LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas
Departamento de Genética
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Análise da Diversidade Molecular em Bactérias Fitopatogênicas
Aluna: Carla de Freitas MunhozOrientadora: Profa. Dra. Maria Lucia Carneiro Vieira
Sumário
Origem da diversidade molecular em bactérias
fitopatogênicas;
Finalidades dos estudos sobre essa diversidade;
Técnicas moleculares mais utilizadas;
Aplicações.
Variação genética:
pré requisito para a evolução biológica.
As bactérias surgiram no nosso planeta há 3,8 bilhões de anos:
• Grande diversidade de formas de vida;
• Capacidade de viverem sob diferentes condições ambientais:
- Ambientes extremos com diferentes composições químicas, pH, temperatura.
Procariontes: maior grau de adaptação e maior plasticidade fenotípica.
Capacidade de adaptação:
• Devido a existência de diversas rotas
metabólicas.
Bactérias fitopatogênicas são capazes de se
adaptarem a:
• Diferentes condições climáticas;
• Diversos estádios fenológicos do hospedeiro;
• Defensivos usados em seu controle.
Em bactérias, três
estratégias contribuem
para a geração de
variantes genéticos:
Em bactérias, três
estratégias contribuem
para a geração de
variantes genéticos:
*Mutações: importantes na geração da diversidade de populações bacterianas.
1 – Pequenas mudanças pontuais na seqüência de nucleotídeos do genoma
Mutações espontâneas: uma em cada 108 eventos.
Genes/patogenicidade: resposta da planta resistente/susceptível.
Substituição de nucleotídeos;
Deleções e inserções de 1 ou poucos nucleotídeos.
Distinguir e classificar isolados.
Relacionar distribuição geográfica com
heterogeneidade do patógeno.
Gerar de informações que auxiliem em estudos
fitopatológicos.
Proceder estudos taxonômicos.
Auxiliar no controle de doenças.
-Mensurar a quantidade de diversidade
genética dentro de uma população;
-Estabelecer relações filogenéticas dentro
e entre subpopulações;
-Proceder a subdivisão da variação.
Entender a história evolutiva da espécie.
-Conduzir à seleção e posicionamento de genes de
resistência da planta.
Estudar a estrutura de populações de patógenos.
Métodos de avaliação
Antes da década de 80:
� Marcadores morfológicos;
� Estudos patológicos;
� Estudos bioquímicos;
� Aloenzimas.
Nas últimas décadas:
� Permitiram maior precisão na avaliação da diversidade genética.
� Disponibilidade de várias técnicas de marcadores moleculares.
Métodos de avaliação
Elementos repetitivos do genoma bacteriano.
Identificados primeiro em enterobactérias (E. coli e S. typhimurium).
Motivos geneticamente estáveis;
Diferem quanto ao número de cópias e localização no cromossomo.
Rep-PCR
Arranjo único devido a sua história evolutiva.
Geram fingerprints genômicos.
Distinguem diferentes patovares de uma espécie.
3 “famílias” / construção de primers:
REP – Repetitive Extragenic Palindromic (35-40pb)
ERIC – Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (124-129pb)
BOX Elemento (154pb)
Louws et al, 1994
Rep Box Eric
PCR / Eletroforese em gel de agarose 1,4%.
Técnica simples / Fácil execução / Discriminativa.
RFLP
(Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
Baseada em:
restrição enzimática e hibridização de sonda de DNA.
Detecta polimorfismo intra-patovar.
Distingue patovares;
Busca fragmentos específicos de DNA em amostras
de composição complexa.
Altamente reprodutível.
1 – Extração de DNA e quantificação;
2 – Digestão enzimática do DNA com uma ou mais enzimas;
3 – Separação de fragmentos por eletroforese em gel de agarose;
5 –Hibridização com sonda marcada;
6 -Lavagens;
7 – Auto-radiografia.
4 – Montagem do Blot, transferência do DNA para membrana e fixação do DNA;
Sondas:
-Região intergênica 16S-23S;
-Gene de patogenicidade;
-Fragmentos de DNA conhecidos;
-Fragmentos de RAPD.
Sonda: plasmídeorecombinante P2
contendo fragmentos de DNA repetitivos.
Sonda: fragmento de RAPD.
Khoodoo e Jaufeerally-Fakim, 2004.
Barak e Gilbertson, 2002.
PFGE (Pulsed-field gel eletrophoresis)
Baseada em restrição do DNA
com enzimas de corte raro e
eletroforese em gel de campo
pulsado.
Caracterização de patovares.
Gera fingerprints: poucos fragmentos / grande comprimento.
Permite a separação de grandes
moléculas de DNA por eletroforese.
Campo pulsado:
A direção do campo elétrico muda periodicamente
forçando a reorientação das moléculas.
Eletroforese em gel de agarose (1%):
•10 a 15°C / sem interrupção da energia.
Limitações:
-exige experiência na sua
aplicação;
-é dispendiosa e demorada;
-exige equipamentos
específicos.
Staphylococcus aureus digerido com a enzima SmaI. www.medscape.com/viewarticle/414413_3
Staphylococcus aureus (linhagem R6)
digerido com a enzima SmaI.Borer at al, 2002.
ITS (Internal transcribed spacer)
Região bastante variável entre diferentes isolados.
Distinção de patovares.
Cubero e Graham, 2002
Seqüenciamento da região intergência 16S-23S.
PCR com primers que amplificam a região intergênica.
O produto da PCR é seqüenciado.
Alinhamento das seqüências.
Comparação base de dados do GenBank.
Fingerprints patovar específicos.
AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphism)
Combina restrição enzimática e PCR;
Géis de alta resolução;
Eletroforese em gel de poliacrilamida;
Ampla cobertura do genoma;
Munhoz e Weiss (dados não publicados)
(A) Dupla digestão com enzimas de restrição EcoRI e MseI
DNA genômico total
< 0,04%
~10,0%
~90,0%
Fragmentos de restrição
(B) Ligação dos adaptadores específicos dos sítios de restrição
A A T T GC
Adaptador EcoRI
AATTCG
TT A A
Adaptador MseI
GTC A
(C) Amplificação para seleção de fragmentos
(com nucleotídeo seletivo em cada iniciador)
G T A A G
Fragmento amplificado
G A A T T GT AATTC CTC A T
CC A T T
A A T T GGA
A A T T GGA
CC A T T
G T A ATC A T
N G A A T T GAATTC CN
Iniciador EcoRI+A
Iniciador MseI+C1
Fragmentos não amplificados
TC A TG T A A
CC A T T
A
TC A TG T A A
CC A T T
T
TC A TG T A A
CC A T T
C
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
*Utiliza-se altas concentrações de Mg++ para diminuir a estringênciado anelamento;
PCR com primer randômico de 10 nucleotídeos;
Gera fingerprint patovar específico.
Eletroforese em gel de agarose;
Munhoz et al., 2006.
Cada técnica molecular apresenta um tipo de polimorfismo, dependendo da região do
genoma a qual ela revela.
Assessment of genetic diversity of Xanthomonas campestris pv. campestris isolates from Israel by
various DNA fingerprinting techniques
A.Valverdeab, T. Huberta, A. Stolova, A. Dagara, J. Kopelowitzc and S. Burdmana*
aDepartment of Plant Pathology and Microbiology, Faculty of Agricultural, Food and Environmental Quality Sciences, Hebrew University of Jerusalem, PO Box 12, Rehovot 76100, Israel; bDepartment of Vegetal Production, IRNASA-CSIC, Salamanca 37008, Spain; and c Savyon Diagnostics Ltd, 3 Habosem St, Ashdod 77610, Israel.
Plant Pathology (2007) 56, 17–25.
Analisar a diversidade genética entre 22 isolados de X. campestris
pv. campestris:
-Israel e outras localizações;
-6 raças conhecidas;
Comparar a capacidade de detecção de 3 técnicas moleculares:
-PFGE, AFLP e Rep-PCR;
-Calcular o coeficiente de similaridade entre os isolados;
-Gerar dendograma.
Objetivos
Estabelecer relação entre os perfis moleculares e patogenicidade.
Enzima SpeI apropriada para fingerprint do patógeno;
Boa reprodutibilidade;
Boa resolução:
Fragmentos de 40 a 340 Kb;-12 a 21 bandas;
11 grupos;
Padrão diferente para cada grupo.
Resultados
PFGE
Boa reprodutibilidade;
Gerou de 25 a 33 fragmentos variando entre 100 e 500pb;
Padrão único para todos os isolados;
12 grupos;
Concordância com dos dados de PFGE.(SM75/Israel)
AFLP
Rep-PCR
Padrão de fingerprint complexo: 29 a 41 bandas / 200 e 3000pb;
Pequena variação na reprodutibilidade;
Formação de 13 grupos (B100);
Distribuição dos isolados de acordo com AFLP e PFGE.
Teste de patogenicidade
Inicialmente: todos os isolados mostraram-se patogênicos.
Diferença de patogenicidade entre isolados com mesmo perfil
molecular.
Diversidade dentro do patovar maior que a previamente estimada.
Alta correlação entre Rep-PCR e AFLP.
Formação de vários grupos:
-diferentes locais de coleta / alta diversidade entre os israelenses.
Conclusões
Isolados B100 (Itália) e HR11279A (UK) foram agrupados com isolados de Israel: devido a disseminação ou adaptabilidade.
Vários isolados com fingerprint único: adaptação.
Afiliação de raças não pode ser inferida por fingerprint de DNA.
PFGE e AFLP: reprodutibilidade;
Rep-PCR: rápido, barato, discriminativo.
Genetic Diversity of Pierce’s Disease Strains and
Other Pathotypes of Xylella fastidiosa
Mavis Hendson,1† Alexander H. Purcell,1* Deqiao Chen,1 Chris
Smart,2‡ Magalie Guilhabert,2 and Bruce Kirkpatrick2
Division of Insect Biology, University of California, Berkeley, California 94720-3112,1 and
Department of Plant Pathology, University of California, Davis, California 956162
Applied and Environmental Microbiology, Feb. 2001, p. 895–903. Vol. 67, No. 2
Comparação com isolados de X. fastidiosa do Sudeste dos Estados Unidos, causadores de doença em videira, pessegueiro, ameixeira e carvalho.
Objetivos
Análise da relação genética entre isolados de X. fastidiosada Califórnia coletados em videira, amendoeira e oleander.
Utilização das técnicas RAPD, Rep-PCR, PFGE e ITS.
Análise da região intergênica 16S-23S (ITS)
Seqüenciamento de fragmentos com 500 bases contendo a ITS;
A análise das seqüências resultou em 4 grupos;
Isolados oriundos do mesmo hospedeiro apresentaram seqüências idênticas.
Rep-PCR
Todos os isolados da Califórnia apresentaram mesmo perfil.
Resultados
Perfil de Eric-PCR: 1-Uva/Georgia, 2-Uva/Flórida, 3-Uva/California, 4-Maple/Califórnia, 5-
Uva/Califórnia, 6, 7 e 8-Amêndoa, 9-Ladder 1Kb, 10-Carvalho/Flórida, 11-Carvalho/Georgia, 12 e
13-Oleander, 14 ctr. -
A-Amêndoa
G-Uva
M-Maple
O-Carvalho
Ol-Oleander
P-Pêssego
Pl-Ameixa
RAPD
Testados 20
oligonucleotídeos;
10 primers geraram
fingerprints complexos;
-Distinção de isolados
de diferentes
hospedeiros.
PFGE
Enzimas NotI e SpeI
produziram fragmentos
adequados para
comparação entre
isolados;
*Agrupamentos
obtidos pelas três
técnicas foram
concordantes.
A-Amêndoa
G-Uva
M-Maple
O-Carvalho
Ol-Oleander
P-Pêssego
Pl-Ameixa
Variação revelada por RAPD sugere que:
-Isolados “PD” evoluíram nos últimos 130 anos ou
-Isolados geneticamente diferentes foram introduzidos ou
-Alguns isolados são nativos da América do Norte;
Todas as análises genéticas produziram mesmo agrupamento
de associação a hospedeiros de X. fastidiosa;
Isolados mais costeiros são mais parecidas entre si do que com os
do sul ou centro da Califórnia (maiores estudos).
RAPD e PFGE revelaram maior grau de diversidade genética;
Conclusões
Estudos de hibridização DNA-DNA podem confirmar se os grupos representam espécies distintas;
Resultados sugerem diferenciação taxonômica (patovar):-Vários isolados tem habilidade de infectar hospedeiros diferentes e causar doenças.
Estudos com isolados de outros hospedeiros – CVC – podem esclarecer as diferenças encontradas;
Baixa variabilidade na região intergênica mostra que os isolados são filogeneticamente proximamente relacionados;
A avaliação preliminar da diversidade genética
de bactérias fitopatogênicas pode auxiliar nos estudos
taxonômicos, epidemiológicos e de detecção, bem
como ajudar na criação de programas de pesquisa
visando obter variedades resistentes.
Considerações finais