Arnis Strods
01.11.2013.
![Page 2: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/2.jpg)
Plūsmas citometrija (Flow cytometry)Cytos=šūna; metria=mērījums (no latīņu val.)
Asins šūnas Hromosomas
Aļģes Protozoji
Tehnika mikroskopisku daļiņu saskaitīšanai un analizēšanai, suspendējot tās šķidruma plūsmā un analizējot šādu plūsmu ar dažādiem detektoriem.
![Page 3: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/3.jpg)
Nedaudz vēstures
• 1934 - pirmais mēģinājums šūnu skaitīšanai plūsmā - Andrew Moldavan
• 1963 - pirmais analītiskais instruments
• Komerciāli pieejami plūsmas citometri kopš 1970tajiem gadiem
![Page 4: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/4.jpg)
Mūsdienu plūsmas citometri spēj analizēt vairākus simtus tūkstošušūnu dažu sekunžu laikā
Phywe AG of Gottingen – 1969Pirmais komerciālais plūsmas citometrs, kas uzbūvēts ap Zeiss fluorescento mikroskopu
Priekšrocība salīdzinājumā ar tradicionālajām mikroskopijas
metodēm
![Page 5: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/5.jpg)
Šūnu virsmas raksturošana Šūnu ploīdijas noteikšana Šūnas cikla pētījumi Intracelulārā Ca++ līmeņa noteikšana Membrānas potenciāla mērījumi pH mērījumi Mitohondriju funkcionalitātes novērtēšana u.c.
![Page 6: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/6.jpg)
![Page 7: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/7.jpg)
PlūsmaOptikaElektronika
Sistēmas pamatdaļas:
BD FACSAria II
![Page 8: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/8.jpg)
Nesējšķīduma trauks zem spiediena
filtrs
parauga iešprices kamera
mēģene ar paraugu
Flow Cell
Nesējšķīduma plūsma Parauga plūsma
mijiedarbības punkts
atsevišķi pilieni
atkritumu trauks mēģenes vai plate savākšanai
(Suspensija – monodispersa sistēma)
![Page 9: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/9.jpg)
parauga plūsmaSheath plūsma
lāzeru stari
Sheath plūsmaparauga plūsma
Sheath plūsma
lāzeru stari
Sheath plūsma
zems parauga spiediens augsts parauga spiediens
Hidrodinamiskā fokusēšana – process, kas fokusē parauga plūsmu nesējšķīdumā (sheath)
![Page 10: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/10.jpg)
sheath fluid pievadi
parauga pievads
![Page 11: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/11.jpg)
Violet Laser (405 nm)
Blue Laser (488 nm)
Red Laser (635 nm)
Optical fibers Prisms Focuslenses
Flow Cell
564–606 nm
750–810 nm
> 670 nm
SSC
515–545 nm
1 optical fiberper laser
![Page 12: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/12.jpg)
Eritrocīti
T šūna
Monocīts
Neitrofilaisgranulocīts
Bazofilais granulocīts
Eozinofilais granulocīts
7 – 10 m10 – 15 m
10 – 20 m
![Page 13: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/13.jpg)
Koherents gaismas avots (488 nm)
Izkliede uz priekšuForward scatter (FSC)Šūnu izmērs (488 nm)
Forward scatter (FSC)
mēra pa ienākošās gaismas asi
proporcionāls šūnu izmēram / šūnu virsmai (tikai ideāli apaļām šūnām)
Sānu izkliedeSide scatter
(SSC)Granularitāte (488 nm)
Side scatter (SSC)
mēra 90O leņķī no ienākošās gaismas
proporcionāla šūnu «kompleksumam» (granularitātei)
![Page 14: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/14.jpg)
![Page 15: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/15.jpg)
Fluorescence - process, kurā ķīmisks savienojums emitē gaismu pēc gaismas vai cita elektromagnētiskā starojuma absorbcijas.
= 488 nm
Emitētā fluorescences gaisma
Antiviela
Ierosinošā gaisma
Fluorohroma molekula
520 nmHO
CO2H
O
C
Fluorohroms – absorbē ienākošās gaismas enerģiju.Atbrīvo absorbēto enerģiju:- ar vibrāciju un izkliedē siltumu- emitē fotonu ar lielāku viļņa garumu (mazāku enerģiju)
![Page 16: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/16.jpg)
Ethidium
PE
cis-Parinaric acid
Texas Red
PE-TR Conj.
PI
FITC
600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm457350 514 610 632488 Ierosinošie lāzeri
Fluorohromi, spektri
![Page 17: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/17.jpg)
Zilais (488nm) Sarkanais (633nm) Violetais (408nm)/nearUV (375nm)
Katram fluorohromam raksturīgs konkrēts optimālais ierosināšanās gaismas diapazons.
Svarīgi iepazīties ar pieejamā instrumenta iespējām...
495 nm 520 nm
Stokes Shift is 25 nmFluoresceinmolecule
Flu
ores
cnec
e In
tens
ity
Wavelength
![Page 18: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/18.jpg)
Iespēja paraugā izšķirt specifiskas šūnu populācijas, kas ekspresē interesējošos marķierus
Liu et al., 2005. Mining the complement system for lupus biomarkers. Clinical and Applied Immunology Reviews
![Page 19: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/19.jpg)
FITC
FIT
C
101 104103 102
Relatīvā fluorescences intensitāte
Not
iku
mu
sk
aits
FITC
FITCFIT
C
FITC
FITC
FITCFIT C
FITC
Fluorescences intensitāte ir proporcionāla pie šūnām saistīto antivielu skaitam:
Negatīvā populācija
Pozitīvā populācija
![Page 20: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/20.jpg)
Savāktā fluorescences gaisma
Filtru veidi:
![Page 21: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/21.jpg)
![Page 22: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/22.jpg)
Time ~ 3.2 s
Time ~ 3.2 s Time ~ 3.2 s
V
1
2
3
Pulse
e-
e-
12
3 12
3
Gaismas signāli tiek pārvērsti elektroniskā signālā ar fotodetektoru palīdzību:1)Fotodiode – spēcīgāka signāla uztveršanai (FSC fotodiode)2)Fotopavairotājs (PMT - PhotoMultiplier Tube) – vājāku signālu detekcijai
(SSC un fluorescences signāli)
![Page 23: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/23.jpg)
PMT tuvākā skatā:
![Page 24: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/24.jpg)
Impulsa veidošanās
![Page 25: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/25.jpg)
Galvenie datu attēlošanas veidi:
«Dot plots» Histogramma
![Page 26: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/26.jpg)
FACSAria izmanto FACSDiVa programmatūru un datus var saglabāt FCS 2.0 vai FCS 3.0 failu veidā
• WinMDI, FlowJo, WinList, Weasel• CyFlogic• Infinicyt
• Flowing Software...un arī Excel
Citas brīvpieejas programmas:
![Page 27: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/27.jpg)
FACS – Fluorescence Activated Cell SortingPlūsmas citometrijas viens no variantiem, kad iespējams šūnas ne tikai kvantitatīvi un kvalitatīvi detektēt, bet arī pēc šīm īpašībām fiziski atdalīt vienu no otras.
![Page 28: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/28.jpg)
2. Tiek pielikts spriegums pjezokristālam
3. Atdalās lādēti pilieni
4. Deflekcijas plātnes pievelk vai atgrūž lādētos pilienus
5. Nelādētie pilieni nonāk atkritumos
6. Tiek savākti lādētie pilieni, kas satur interesējošās daļiņas
(Vibrācija ar frekvenci 90000 Hz/s – tik pat daudz pilienu veidojas sekundes laikā!)
Plūsmu iespējams sadalīt 2 vai 4 daļās
1. Paraugs ģenerē gaismas izkliedi un fluorescentos signālus. Tiek pieņemts lēmums, balstoties uz šķirošanas stratēģiju
![Page 29: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/29.jpg)
![Page 30: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/30.jpg)
Un šādi dabā
![Page 31: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/31.jpg)
Šķirot iespējams:stobriņos – 2 vai 4 virzienos reizē
![Page 32: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/32.jpg)
Šķirot iespējams:stobriņos – 2 vai 4 virzienos
uz platēm – 384, 96, 48, 24, 6 bedrīšu
• Šķiro tikai 1 populāciju uzreiz• Var nodefinēt:
dažādas populācijas bedrītēsprecīzu šūnu skaitu bedrītē
Precizitāte 99%
![Page 33: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/33.jpg)
Šķirot iespējams:stobriņos – 2 vai 4 virzienosuz platēm – 384, 96, 48, 24, 6 bedrīšu
uz mikroskopa slaidiem
Izkārtojums uz slaida:
![Page 34: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/34.jpg)
Šķirot iespējams:stobriņos – 2 vai 4 virzienosuz platēm – 384, 96, 48, 24, 6 bedrīšuuz mikroskopa slaidiem
custom device – nodefinējam savu izkārtojumu uz kaut kā ko var uzlikt uz plašu paliktņa, piemēram,
petri trauks, apakštasīte, utt.utjp.(max – 25 kolonnas, 60 rindas)
![Page 36: Plūsmas citometrija](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081506/56815438550346895dc23aa1/html5/thumbnails/36.jpg)
Dalāmies!