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DISPLASIA FIBROSA
Mariano Mar(na Papacci Francesca Pecce Valeria Proie1o Marco
Anno Accademico 2010/2011
Proge1o di terapia genica nella cura della
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Sindrome di Mc Cune -‐ Albright
Macchie cutanee
Iperfunzione endocrina mul(pla
Mixomi Intramuscolari (Sindrome di Mazabraud)
• Formazione di tumori benigni intramuscolari
Displasia Fibrosa Ossea
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Macchie cutanee Iperfunzione endocrina mul(pla
• Pubertà precoce
• Iper(roidismo
• Gigan(smo
• Sindrome di Cushing
• Macchie più scure a livello delle pieghe cutanee
• Forma e dimensioni variabili
• Non causano problemi medici
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Sindrome di Mc Cune -‐ Albright
Macchie cutanee
Iperfunzione endocrina mul(pla
Mixomi Intramuscolari ( Sindrome di Mazabraud)
• Formazione di tumori benigni intramuscolari
Displasia Fibrosa Ossea
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• Crescita di tessuto fibroso nell’ambito del tessuto osseo
• Mono-‐os(ca: riguarda un solo osso, 60% pz
• Poli-‐os(ca: riguarda più ossa (tendenza all’asimmetria), 40% pz
• Colpisce principalmente le ossa lunghe e cranio-‐facciali
Displasia Fibrosa Ossea
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Il mosaicismo è dato dalla mutazione che avviene a livello post zigo(co; i progenitori che derivano dalle cellule embrionali mutate si distribuiscono in diversi organi causando difeW diversi
nei mala(.
Cosa causa il mosaicismo?
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Cosa causa la displasia fibrosa?
Osteoblas( Osteoblas(
INDIVIDUI SANI INDIVIDUI MALATI
Osteoblas( Osteoblas(
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• Mutazione pun(forme del gene GNAS.
• GNAS produce 4 trascriW ( Nesp55 , XLas , A/B , Gα(s) ) che hanno in comune gli esoni dal 2 al 13.
• Ogni trascri1o u(lizza un proprio promotore, e tramite splicing alterna(vo elimina l’esone1 corrispondente ad un altro trascri1o
• Differen( pa1ern di me(lazione negli alleli paterni o materni
Cosa causa la displasia fibrosa?
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POOL AFFETTO 98 ragazze 15 ragazzi -‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐ 113
49 ragazzi ( 43% ) mostrano mutazioni in GNAS
34 mostrano una mutazione R201H cioè Arg -‐> Hys cioè Basico -‐> Basico
15 mostrano una mutazione R201C cioè Arg -‐> Cys cioè Basico -‐> Polare
TuW i pazien( mostrano mutazioni missenso dell’amminoacido R201
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Da una analisi bioinforma(ca si nota come il par(colare residuo R201 possa mutare in vario modo, originando una serie di disturbi
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β γ
GDP
Rece1ore
O
GTP
Adenilato Ciclasi α cAMP
PKA
SERIE DI RISPOSTE
FISIOLOGICHE
INDIVIDUI SANI
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β γ
Rece1ore
GTP
Adenilato Ciclasi
αM
cAMP
PKA
DEREGOLAZIONE RISPOSTE
FISIOLOGICHE
SINDROME DI MC CUNE e ALBRIGHT
INDIVIDUI MALATI
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αWT
αM
201 Arg 201 X
IL-‐6 Secreta dagli osteoblas( per s(molare il differenziamento degli osteoclas(
Ipersecrezione causa iperproduzione di osteoclas( che indebolisce osso e favorisce i rimodellamen(
Cure disponibili
Bifosfona( per frenare azione degli osteoclas(
PTH Aumenta mobilità del calcio osseo
Iperproduzione indebolisce osso
Diidrossivitamina D3 regola livello di calcio
FGF-‐23 Regola la perdita di fosfa( nei reni
//
Fosfa( per recuperare le quan(tà perse
C-‐fos Protoncogene inaWvo Al( livelli di cAMP aWvano protoncogene
Iperproduzione indebolisce osso a causa di eccessiva perdita di fosfato
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Cellule staminali stromali
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Provided by L.Naldini
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TERAPIA 1. E’ impossibile procedere con cure convenzionali
vista l’enorme quan(tà di processi che vengono deregola(.
2. E’ impossibile curare una ad una le singole manifestazioni della malaWa.
3. E’ necessaria una cura ada1a ad ogni (po di paziente vista l’eterogeneità di insorgenza della malaWa
BISOGNA AGIRE A MONTE DIRETTAMENTE SULLA SUBUNITA’ G mutata α
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β γ
Adenilato Ciclasi α
M
cAMP
β
γ
α M
DIFETTO
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Gα (i)
• Espressa cos(tu(vamente in tuW i tessu(
• Espressa a bassi livelli nelle ossa
• Riduce i livelli di cAMP s(molando la produzione dell’ enzima PDE
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β γ
Adenilato Ciclasi α
M
cAMP
β γ
PROPOSTA DI CURA Gα(i)
Pur non toccando i livelli di espressione della subunità Gα mutata, l’espressione della subunità
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• Gα (i) risponde ad aWvatori diversi rispe1o a
• Gα (i) è endogenamente espressa all’interno di tu1e le cellule
• Rido1e dimensioni 394 a.a e 40.37 kDa (facilmente inseribile in un ve1ore)
• Le sequenze a.a. di Gα (s) e Gα (i) sono molto simili
• Non sono note malaWe legate all’ overespressione di Gα (i)
BLAST
VANTAGGI DELLA PROPOSTA
PROBLEMI DA RISOLVERE
Gα (s)
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BLAST!
Query : Gs Subject : Gi
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I SOLUZIONE:
“Via semplice”
Possiamo u(lizzare una subunità Gα (i) che porta una mutazione già nota che la rende insensibile ai regolatori RGS, con il risultato di una iperaWvazione dell’aWvità di degradazione del cAMP
L’ aWvità della subunità Gα (i) viene regolata da una serie di proteine definite RGS, che legandosi alla stessa subunità ne favoriscono il passaggio dalla forma aWva a quella inaWva.
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Facciamo una serie di mutazioni pun(formi nella subunità Gα (i) fino a trovare una mutazione iperaWvante .
Notare come la sequenza amminoacidica della subunità Gα (i) sia molto simile a quella della proteina Gα (s) nella regione che mutando rende sempre aWva tale subunità. Pertanto quella può essere la prima regione da so1oporre a mutazioni indirizzate.
II SOLUZIONE:
“Via complessa”
La mutazione che rende sempre aWva la subunità Gα (s) è nota sia nella forma che nella localizzazione.
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Le subunità Gα(s) M e la subunità Gα(i) hanno stessa affinità per il complesso βγ
La regione di legame al complesso βγ mostra una forte omologia di sequenza in entrambe le due subunità α
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Confronto tra subunità Gα(i) umana e murina
La sequenza della subunità è talmente conservata che non dovrebbero sorgere problemi nell’u(lizzo di subunità Gα (i) umane in cellule o tessu( murini
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Piano sperimentale
Costru1o
Ve1ore Virale
Scelta delle cellule da u(lizzare
Verifica sperimentale della funzionalità del costru1o
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Costru1o e Ve1ore
Gα(i) + HA
PERCHE’ LENTIVIRUS?
III GEN
• Non hanno tropismo per specifiche cellule
• Modifica delle LTR riduce la loro funzione di enhancer
• Presenza di cPPT e Wpre
• Esistenza di Kit per la produzione in vitro
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Sistema cellulare
Cellule staminali stromali umane prelevate dal midollo osseo ( hBMSC) con consenso informato
SoggeW sani SoggeW mala(
BMSC BMSC
COLTURE DI CELLULE STAMINALI STROMALI
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Verifica sperimentale
Selezione delle cellule
Trasduzione Controllo inserzione
costru1o Verifica dei livelli espressione tramite WB e ELISA di Gα(i) post tra1amento
Verifica dei livelli di cAMP Verifica deilivelli di PDE
Verifica che i trascriW up-‐regola( nelle cellule malate risul(no a livelli
normali nelle cellule tra1ate
Passaggio in vivo : topo Inizio eventuale trial clinico
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PRODUZIONE DEL VETTORE
hPGK Wpre
Gα(i)+HA cPPT
pre
GA RSV
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Estrazione cellule malate e sane tramite biopsia di pazien( affeW e sani.
CELLULE STAMINALI STROMALI ALTRE CELLULE
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ALTERNATIVA alla FACS
Coltura di cellule prelevate
Coltura di cellule prelevate
Quelle in grado di formare colonie sono le staminali stromali ossee
Quelle in grado di formare colonie sono le staminali stromali ossee
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Cellule HeLA Cellule HeLA
BMSC BMSC BMSC BMSC BMSC BMSC BMSC BMSC
Trasduzione con LENTIVIRUS delle cellule BMSC
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CONTROLLO: E SE PER MUTAGENESI INSERZIONALE AVESSIMO STIMOLATO UN TUMORE?
1. Dobbiamo mantenere le cellule in coltura
2. Selezione delle cellule che iper-‐prolificano
3. U(lizzo della LAM-‐PCR per vedere dove il DNA virale si è integrato
4. Qualora si scoprissero degli hot spots si potrebbe pensare ad un modo per “mascherare” queste zone di ricombinazione.
IN OGNI CASO LA RICERCA SUBIREBBE UN RALLENTAMENTO ED UN AUMENTO DEI
COSTI
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Poco convincente: • ha bassa efficienza
• dipende dalla replicazione cellulare • subisce diluizione durante la replicazione
REPLICAZIONE EPISOMALE DEI LENTIVIRUS
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Verifica dell’espressione di Gα(i) tramite Western Blot
Non tra1ato Tra1ato
-‐ TUB
-‐ HA
Non tra1ato Tra1ato
BMSC BMSC
È possibile che in un individuo sano l’overespressione di Gα(i) por( a morte cellulare
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Verifica dei livelli di espressione di Gα(i) tramite ELISA
Gα(i) è maggiormente espressa nelle cellule tra1ate.
Non tra1ate Tra1ate
[Gα(i) ] / proteine totali
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Verifica che i livelli di cAMP prodo1o dalle cellule esprimen( il costru1o sia minore dei livelli di cAMP delle cellule non trasdo1e
• Lisi delle cellule
• Verifica dei livelli di cAMP tramite “cAMP assay”
Non tra1ate Tra1ate
Livelli di cAMP
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Verifica che i livelli di PDE prodo1o dalle cellule trasdo1e sia maggiore dei livelli di PDE delle cellule non trasdo1e
Non tra1ate Tra1ate
Livelli di PDE
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Verifica che i trascriW up-‐regola( nelle cellule malate risul(no a livelli normali nelle cellule tra1ate
1. Estrazione RNA da cellule SANE, MALATE, NON TRATTATE e TRATTATE 2. Produzione dei cDNA corrisponden( 3. U(lizzo di primer specifici per amplificare i trascriW
Non tra1ate Tra1ate
Livelli dei trascriW
Non tra1ate Tra1ate
Quan(ficazione tramite qRT-‐PCR
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Controllo dell’espressione a livello genomico per verificare che l’over-‐espressione della proteina Gα(i) non abbia deregolato pathway cellulari
NON tra1ata Tra1ata
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PASSAGGIO IN VIVO: TOPO
1. Espianto dei progenitori ossei da sogge1o malato. 2. Trasduzione delle cellule tramite len(virus. 3. Trapianto subcutaneo dei progenitori ossei tra1a( .
• Verifica dell’EFFICIENZA del costru1o tramite ripe(zione di tuW i test effe1ua( in vitro
• Verifica della PERSISTENZA del nostro costru1o nel tessuto.
Una persistenza di qualche giorno renderebbe inuRle la terapia (vista anche la difficoltà e l’invasività dei rimpian( dei precursori ossei tra1a( e la giovane età di mol( pazien()
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PROBABILE INIZIO DI UN TRIAL CLINICO
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• Len(viral Vector Produc(on Kit necessario conta1are il fornitore
• Kit cAMP assay circa 500 euro
• Kit PDE assay circa 500 euro
• Kit ELISA circa 350 euro
• Kit Microarray circa 400 euro
• An(corpi an( TUB circa 350 euro
• An(corpi an( HA circa 350 euro
• MACCHINARI e STABULARI diverse migliaia di euro
• S(pendi dei ricercatori pochissime cen(naia di euro
• Aiu( o richieste di materiale ad altri laboratori contribuirebbero ad abbassare i cos(
Cos( della ricerca
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LE IDEE SCARTATE
1. Inserimento nelle cellule malate di un trascri1o an( Gα (s) M per bloccarne la traduzione
APPROCCIO GIA’ TENTATO
2. Sos(tuzione dell’esone mutato con esone normale tramite ricombinazione omologa
TROPPO INEFFICIENTE
3. Silenziamento totale dell’esone mutato tramite un an(senso, e fornitura della subunità normale dall’esterno PERICOLOSO &
INEFFICIENTE
4. Fornire esogenamente la subunità Gα(s) normale, che per compe(zione avrebbe fa1o produrre meno Proteine G mutate
INEFFICIENTE
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GRAZIE PER L’ATTENZIONE