Download - PRIMÁRNÍ A SEKUNDÁRNÍ METABOLIZMUS
PRIMÁRNÍ A SEKUNDÁRNÍSEKUNDÁRNÍ METABOLIZMUS Studium primárního metabolizmuStudium primárního metabolizmu
Fotosyntéza, ovlivnění fotosyntézy vnějšími podmínkami, asimilace N, inhibice produkty, transport cukrů, akumulace rezervních látek….
Studium a využití sekundárního Studium a využití sekundárního metabolizmumetabolizmu
• syntéza sekundárních metabolitů (známo asi 30 000 látek)
• biotransformace
Rostliny -- zdroj - potravy
- chemických látek
• léčiva• insekticidy• barviva• aromatické látky
látky obtížně získatelné jinou cestou
Snaha o získání kultivací rostlinných explantátů in vitro
Výhody kultivace in vitro:
nezávislost na sezónní proměnlivosti (zkrácení
doby)
-“- škůdcích a chorobách
-“- geografických a politických omezeních
možnost řídit produkci podle potřeby
-“- zajistit stálou kvalitu produktuAle : ??? rentabilita produkce
nutnost vysokých výtěžků
Dva základní přístupy k dosažení produkce sekundárních Dva základní přístupy k dosažení produkce sekundárních metabolitů:metabolitů:
• produkce v suspenzní buněčné kultuře
• imobilizace buněk – růst a produkce po prodloužený časový úsek
Kultivace suspenzní buněčné kultury stálá nezamýšlená selekce buněk s
nejvyšší růstovou rychlostí – buňky malé, „ meristematické“, mitoticky aktivní
Syntéza sek. metabolitů NE!NE! u rychle rostoucích nediferencovaných buněk (často je nutný určitý stupeň diferenciace (morfologické, biochemické) pomalejší růst
In vivo akumulace sekundárních metabolitů často ve vysoce specializovaných buňkách, ale pozor !!, někdy specifická místa slouží jen ke skladování
Potřeba nalézt podmínky, které vedou současně k dobrému růstu i dobré produkci
Ztráta produkce při dediferenciaci buněk
alternativa : kultivace organizovaných kultur
kořenové kultury
Př.: tkáňové kultury za podmínek diferenciace kořenů ---- produkce atropinu
Dvoustupňová kultivace
1. stupeň ---- pěstování na udržovacím (množícím) médiu –
získání dostatečného množství biomasy
2. stupeň ----- pěstování na produkčním médiu
indukce tvorby sekundárního metabolitu
Změna v mnoha složkách
Udržovací Udržovací XX produkční média produkční média
hormony – asi nejdůležitější faktor – rovnováha i koncentrace a typ, zejména
auxinů a cytokininů
minerální složení média největší vliv N, P, důležitá koncentrace i typ: NO3-,
NH4+,
močovina, aminokyseliny obvykle omezení zásobení N a P potlačení růstu zvýšení produkce
Př.: Morinda citrifolia – produkce antrachinonu … po koncentrace PO3-
Př.: Catharanthus roseus produkce indolových alkaloidů po koncentrace PO3-
cukry konc. z 1-2 % (udržovací médium) 5-10 % produkce sek.
metabolitů
pH média
organické přídavky
Př.: Nicotiana tabacum produkce nikotinu po snížení koncentrace NAA a KIN a vynechání hydrolyzátu kaseinu
stresstres - podmínky negativně působící na růst
• hormonální stres
• výživový stres (cukr, N, P, vzdušnění)
• chemický stres (antibiotika, těžké kovy, elicitory)
• osmotický stres
• stres infekce (mikroorganizmy, viry)
• světelný stres
• teplotní stres
produkce sek. metabolitů
Př.: produkce karotenoidů, flavonoidů, polyfenolů po ozářenosti
Př.: produkce alkaloidů po ozáření modrým světlem
Př.: produkce alkaloidů při změnách teploty
Velkoobjemové kultivace
Podmínky průmyslových kultivačních postupů – pěstování obdobné mikrob. kultivacím
Ale !!!Ale !!! některé podstatné rozdíly
Inokulační denzita
Rychlost růstu
Citlivost ke střižnému napětí
Morfologie kultury
Požadavky na vzdušnění
Mikrob.
kultura Rostlinná
kultura malá
velká
malá
jednotlivé buňky
vysoké
velká
malá
velká
shluky
nízké
Rychlost růstu: čas zdvojení 1-3 dny, experiment trvá
týdny problém sterility
Citlivost ke střižnému napětí: velké rozměry
buněk,rigidní buněčná stěna, vakuola nutnost specifických míchacích zařízení
Uvolňování produktů – problém (hromadění ve vakuole)
dvoustupňový postup : hromadění- uvolňování
Imobilizace Imobilizace
• možnost znovupoužití biomasy
• oddělení buněk od produktu
• dobré prostorové využití kultivačních nádob
• dosažení kontinuálního procesu
+
• nutnost získání vyhovujících linií
• vhodná imobilizační metoda
• uvolňování produktu do média
Metody imobilizace
Citlivost k mechanickému, osmotickému, výživovému stresu, teplotě , pH, O2 omezený výběr imobilizačních metod
Co se nehodí ? - poutání na povrch kovalentní vazbou, zachycení do polyakrylamidu, vinylových polymerů
Co se hodí ? -- alginát, agaróza, nosiče - nylon, někdy polyuretan
Produkce kapsicinu
Hlavní problém imobilizace – difúze látek
Vytvoření mikroprostředí – závisí na velikosti částic, porozitě, míchání, koncentraci substrátu, distribuci biomasy uvnitř partikulí
??!! Někdy vhodné pro navození stresu
Př.:Př.: 1. průmyslově využívaná produkce – šikoninšikonin. Tradiční
japonské léčivo a barvivo - producent Lithospermum erythrorhizon; v
přírodě obsah 1-2%, v kulturách in vitro 12-15 %
Př.:Př.: 1. průmyslově využívaná produkce – šikoninšikonin. Tradiční
japonské léčivo a barvivo - producent Lithospermum erythrorhizon; v
přírodě obsah 1-2%, v kulturách in vitro 12-15 %
Př:Př: Produkce sekundárního metabolitu – léčivo taxoltaxol
19691969 - objeveno nové protinádorové antibiotikum - taxol produkuje Taxus brevifolia
19831983 – 1.fáze klinických testů – v současnosti jedno z nejdůležitějších cytostatik,
Ale !!! K získání 1 kg taxolu je třeba 700 – 900 kg kůry tisu
Snaha o produkci látky kulturami in vitro
založení tkáňových kultur různé typy primárních explantátů média růstové regulátory
sacharidy antioxidanty adsorbenty fenolických látek světelné podmínky teplota
elicitace přídavky prekurzorů infekce Agrobacteriem
Odvozeny linie s 40x vyšším obsahem taxolu než je v kůře T. brevifolia, suspenzní kultury produkující 20 mg taxolu v 1l média
20022002 zahájení komerční produkce taxolu
prototyp nové řady antibiotik
Př.:Př.: chinin Cinchona officinalis antimalarikum
dogoxin Digitalis lanata kardiotonikum
morfin Papaver somniferum analgetikum
thebain Papaver bracteatum zdroj kodeinu
scopolamin Datura stramonium snížení krevního
tlaku
atropin Atropa beladona spasmolytikum
steviocid Stevia rebaudiana sladidlo
kapsicin Capsicum frutescens léčivo
jasmin Jasminum spp. parfém
pyrethriny Chrysanthemum cinerariaefolium insekticidy
Př:Př: Biotransformace
digitoxin digoxin
Obě látky produkuje Digitalis lanata , ale účinné kardiotonikum je digoxin, rostlina produkuje zejména digitoxin
Zvládnuta biotransformace digitoxinu suspenzními buněčnými kulturami nebo imobilizovanými buňkami D. lanata
za použití : suspenzních kultur imobilizovaných buněk částí buněk izolovaných enzymů
Biotransformace
Ztráta schopnosti syntetizovat sekundární metabolit, ale zachování aktivit některých enzymů
Možnost modifikace přirozených
syntetických
látek
... oxidace, redukce, hydroxylace, metylace, glykosylace, esterifikace, epoxidace…
Př:Př: Biotransformace
steviol (aglykon) steviocid, steviobiocid
Zvládnuta biotransformace steviolu suspenzními buněčnými kulturami Stevia rebaudiana a Digitalis purpurea