Download - Produkcija citokina
![Page 1: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/1.jpg)
Metode za selektivno izdvajanje i ispitivanje
funkcija ćelija prirodnog i adaptivnog imuniteta
![Page 2: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/2.jpg)
U istraživačkom i kliničkom radu najčešće se koriste prečišćene populacije odgovarajućih
ćelija
Selektivno izdvajanje ćelijskih populacija:
1.Na osnovu različitih fizičkih osobina
2.Na osnovu ekspresije različitih površinskih molekula
Izdvajanje ćelija
![Page 3: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/3.jpg)
1. Na osnovu fizičkih osobina (gustina,
adhezivnost)a) Izdvajanje ćelija na gustinskom gradijentu
b) Izdvajanje ćelija na osnovu adhezivnosti
![Page 4: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/4.jpg)
a) Izdvanaje ćelija na gustinskom gradijentu
Različita gustina i težina ćelija
Uzorak: periferna krv, tkivni homogenat...
Grdaijenti: Ficol, Perkol, Opti prep, Nyco prep...
Uslovi razdvajanja: temperatura, rpm, odnos zapremine gradijenta i uzorka
(prema preporuci
proizvodjača)
![Page 5: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/5.jpg)
![Page 6: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/6.jpg)
Izolacija mononuklearnih ćelija na gustinskom
gradijentu
https://www.youtube.com/watch?v=6lsldFFMEhE
![Page 7: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/7.jpg)
Dobijanje i kultivacija dendritskih ćelija poreklom od monocita
(kultivacija, 6 dana)
(10%FCS/RPMI + GM-CSF i IL-4)
stimulacijarazličitim
Imunomodulatorima, kultivacija
Ispitivanje fenotpiskih i funkcionalnih
karakteristika MoDC
-Ekspresija površinskih markera (protočna citometrija)-Procena alostimulatorne sposobnosti MoDC-Produkcija citokina od strane MoDC-Produkcija citokina od strane T-limfocita u ko-kulturi
![Page 8: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/8.jpg)
b) Izdvajanje ćelija na osnovu adhezivnosti
Adherencija za plastiku ili staklo
Adherentne ćelije – makrofagi, DĆ
Neadherentne ćelije – T limfociti
![Page 9: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/9.jpg)
2. Na osnovu ekspresije različitih
površinskih molekula Ćelijski markeri: CD3, CD21, CD11c, CD11b...
Antitela specifična za ćelijske markere
Izvor ćelija: periferna krv, ćelije kosne srži, limfnih čvorova,slezine
![Page 10: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/10.jpg)
2. Na osnovu ekspresije različitih
površinskih molekula
a) Metod paninga
b) Imunomagnetno sortiranje
![Page 11: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/11.jpg)
a) Metod paninga Adherencija za plastične površine obložene
antitelima Direktan paning Indirektan paning
![Page 12: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/12.jpg)
b) Imunomagnetno sortiranje
Magnetne kuglice obložene antitelima
Direktno imunomagnetno sortiranje
Indirektno imunomagnetno sortiranje
![Page 13: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/13.jpg)
antigen
antitetlo
magnetnačestica
Magnet
ćelija koja ne iskazuje antigen
ćelija koja iskazuje antigen
suspenzija ćelija izlaganje magnetu razdvojene populacije ćelija
https://www.youtube.com/watch?v=vEaYuZIx2sg
![Page 14: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/14.jpg)
Testovi za ispitivanje funkcija imunskih ćelija
Određivanje broja i vijabilnosti ćelija
Testovi za ispitivanje funkcija ćelija prirodnog imuniteta
Testovi za ispitivanje funkcija ćelija adaptivnog imuniteta
![Page 15: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/15.jpg)
ODREĐIVANJE BROJA I VIJABILNOSTI ĆELIJA
Brojanje ćelija na hemocitometru/
elektronski brojačTripan plavoMetilensko plavoKristal-violet testPropidijum jodidMTT test
![Page 16: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/16.jpg)
MTT TEST Vijabilnost ćelija odgovara
aktivnosti mitohondrija Kolorimetrijski test: MTT žute
boje se u živim ćelijama redukuje u crveno mrki nesolubilni formazan; rastvaranje kristala formazana→ oslobađanje boje, merenje apsorbance
![Page 17: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/17.jpg)
TESTOVI ZA ISPITIVANJE FUNKCIJE ĆELIJA PRIRODNOG IMUNITETA
FAGOCITI (MAKROFAGI i NEUTROFILI)
NK ĆELIJE
![Page 18: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/18.jpg)
FAGOCITIMAKROFAGI - Produkcija citokina (IL-12, TNFα...)- Fagocitoza- Produkcija NO i ROS
NEUTROFILI- Produkti granula (MPO, elastaza, katepsin G...)- Fagocitoza- Produkcija NO, ROS- Produkcija citokina (IL-1, IL-6...)
![Page 19: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/19.jpg)
1. Određivanje sposobnosti adhezije
Ispitivanje adhezije granulocita periferne krvi sa i bez prisustva ConA
Kratak opsi procedure:- kultivisati ćelije u mikrotitarskoj ploči (5x106 ćelija/bunariću) u četveroplikatima- dodati PMA (samo u polovinu bunarića)-ostaviti da se inkubira 60 minuta pa potom ispranjem toplim PBSom ukloniti neadherentne ćelije- fiksirati adherentne ćelije metil-alkoholom (5-7 min)- obojiti ćelije rastvorom metilenskog plavog (10 min)- isprati boju 3x česmenskom vodom- dodati HCl (200μl, 0,1N HCl)- očitati apsorbancu na 650nm
![Page 20: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/20.jpg)
2.TEST FAGOCITOZE
čestice obeležene fluorohromom,fagocitoza se detektuje fluorescentnim mikroskopom/FACS
3.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE CITOKINA
Vanjćelijska/unutarćelijska detekcija citokina;
ELISA testovi, ELISPOT...
![Page 21: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/21.jpg)
4.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE ROS-NBT test
FORMAZAN (redukovana forma,
plav→ sivo-crn)
NADPH oksidaza NBT
(oksidovana forma žuta)
Kolorimetrijski test
Intenzitet redukcije NBT-a srazmeran produkciji ROS
![Page 22: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/22.jpg)
5. ODREĐIVANJE PRODUKCIJE NO
Griess-ova reakcija(merenje neorganskog nitratakoji je krajnji produkt oksidacije
kratkoživećeg NO)
6. ODREĐIVANJE PRODUKCIJE MIJELOPEROKSIDAZE
![Page 23: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/23.jpg)
• 7. ODREĐIVANJE MIGRACIJE NEUTROFILA (Transwell sistem)
7. ODREĐIVANJE MIGRACIJE NEUTROFILA (Transwell sistem)
![Page 24: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/24.jpg)
NK ĆELIJETestovi za funkcionalno ispitivanje NK ćelija:1. Citotoksičnost
( korišćenje tumorskih ćelijskih linija npr. K562 i radioaktivnog 51Cr)2. Produkcija citokina (INF-γ)
ELISA, ELISPOT
![Page 25: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/25.jpg)
T limfociti• test proliferacije T limfocita in vitro• detekcija produkcije citokina• test citotoksičnosti
TESTOVI ZA ISPITIVANJE FUNKCIJE ĆELIJA ADAPTIVNOG IMUNITETA
B limfociti• test proliferacije B limfocita in vitro• detekcija produkcije antitela
![Page 26: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/26.jpg)
T LIMFOCITITest proliferacije
• Proliferacija stimulisana različitim poliklonskim aktivatorima ili mitogenima limfocita (con A, fitohemaglutimin-PHA,anti-CD3, PMA...) ili specifinim antigenom
• Proliferativni odgovor se može meriti MTT testom, na osnovu inkorporacije 3H timidina u DNK...
![Page 27: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/27.jpg)
-Izolacija mononuklearnih ćelija-Kultivacija ćelija sa stimulatorom/antigenom 3-5 dana-Pred kraj kultivacije dodavanje radioaktivnog 3H timidina-Merenje radioaktivnosti na sintilacionom brojaču β zračenja
![Page 28: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/28.jpg)
MEŠANA LEUKOCITNA
REAKCIJA (MLR)
Transplantaciona reakcija
Limfociti donora i recipijenta
Dvosmerna i jednosmerna MLR
![Page 29: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/29.jpg)
Produkcija citokina (ELISA, RIA, PCR...)
ELISPOT
![Page 30: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/30.jpg)
Određivanje citotoksične aktivnosti T limfocita• Kokultivacija citotoksičnih T ly sa ciljnim
ćelijama (tumorske ćelije,ćelije inficirane virusom itd) koje su obeležene radioizotopom (npr. 51Cr)
• Nivo oslobođenog radioizotopa je srazmeran citotoksičnom potencijalu ćelija
![Page 31: Produkcija citokina](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020113/589049ad1a28ab3e038c0c20/html5/thumbnails/31.jpg)
B LIMFOCITITest proliferacije
• Isti kao i kod T limfocita (kao mitogen se može koristiti stafilokokni protein A)
Produkcija antitela• ELISA, RIA, ELISPOT