HIZLI VİRAL TANI TESTLERİ
Doç. Dr. Dilek ÇolakAkdeniz Üniversitesi Tıp FakültesiTıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Viroloji Bilim Dalı
FEN. 2004. Ankara
Virolojik Tanı Yöntemleri
Direkt tanı
yöntemleri
İndirekt tanıyöntemleri
Virolojik Tanı Yöntemleri1. Direkt Tanı yöntemleri
• Direkt incelemeHistolojiSitoloji
• Elektron mikroskobisi yöntemi• Hücre kültürleri• Antijenlerin saptanması
İmmün boyama (-floresan, -peroksidaz, vb)ELISALateks agl.
• Nükleik asitlerin tayiniMoleküler testler
Virolojik Tanı Yöntemleri2. İndirekt Tanı Yöntemleri
• Özgül antikorların araştırılmasıIgM
IgG
IgG avidite
serum, BOS, vb
Sitoloji:Virus grubu !
Tzanck smear HSV - VZV
Sitoloji:
İntranükleer inklüzyonlar CMV
Elektron Mikroskobisi Yöntemi
Dışkı Rotavirus, Adenovirus
Vezikül sıvısı HSV, VZV
Adenovirus Rotavirus(courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.)
Elektron Mikroskobisi Yöntemi
Elektron Mikroskobisi Yöntemi
Direkt görüntüVirus karekterizasyonuHızlıAyrdedici
PahalıDuyarlılık 106part./ml
İmmün Elektron Mikroskobisi
Araştırma lab.
Hücre kültürleri
• KonvansiyonelCPE
• Geç sonuç (1-30 gün)• Örnek kalitesi ve transportu çok önemli• Kontaminasyon riski• Örneklerin toksik etkisi• Üremeyen viruslar
Hücre kültürleri
• Hızlı hücre kültürleriCMV 48 saat
Hücre kültürleri
Viral Antijenlerin Saptanması
• Hızlı• Canlı virusa gerek yok
• İmmünfloresan boyama (FAT)
• EIA• Lateks agl.
• RSV• Influenza• Parainfluenza• Adenovirus• HSV
• Varicella-zoster• CMV• Rotavirus• HBV
Viral Antijenlerin Saptanması
Viral Antijenlerin SaptanmasıNazofaringeal aspirat
Dışkı
Deri
Kan
RSVInfluenza A and BParainfluenzaAdenovirus
RotavirusesAdenoviruses
HSVVZV
CMV (pp65 antijenemi testi)
Viral Antijenlerin Saptanmasıİmmünfloresan boyama
(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)
Viral Antijenlerin Saptanması
FAT
Deride HSV (DFA)
Periferik kan lökositleri
Ciddi lökopenide yetersiz kalır!
3-4 saat
CMV antijenemi testi;CMV pp65 antijeni
Viral Antijenlerin Saptanması
pp65 antijenemi testi
Viral Antijenlerin Saptanması
RSV
FAT
Influenza A
HSV 1-2;
Duyarlılık Özgüllük PPD NPDFAT 80 93.3 92.3 95.1Shellvial-IP 87.6 100 100 96.9Kon.kültür 100 100 100 100
Chan EL et al. Clin Diagn Lab Immunol 2001;8:909-912
1188 nazal yıkama örneği sitospin preparatıFAT x Hızlı hücre kült.
%Virus Duyarlılık Özgüllük PPD NPDADV 62.5 100 100 93.8Infl.A 80 98.6 85 99.6Infl.B 67.4 100 100 98PI.1,2,3 88.5 99.7 96.4 98.9RSV 93.8 95.6 87 98Toplam 86.7 93.8 87.9 93.1
Rochol C, et al. Pediatrics 2004;113:e51-e56
FAT yönteminde: • Örnek kalitesi çok önemli• Örnekte yeteri kadar hücre olmalı
“yalancı negatif sonu甕 Deneyimli personel gerekli• Çok sayıda örneğin incelenmesi zor
EIA
Viral Antijenlerin Saptanması
Viral Antijenlerin Saptanması
EIA
• Çok çeşitli örnek çalışılır
• Fazla sayıda örnek çalışılır
• Otomasyon
Viral Antijenlerin Saptanması
Membran EIA
Viral Antijenlerin Saptanması
Lateks aglütinasyon
Nükleik Asit Tayini
Moleküler testler• Polimeraz zincir reaksiyonu
Klasik PCRReal-time PCR
• Hibridizasyon
Nükleik Asit Tayini
Klasik PCR
C obas Am plicor CM V M onitor1. D N A ekstraksiyonu
plazm a2. Am plifikasyon (PC R )
ve h ibridizasyon(C M V, IC )
3. Sonuçların basılm ası
4. D uyarlılık sın ırları4x102-1x105 kopya/m l p lazm a
Nükleik Asit Tayini
Nükleik Asit Tayini
Real-time PCR
Plato fazı
Geçiş fazı
Logaritmik faz
Döngü sayısı
Eşik çizgisi
Sinyal
10 20 30
Baz çizgisi
Amplifikasyonla ilişkili floresan sinyallerinin alınması için gereken siklus sayısı (Ct değeri), başlangıçtaki hedef nükleik asit miktarıyla ters orantılı
Nükleik Asit TayiniReal-time PCR
SYBR green I
Fluorescense resonance energy transfer (FRET)
Hibridizasyon probları
Taq-man probları
Molecular beacons
Nükleik Asit Tayini
Real-time PCR ürün saptama
SYBR green
FRET
Taq-man probları
Molecular Beacons
1- Tam kandan nükleik asit izolasyonu1- Tam kandan nükleik asit izolasyonu
3- Hibridizasyon elekt.kemilumin.
saptama (CMV, IC)
3- Hibridizasyon elekt.kemilumin.
saptama (CMV, IC)
lineer faz
Primer 1Primer 1Revers TranskriptazRevers Transkriptaz
RNaRNazz HHPrimer 2Primer 2Revers TranskriptazRevers Transkriptaz
T7 RNA polT7 RNA poliimeramerazzPrimer 2Primer 2
Revers TranskriptazRevers Transkriptaz Revers TranskriptazRevers TranskriptazRNaRNazz H H Primer 1Primer 1
• sense RNA• antisense RNA• sense DNA• antisense DNA
amplifikasyon fazı
Nuclisens pp67 (NASBA) testiNuclisens pp67 (NASBA) testi
2- İzotermal amplifikasyon(41°)
2- İzotermal amplifikasyon(41°)
4. Duyarlılık: 700 RNA molekülü
Hybrid capture CMV DNA testi• 1-DNA
ekstraks.• Tam kan
• 2-Hedef DNA’nın CMV RNA probu ile hibridizasyon
• 3-DNA: RNA hybridlerinin antikorla tutulmasıby antibody
4- Konjugat
•5.Kemilüm.saptama
Quantiplex (bDNA) CMV testi
1-DNA izolasyonu ve denatürasyonu
2-HibridizasyonCMV gB/UL 56
solid faz
3-Hibridizasyon(bDNA)
4-bDNA hibridizasyonu
5-Substrat
İşaretli probO O OOH2
OPO-2
Duyarlılık: 900 kopya/106 lökosit
Quantiplex (bDNA) CMV testi
1-DNA izolasyonu ve denatürasyonu
2-HibridizasyonCMV gB/UL 56
solid faz
3-Hibridizasyon(bDNA)
4-bDNA hibridizasyonu
5-Substrat
İşaretli probO O OOH2
OPO-2
Duyarlılık: 900 kopya/106 lökosit
ADV, 37 konjonktival sürüntü örneği
%Test Duyarlılık Özgüllük PPD NPDH.kült. 76.9 100 100 64.7FAT 73.1 100 100 61.1PCR 88.4 100 100 78.6
Percivalle E, et al. J Clin Virol 2003;28:257-264
FAT (-) diğer testler
132 KHT alıcısıADV, >5000 örnek perif. kan lökositleriReal-time PCR dışkı
idrarboğaz sürüntüsü
Periferik kan löokositlerinde PCR (+)
İnvaziv ADV inf. göstergesi
Lion T, et al. Blood 2003;102:1114-1120
Moleküler testler: Avantajları
• Hızlı
• Duyarlılık yüksek“latent viruslar için kantitatif testler”
• Pek çok patojen için uygulanabiliyor
• Seçilen yönteme göre kontaminasyon riski çok az“MagnaPure+LightCycler”
Tedavi monitörizasyonu
Moleküler testler: Dezavantajları
• Çoğu standardize değil“internal ve eksternal kalite kontrol uygulamaları”
• Lab.lar arası sonuç karşılaştırması zor“tanı karmaşası”
• PCR temelli olanlarda IC kullanılmalı
• Rutin sonuç verirken dikkat!
• Pahalı
•Seçilen yönteme göre kontaminasyon riski fazla“in house PCR”
Seroloji:
BOS’da antikor tayini:HerpesviruslarRespiratuvar viruslar
İntratekal antikor sentezi olduğu gösterilmeli
BOS spesifik Ab :serum spesifik Ab BOS IgG:serum IgG 1.5
İletişim
Laboratuvar klinik
Toplantılar Karşılıklı bilgilendirmeHasta bilgileri paylaşılmalı..........
YorumElde edilen sonuçlar
neyin göstergesine diyorşimdi n’olacak?
Mikrobiyolog yaptığı testin sonucunun yorumunu yapabilmeli
Klinisyen istediğitestin sonucununyorumunu istemeli,öğrenmeli
“Rekabet ile işbirliğini harmanlayıp;
düşleri ortak bir gerçekliğe aktarmak...”
Bahar Ö. Düzgören