Nuove proposte a livellointernazionale per laapplicazione di metodi rapidi e innovativi per la ricerca di batteri e virus negli alimenti
D. De Medici e M. Paniconi
“FOCUS SU SICUREZZA D’USO E NUTRIZIONALE DEGLI ALIMENTI” Roma 21 - 22 novembre 2005
Metodi classici per la determinazione di patogeni
• Lunghi (4-6 giorni)• Costosi• Non quantitativi• MPN
Metodi alternativi
•Rapidi
•Meno costosi
•Automatizzati
•Possibilmente quantitativi
Armonizzazione e Standardizzazione di un nuovo metodo microbiologico
Validazione del metodo attraverso ring trial interlaboratorio
Definizioni di linee guida.Corsi di training
Metodo standardizzato
Identificazione dei metodi riportati in letteratura
Valutazione delle tecniche di preparazione del campione in relazione alle matrici
Comparazione intralaboratorio delle performance dei differenti metodi A
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ISO, CEN, UNI
Attività di laboratorio
Attività di normazione
Progetti di ricerca
Metodi Rapidi: attività di normazione
• ISO 16140:2003 CEN/TC 275/WG 6: Microbial
contamination
• CEN/TC275 WG 6 TAG3 "General requirements relating to methods of detecting microorganisms in foodstuffs using PCR"
• CEN/TC275 WG 6 TAG4 "Detection of Viruses in food"
Progetti Europei5th Framework• FoodPCR• Foodborne virus in Europe
6th Framework• FoodPCR 2• SeaFoodPlus
Food-PCRValidation and Standardization of Diagnostic Polymerase Chain Reaction for Detection of Foodborne Pathogens5th Framework Program, Project QLK1-CT-1999-00226
Coordinator: Jeffrey Hoorfar, DFVF
Total budget: 2.5 MIO Euro, 1.7 MIO Euro EC funding
12 expert and 24 end-user laboratories from EU and other European countries (Italy ISS and CoopItalia)
www.pcr.dk
Patogeni studiati
•Salmonella spp.
•Foodborne thermotolerant Campylobacter spp.:
(C. jejuni, C. coli, C. lari)
•Enterohemorragic Eschericia coli (EHEC)
•Listeria monocytogenes
•Yersinia enterocolitica
Organizzazione del progettoWP1: Construction of DNA banks
WP2: Validation of thermocyclers
WP3: Pre-PCR sample treatment
WP4: Collaborative trials
WP5: Automated detection
WP6: Guidelines, standards and workshops
Risultati ottenuti• Reference DNA for each pathogen
• Thermocycler validation study
• Optimized PCR for each pathogen assay
• Pre-PCR treatments for carcass swab, carcass rinse, and milk
• 4 + 1 validated PCR assays
• > 30 publications.
AQUA DEST50µl
TEMPERATURE RECORDING UNIT
FIX THE LOCATION OF THE THERMOSENSORWITHIN THE PCR TUBE
SCHODER et al. 2001
Thermocycler validation study
Biochemical Testing: Amplification efficiency
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A a aB b bC c cD d d
E a a b c d aF b bG c cH d d
Positioning pattern:• a, b, c and d reaction equivalents to ≅ 15000, 1500, 150 and 15 target copies• five replicates
Time Temp.
InitialDenaturing 1 min 95°C
Denaturing 10 s 95°C
Annealing 20 s 63°C
Elongation 20 s 72°C
TerminalElongation 5 min 72°C
PCR conditions:• 40 PCR cycles• modified thermosensitive target sequence, similar to Penicillin binding factor A from Listeria• amplicon of 116 bp
Kuhn et al. 2001
Results of the collaborative trials of the PCR-based methods
54.381.869.730.3Y. enterocolitica /Swine carcass
10010084.6100Salmonella spp. /Poultry carcass
10010084.6100Salmonella spp. /Swine carcass
10010010092.6EHEC / Cattle carcass
10010010096.7Campylobacter /Poultry carcass
95.696.1 83.394.2Campylobacter / Swine carcass
Concordance (%)Accordance (%)Specificity
(%)Sensitivity
(%)
Una reazione di PCR negativa può essere dovuta a vari fattori: assenza del target, malfunzionamento dell’apparecchio, presenza di sostanze inibenti, scarsa attività della polimerasi ecc.
Necessità di validare attraverso ring trial internazionali solo metodi che includono la presenza di Internal AmplificationControl (IAC).
Un risultato falsamente negativo è un problema di sanità pubblicaUn risultato falsamente positivo è un problema commerciale
FOOD-PCR 2WP 10 of MedVetNet Network of Excellence, www.MedVetNet.org
WP leader: DFVF
19 partners: 9 main (funded) and 10 associated (no funding).
12 countries.
18 months: Sept. 1st 2004 – March 1st 2006.
Budget: 251 000 Euro, incl. 210 000 Euro from EC.
5 tasks and 6 deliverables.
www.foodpcr.com
Central Service Laboratory -York
National Veterinary and Food Research Institute
Università di Vienna
Congen-Berlino
Università di Giessen
Università di Liegi
Iceland FisheringLaboratories
Danish Meat ResearchInstitute
Instituto di Ricerca e Tecnologia Alimentare
WP1 Microarraystandardization
WP2 General requirements for real-time PCR standardization:
WP3 Preparation of ring-trials andreference materials for Salmonella
WP4 PCR testing ofanimal faeces
WP5 Standards for virus in produce
Real-Time PCR in Italia•10 Istituti Zooprofilattici Sperimentali •Istituto Superiore di Sanità -Roma•Consorzio di Bioingegneria e Informatica (Pavia)•Università Cattolica del Sacro Cuore - Piacenza
Ricerca Finalizzata 2005: Sicurezza Alimentare: studio e applicazione di modelli di controllo e di microbiologia predittiva su base Real-TimePCR per valutare la presenza e il comportamento di patogeni in prodotti tradizionali italiani
Responsabile: Dr.ssa N. Losio IZS della Lombardia e dell’Emilia
Validazione di due metodi per la ricerca e numerazione della Listeria monocytogenes e della Salmonella in prodotti tipici italiani
Rapid detection of transnational foodborneviral infections and elucidation of transmission routes through moleculartracing and development of a common databaseA research proposal on “Quality of Life and Management of Living Resources”(1999/C 64/14)
FBVE Network
11 centri ricerca in 9 Paesi
ISS:L. Croci,
D. De MediciF.M. Ruggeri
RIVM
M. Koopmans
Risultati del FBVEIl progetto prevedeva principalmente lo sviluppo di un data base europeo per l’archiviazione delle sequenze dei virus enterici isolati in E.U. (https://hypocrates.rivm.nl/bnwww/)
Sviluppo e validazione di metodi di Real-TimePCR quantitativi per la determinazione di HAV e norovirus in molluschi
Attività di normazione nel CEN
CEN/TC275 WG 6 TAG3 "General requirements relating to methods of detecting micro-organisms in foodstuffs using PCR"
Inizio dei lavori:Berlino Dicembre 2000
10 riunioni
CEN/TC275 WG 6 TAG4 "Detection of Viruses in food“
Inizio Lavori: Saint Denis Marzo 2004
3 riunioni
CEN/TC275 WG 6 TAG3 "General requirements relating to methods of detecting microorganisms
in foodstuffs using PCR"EN ISO 22714
Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens – General requirements and definition
Lo standard EN-ISO 22174 è stato pubblicato il 15-02-2005
CEN ISO TS 20836
Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens –Performance criteria for thermal cycler
La specificazione tecnica CEN ISO/TS 20836 è stata adottata e pubblicata ad
Agosto 2005
CEN/TC275 WG 6 TAG3 "General requirements relating to methods of detecting microorganisms in foodstuffs
using PCR"
prEN ISO TS 20837
Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens – Requirements of sample preparation for qualitative methods
prEN ISO TS 20838
Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens –Requirements for amplification and detection for qualitative methods.
Lo votazione per questi due standard è iniziata a settembre 2005
ISO 22174 General requirements and
• Procedura analitica• Aree di lavoro• Controlli da effettuare
ISO 22174 Procedura analitica
• Pre-arricchimento del campione• Estrazione e purificazione del DNA o RNA • Amplificazione con primers specifici• Determinazione dei prodotti della PCR• I campioni positivi possono (dovrebbero)
essere confermati utilizzando i metodi colturali*
* la positività del campione deve essere confermata quando esiste un metodo culturale ISO
ISO 22174 StruttureIl laboratorio deve disporre di un minimo di quattro
aree separate:a) Preparazione della soluzione di acidi nucleici da
materiale da saggiob) Preparazione delle mastermixc) Preparazione delle miscele di amplificazione con
l’aggiunta delle soluzioni di acidi nucleicid) Determinazione e conferma dei prodotti della PCR
L’amplificazione può essere effettuata sia nell’area c) che d)Se il termal-cycler è posta nell’area c) i tubi dopo amplificazione non possono essere aperti nell’area c) ma nell’area d).
ISO 22174 Controlli
Determinazione
Amplificazione
Estrazione DNA
Trattamento del campione
Controllo negativo
PCR
Controllo positivo
PCR
Controllo interno di
amplificazione
Controllo negativo di estrazione
Controllo positivo di processo
Controllo negativo di processo
Possibile inibizione---+--
Possibile contaminazione±±++++
negativa++-++-
positiva+±-+++
Interpretazione dei risultati
Controllo di amplificazion
e esternoIAC
Controlli negativi (processo, estrazione
PCR)
Controllo positivo
PCR
Controllo postivo di processo
Risultato del test
ISO 20836 Performance of Termal cycler
• Performance test– Annex A Biochemical performance test– Annex B Physical performance test
GRAZIE !!!!