Download - Proiect Listeria
UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE ȘI
MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII
Masterat “Biotehnologii şi siguranța alimentară”, anul I
Temă: Tehnici clasice si moderne de detectie in alimente
pentru Listeria
Disciplină: Metode moderne de detectare a patogenilor și a microorganismelor
modificate genetic (OMG) din alimente
Coordonator: Student:
Conf. Dr. Florentina Matei Barbu Emilia Nicoleta
-BUCUREȘTI-
2013
Cuprins
Introducere..................................................................................................................................3Genul Listeria-Taxonomie..........................................................................................................4Habitat.........................................................................................................................................6Izolarea si identificarea...............................................................................................................6Metode de izolare, identificare si determinare cantitativa a speciei Listeria monocytogenes in produsele alimentare...................................................................................................................7
Metode bacteriologice........................................................................................................................7
Procedeul FDA...................................................................................................................................7
Procedeul USDA-FSIS.......................................................................................................................8
Procedeul NGFIS...............................................................................................................................8
Metodologia de izolare utilizata in tara noastra........................................................................9Detectarea celulelor bacteriene listeria afectate de diferiti factori stresanti la un nivel subletal...................................................................................................................................................11
Metode biochimice...........................................................................................................................13
Metode imunochimice......................................................................................................................14
Metode imunofizice.........................................................................................................................15
Testul imuno-latex............................................................................................................................15
Metode imunofizice..................................................................................................................16Flow-citometria................................................................................................................................16
Imunocaptarea.................................................................................................................................17
Metode fizice....................................................................................................................................18
Impedansmetria................................................................................................................................18
Metode de biologie moleculara........................................................................................................18
Hibridarea cu sonde nucleare...........................................................................................................18
2
Introducere
Listeria spp. este destul de răspândit în natură, fie ca germen saprofit, epifit, fie ca
patogen, atât în mediile naturale cât și în organismul animalelor și al omului. În condiții
prielnice de temperatură și umiditate, germenul poate supraviețui mult timp în sol, ape, gunoi
de grajd, furaje și plante, iar în anumite împrejurări dispune de capacitatea de a se înmulți în
aceste medii, [Weis, J.et al., 1995].
În afară de om, marea majoritate a speciilor de mamifere, păsări domestice și sălbatice
sunt receptive la infecia listerică, [Sergeant, E.S.et al., 1991]
Impactul actual a listeriozei umane nu este pe deplin cunoscut, deoarece în cele mai
multe țări este o boală nedeclarabilă. Factorii de risc în listerioză sunt factori care nu par a
avea o implicare singulară și directă în producerea bolii. Astfel s-a demonstrat că pentru
apariția bolii este necesară asocierea mai multor factori de risc. Orice factor de risc
suplimentar poate crește sansele de producere a bolii, dar nu este obligatoriu să se ajungă la
listerioză, [Jensen, A., et. al., 1995].
3
Genul Listeria-Taxonomie
Genul Listeria cuprinde bacili gram pozitivi, cu dimensiuni cuprinse intre 0,4-0,5
micrometri diametru si 0,5-25 micrometri lungime, cu capetele rotunjite, neramificati, dispusi
in palisade sau in lanturi. Sunt mobili (prezentand in acest sens un numar de 1-5 cili
peritrichi), nesporulati, facultativ anaerobi. Cresc pe medii complexe, in limite largi de
temperatura (3-42‚°C) si in prezenta umor concentratii mari de NaCl (10-12%). Sunt catalazo-
pozitivi, oxidazo-negativi, fermenteaza glucoza cu producere de gaz.
În acest gen sunt incluse 8 specii:
Listeria monocytogenes
Listeria ivanovii
Listeria innocua
Listeria welshimeri
Listeria seeligeri
Listeria grayi
Listeria murrayi
Listeria denitrificans.
Comitetul International de Sistematica Bacteriana-Subcomitetul de Taxonomie pentru
Listeria, în 1992, la Copenhaga, a stabilit pentru genul Listeria 6 specii si 2 subspecii:
Listeria monocytogenes
Listeria innocua
Listeria ivanovii cu doua subspecii:-ivanovii
-londoniensis
Listeria seeligeri
Listeria welshimeri
Listeria grayi.
În editia a-9-a din 1994 a “Bergey’s Manual of Determinated Bacteriology”, sunt
incluse 7 specii:
Listeria monocytogenes
4
Listeria innocua
Listeria ivanovii
Listeria seeligeri
Listeria welshimeri
Listeria grayi
Listeria murrayi.
În prezent Listeria denitrificans a fost exclusa din acest gen si reclasificata ca Jonesia
denitrificans, iar Listeria grayi si Listeria murrayi pe baza studiilor de hibridare ADN/ARN
facute de Stuart si Welshimer în 1974, sunt suficient de distincte de Listeria monocytogenes,
pentru a forma un gen separat “Murraya” cu doua subspecii:
Murraya grayi subsp.grayi
Murraya grayi subsp.murrayi.
Unii specialisti considera ca genul Listeria este format din 4 specii, Listeria
monocytogenes fiind considerata ca un un grup heterogen care contine tulpini patogene dar si
apatogene. Asa, Listeria innocua este considerata varianta nehemolitica si apatogena a
Listeriei monocytogenes, iar Listeria seeligeri si Listeria welshimeri au fost scoase un timp
din genul Listeria ca fiind apatogene, dar recent s-a demonstrat ca Listeria seeligeri poate
determina meningita purulenta chiar si la persoanele imunocompetente.
5
Habitat
Este prezentă peste tot în natură: la nivelul solului,plantelor, animalelor şi omului.
Infectează animale domestice (mai ales ovine) şi sălbatice, păsări, reptile, peşti,crustacee.
Poate fi izolată din alimente, cu precădere din brânzeturi. Studii mai recente au evidentiat
prezenta L. monocytogenes in alimentele crude sau insuficient preparate termic, de tipul
carnii, produselor din carne, pestilor, crustaceilor, legumelor (ridichi, castraveti), produselor
lactate.
Izolarea si identificarea
Înainte de jumătatea anilor 1980, ˮîmbogățirea la rece ˮ, bazată pe capacitatea Listeriei
de a depăși prin creștere la temperaturi scăzute germenii competitivi, a fost utilizată în
principal pentru izolarea selectivă. Totuși datorită lipsei de specificitate a acestei metode și a
faptului că este lenta (unii cercetători au incubat bulion pana la 6 luni), procedeurile au fost
mult mai îmbunătățite. Ai fost dezvoltate medii care utilizeaza diversi agenti selectivi,
incluzand acriflavina, clorura de litiu, colistin, acid nalixidric, cicloheximida si polimixina.
Aceste metode au largit capacitatea laboratoarelor de microbiologie (in special a celor
implicate in controlul alimentelor) de a izola selectiv Listeria.
Pentru detectarea listeriilor in alimente sunt din ce in ce mai mult utilizate hibridizarea
acizilor nucleici si testele imunoenzimatice.
6
Metode de izolare, identificare si determinare cantitativa a speciei Listeria monocytogenes in produsele alimentare
Metode bacteriologice
Majoritatea procedeelor de izolare si îmbogatire selectiva pentru detectarea speciei
Listeria monocytogenes se bazeaza pe rezistenta acestei bacterii la anumiti agenti selectivi
care inhiba dezvoltarea florei de asociatie.
Agentii selectivi cel mai frecvent utilizati în prepararea mediilor de îmbogatire
selectiva includ : acriflavina, acidul nalidixic, clorura de litiu, feniletanolul, moxalactamul si
altii .
Procedeele de detectare a acestei specii bacteriene în produsele alimentare sau în
spatiile de prelucrare a alimentelor, cele mai raspândite sunt cele recomandate de USDA -
FSIS (US Departament of Agriculture - Food Safety Inspection Service) pentru detectarea
speciei Listeria monocytogenes în carne si produsele din carne si de FDA (Food and Drug
Administration), în lapte si produsele lactate.
Procedeul FDA
Acest procedeu implica o îmbogatire initiala a 25g sau 25ml de proba în 225ml LEB
(Listeria enrichment broth). LEB contine TSB la care se adauga 0,6% extract de drojdie,
50mg cicloheximida, 15mg acriflavina si 40mg acid nalidixic /litru.
Probele se incubeaza la 30°C/24-48h, o modificare a procedeului original care cere o
îmbogatire de 1-7 zile la 30oC. Urmeaza transplantarea de pe LEB pe mediile: Oxford si LPM
(lithium chloride phenylethanol moxalactam), ambele medii înlocuiesc agarul Mc Bride
modificat (MMA), recomandat initial ca mediu selectiv de izolare. Mediile se incubeaza la
35°C/48h apoi coloniile trebuie confirmate ca apartin speciei Listeria monocytogenes. Testele
de confirmare includ examinarea coloniilor alb-bleo în lumina oblica la 45o, mobilitatea,
catalaza, hemoliza pe agarul cu sânge, testul CAMP, rosu-metil, Voges Proskauer, fermentarea
7
manitolului, xilozei si ramnozei .
Procedeul FDA a fost conceput, în mod special pentru optimizarea izolarii speciei
Listeria monocytogenes în lapte si produsele lactate.
Procedeul USDA-FSIS
Procedeul de îmbogatire selectiva USDA-FSIS pentru izolarea speciei Listeria
monocytogenes din carne, a fost dezvoltat de Mc Clain and Lee (25). Ulterior, acest procedeu
a fost utilizat cu succes si pentru produsele lactate si probele de mediu.
De asemenea, acest protocol include o îmbogatire initala a 25ml sau 25g proba în
225ml mediu LEB 1, care înlocuieste bulionul initial de îmbogatire UVM (University of
Vermont Medium).
Bulionul de îmbogatire primara LEB 1 contine pe litru: 5g proteoza- peptona, 5g
triptona, 5g Leb Lemco, 5g extract de drojdie, 20g clorura de sodiu, 12g fosfat disodic - 7-
hidratat, 1,35 fosfat monobazic de potasiu, 1g esculina, 20g acid nalidixic, 1,2mg acriflavina.
Urmeaza incubarea la 30°C/20-24h. Apoi 0,1ml mediu de îmbogatire primara se
transfera în 10ml bulion de îmbogatire secundara Fraser si se incubeaza la 35oC/ 24h si 40h.
Bulionul de îmbogatire secundara Fraser, contine pe litru: 52g UVM, 3g clorura de
litiu, 25mg acriflavina si 0,5g citrat feric de amoniu.
Se incubeaza la 35°C/24-48h, dupa care probele se trec pe agar Oxford
modificat(MOX), care se incubeaza la 35°C/24h si se examineaza coloniile tipice de Listeria.
Hidroliza esculinei si reactia ulterioara cu citratul feric de amoniu, determina producerea unui
precipitat negru în jurul coloniilor de Listeria pe agarul MOX. Coloniile tipice sunt
transplantate pe agar cu 5% sânge de cal. Coloniile transparente, betahemolitice sunt
transplantate în bulion BHI, care se incubeaza peste noapte la 35oC si se efectueaza testele de
confirmare prezentate la procedeul FDA.
Procedeul NGFIS
O metoda larg raspândita în Europa, pentru detectarea speciei Listeria monocytogenes
în alimente este metoda NGFIS, recomandata de Netherland Goverment Food Inspection
Service, elaborata de Van Netten si col.
8
Acesti autori au raportat o sensibilitate superioara a acestei metode, fata de procedeul
USDA, când se urmareste detectarea speciei Listeria monocytogenes din alimente în care se
afla sub nivelul de 10CFU/ml.
În procedeul NGFIS, pentru îmbogatirea selectiva se utilizeaza bulionul L-
PALCAMY, cu incubare la 30oC/24-48h, apoi cultura se trece pe agar PALCAM.
Bulionul de îmbogatire selectiva L-PALCAMY contine la litru de apa distilata: 23g
peptona Oxoid, 5g extract de drojdie, 5g Lab Lemco, 5g lapte peptonizat Oxoid, 5g Na Cl, 5g
D-manitol, 0,8g esculina, 0,5g citrat feric de amoniu, 80mg rosu fenol, 100000UI polimixina
B, 5mg acriflavina, 10g clorura de litiu, 30mg ceftazidime, moxalactam si 25ml emulsie de
galbenus de ou.
Agarul PALCAM contine la litrul de apa distilata: 39g agar Columbia, 0,5g D-glucoza,
10g D-manitol, 0,8g esculina, 0,5g citrat feric de amoniu, 80mg rosu fenol, 100000UI
polimixina B, 5mg acriflavina, 15g clorura de litiu si 20mg ceftazidime sau moxalactam.
Numeroase studii au urmarit compararea diferitelor procedee de izolare a speciei
Listeria monocytogenes din produsele alimentare. Doyle and Schoeni(21), au comparat
procedeul FDA, cu metoda de îmbogatire la rece (Gray) si cu un procedeu propriu de
îmbogatire selectiva, SEP, (selective enrichment procedure). S-a urmarit izolarea prin aceste
procedee a speciei Listeria monocytogenes dintr-un lot de brânza "soft ripened" contaminat.
Prezenta bacteriei a fost confirmata, în 41 din 90 de probe examinate. Prin procedeul de
îmbogatire la rece, prezenta bacteriei a fost detectata în 21 probe, în timp ce prin procedeul
FDA, numai în 16 probe.
În cadrul unui studiu al CDC, asupra factorilor de risc alimentari pentru listerioza
sporadica, în perioada noiembrie 1988, decembrie 1990, Hayes si col., au condus un studiu
comparativ al celor 3 procedee microbiologice de izolare a bacteriei din 899 probe de
alimente. Sensibilitatea de detectare pentru fiecare metoda a fost: 65% pentru procedeul FDA,
74% pentru procedeele USDA si NGFIS. Folosind o combinatie a ultimelor doua procedee,
sensibilitatea de detectare a crescut la 90%. Pe baza acestor rezultate CDC a adoptat
utilizarea simultana a metodelor USDA si NGFIS pentru izolarea acestei bacterii din
alimente .
Metodologia de izolare utilizata in tara noastra
9
În tara nostra, se utilizeaza o metodologie de izolare si identificare a speciei Listeria
monocytogenes din produsele alimentare de origine animala, în care sunt incluse 3 metode de
izolare: USDA, TERPLAN si MERCK.
Procedeul USDA a fost prezentat anterior.
Metoda TERPLAN utilizeaza 4 medii de cultura si anume: un bulion de îmbogatire,
agarul Oxford, mediile TSA si TSB.
Bulionul de îmbogatire contine acid nalidixic, hidroxid de potasiu, triptona, peptona,
dextroza, fosfat dipotasic, extract de drojdie si apa distilata. Mediul TSA este un agar cu
triptona din soia, iar mediul TSB este un bulion cu triptona din soia si extract de drojdie.
Proba însamântata în bulionul de îmbogatire se incubeaza 48h la 30oC, dupa care se
fac strieri pe agarul Oxford. Incubarea se realizeaza în aceleasi conditii. Coloniile
caracteristice pentru Listeria spp. sunt mici, înconjurate de un halou negru, 3-5 astfel de
colonii se transplanteaza în mediile TSA si TSB.
Metoda MERCK utilizeaza un bulion de îmbogatire si agarul MERCK.
Bulionul de îmbogatire contine: triptona, glucoza, clorura de sodiu, tiocianat de
potasiu, tiamina si tripaflavina în apa distilata. Agarul MERCK contine: triptona, glucoza,
clorura de sodiu, tiamina, tripaflavina, acid nalidixic, agar si apa distilata.
Proba se însamânteaza în bulionul de îmbogatire, se incubeaza 48h, la 30oC, apoi se
fac strieri pe agarul MERCK. Se incubeaza în aceleasi conditii si 3-5 colonii caracteristice
(mici cu centrul galben-verzui si periferia transparenta usor verde- albastruie), se
transplanteaza în bulion si agar nutritiv.
În continuare se executa testele pentru identificare din care amintim: mobilitatea,
reactia catalazei, reactia oxidazei, fermentarea glucidelor, testul de hemoliza si testul CAMP.
Dupa ce bacteria izolata a fost identificata ca Listeria monocytogenes, urmeaza serotipizarea
tulpinii respective. Datorita faptului ca majoritatea cazurilor de listerioza la om sunt
determinate de trei serotipuri (1/2a, 1/2b si 4b), serotipizarea are o importanta minora în
investigatiile epidemiologice. Numeroase metode de subtipizare au fost utilizate în decursul
timpului: tipizarea fagica, tipizarea izoenzimatica (prin MEE-multilocus enzyme
electrophoresis), ribotipizarea (utilizand Ribosomal DNA fingerprinting), tipizarea plasmidica
si tipizarea în functie de monocinele sintetizate de tulpinile de Listeria monocytogenes [13].
În ultimul timp, pentru detectarea acestei specii bacteriene în produsele alimentare au
fost utilizate o serie de metode rapide care utilizeaza ELISA, flow citometria, sau amprente
AND. Însa aceste metode sunt conditionate de necesitatea îmbogatirii probei la un nivel
10
minim detectabil de 105-106 Listeria/ml.
Toate aceste procedee mentionate anterior, conventionale sau rapide, folosesc medii de
îmbogatire înalt selective, care faciliteaza dezvoltarea bacteriilor din genul Listeria, în pofida
florei de asociatie. Totusi aceste medii selective nu permit detectarea celulelor bacteriene care
au fost afectate de caldura, frig sau substante chimice, însa la un nivel subletal si care ar putea
exista în diferite alimente, sau spatiile tehnologice de obtinere a acestora.
Detectarea celulelor bacteriene listeria afectate de diferiti factori stresanti la un nivel subletal
Stresul provoaca modificari în structura macromoleculara si organizarea celulei
bacteriene. Modificarea proteinelor este de o importanta majora datorita implicarii lor în
metabolismul microorganismului respectiv.
Efectul diferitilor factori de stres (temperatura joasa: 4oC si ridicata: 49oC, valori
extreme de pH :4 si 9,5 precum si diversi factori chimici: detergenti-SDS 0,015%, deoxicolat
0,3% si etanol 5%) asupra profilului proteic la Listeria monocytogenes a fost studiat de
Gormon and Phan-Thanh în anul 1994 [36]. Autorii au observat ca stresul a represat sinteza a
50% din proteinele sintetizate de aceasta bacterie în conditii normale si a indus sinteza unor
proteine noi specifice de stres. Fiecare factor de stres a determinat sinteza unui set de proteine
specifice, totusi au existat si proteine comune sintetizate în prezenta unor factori diferiti. Mai
mult decât atât, acelasi factor a indus sinteza unui singur tip de proteina la 2 specii diferite:
Listeria monocytogenes si Listeria innocua ceea ce demonstreaza ca bacterii înrudite pot
dezvolta strategii similare, daca nu identice, în raspunsul fata de acelasi factor de stres.
Specia Listeria monocytogenes ar putea fi afectata în timpul prelucrarii produselor
alimentare de factori ca: încalzirea, congelarea, uscarea, iradierea, sau expunerea la diferiti
agenti chimici (dezinfectante, conservanti, acizi). Toate procedeele de detectare curenta, cu
exceptia îmbogatirii la rece, implica îmbogatirea selectiva. Tehnica de îmbogatire la rece nu
se poate utiliza însa în analizele de rutina datorita timpului îndelungat (aproape 2 luni) necesar
pentru îmbogatire.
Metodologia curenta subestimeaza însa numarul real de bacterii prezent într-un
produs, datorita neglijarii celulelor bacteriene stresate subletal. Numeroase studii au testat
diferiti compusi (acriflavina, polimixina, feniletanolul) care intra în compozitia mediilor
11
selective si s-a constatat ca acestia inhiba dezvoltarea bacteriilor afectate (stresate) termic.
Studiul factorilor nutritivi care au indus regenerarea listeriilor afectate termic a fost
facut de Busch and Donnely care au constatat ca: Glucoza, lactoza, sucroza, extractul de
drojdie, piruvatul, magneziul si fierul au determinat regenerarea bacteriilor din speciile
Listeria monocytogenes si Listeria innocua afectate de caldura. A fost formulat un mediu de
cultura lichid de regenerare/îmbogatire, care include acesti compusi. Acest mediu, LRB
( Listeria repair broth ), a permis completa revitalizare a celulelor bacteriene afectate, în timp
de 5h la 37oC. LRB contine pe litrul de apa distilata: 30g TSB, 5g glucoza, 6g extract de
drojdie, 4,94g sulfat de magneziu, 0,3g sulfat feros, 10g acid piruvic, 8,5g MOPS-free acid si
13,7g MOPS sare de sodiu. Dupa regenerare, agentii selectivi: acriflavina, acidul nalidixic si
cicloheximida se adauga la LRB în aceleasi concentratii cu cele din bulioanele utilizate de
procedeele USDA si FDA. Comparând eficacitatea LRB de a induce regenerarea/ îmbogatirea
bacteriilor din genul Listeria afectate termic, cu cea a altor medii, s-a observat ca bulioanele
de îmbogatire FDA si UVM nu au indus revitalizarea. Populatiile de Listeria, în mediile de
îmbogatire selectiva dupa 24h incubare, au fost cuprinse între 1,7 x 108 si 9,1 x 108
UFC/ml, comparativ cu populatiile în LRB de 2,5 x 1011- 8,2 x 1011 UFC/ml.
Totodata a fost studiata rezistenta listeriei la conditiile de congelare. Golden si col.[32]
au comparat gradul de afectare a 4 tulpini de Listeria monocytogenes, supuse congelarii la -
18oC, timp de 7 si 14 zile. Procentul de afectare a oscilat între 72 si 80%. El-Kest and Marth
[24] au observat un procent de afectare de 65% si 55% mortalitate, dupa mentinere în tampon
fosfat, la 18oC, 24h. Glicerolul în concentratie de 2 si 4% a asigurat protejarea bacteriilor în
timpul congelarii. Palumbo and Williams au utilizat diferite medii pentru a determina
cantitativ Listeria monocytogenes (afectate sau nu), în diferite produse congelate si a aratat ca
pH-ul produsului a influentat gradul de afectare în timpul stocarii prelungite la - 18oC.
De asemenea a fost examinat modul de revitalizare a bacteriilor din specia Listeria
monocytogenes, afectate de congelare si diferite substante dezinfectante, în LRB. Budo-
Amoako si col. au observat ca bacteriile afectate termic (5 min. la 60oC) si prin congelare (7
zile la -20°C), s-au regenerat în 6-8 h în TSB cu 0,6 % extract de drojdie (TSBYE) la 35oC,
dar si-au pierdut capacitatea de regenerare în LEB.
Procentul de afectare/mortalitate al speciei Listeria monocytogenes au influentat tipul
si concentratia dezinfectantelor, timpul de expunere si procedeul de îmbogatire. Mediul LRB
a permis revitalizarea bacteriilor afectate de actiunea substantelor dezinfectante, pe când
12
UVM ( University of Vermont Medium) nu a indus regenerarea acestora.
Crowford si col. au aratat ca în lapte, Listeria monocytogenes afectata termic, prin
încalzire la 71,7oC si-a pierdut capacitatea de regenerare în timpul stocarii la 4oC/28 zile.
Donnely a studiat capacitatea speciilor Listeria monocytogenes si Listeria innocua afectate
termic de regenerare în laptele pasteurizat. Capacitatea de regenerare a fost puternic
influentata de temperatura. La 4oC, regenerarea a fost initiata dupa 8-10 zile si a fost
completa dupa 16-19zile. În schimb, la 10oC regenerarea a fost initiata imediat si a fost
completa dupa 4 zile. La 26 si la 37oC regenerarea s-a produs dupa 13h si respectiv 9h.
Diferentele între rezultatele obtinute de Crowford si Meyer reflecta temperaturile diferite
utilizate pentru afectarea termica a bacteriilor. Temperatura ridicata folosita de Crowford a
indus afectarea grava, ireversibila a germenilor .
Produse (cum ar fi laptele), care permit regenerarea bacteriilor afectate, asociate cu
nedetectarea germenilor în aceste alimente ar putea avea consecinte semnificative asupra
sanatatii consumatorilor, mai ales daca se au în vedere studiile lui Mc Carthy care au
demonstrat ca germenii din specia Listeria monocytogenes, stresati termic dupa regenerare, au
fost la fel de patogeni ca înainte de afectarea termica.
Metode biochimice
Metodele biochimice se bazeaza pe sisteme biochimice miniaturale cu ajutorul carora
sunt testate tulpinile izolate pe mediile selective.
SISTEMUL API LISTERIA (Bio Merieux, Mary LaEtoile, France) se bazeaza pe
investigarea a zece caractere biochimice într-un sistem microtest, iar rezultatele se
obtin în 24h.
MONO CONFIRM TEST (AES Laboratoire, Combourg, France) este o
micrometoda bazata pe determinarea a patru caractere biochimice care permit
confirmarea genului Listeria si identificarea speciei Listeria monocytogenes.
Evidentierea enzimei D-aminopeptidaza, permite diferentierea tulpinilor de
Listeria monocytogenes în 24 h de alte specii de Listeria.
13
MICROBACT 12L (Rhone-Diagnostic-Lyon-France) este o coloana de identificare
compusa din 11 teste de fermentare a glucidelor si un test de hemoliza. Rezultatele
sunt obtinute în 6-24 ore.
Metode imunochimice
Aceste metode se bazeaza pe recunoasterea antigenului Listeria cu ajutorul
anticorpilor specifici anti-Listeria si mai recent anti-Listeria monocytogenes. Complexul
antigen-anticorp este pus în evidenta printr-o reactie chimica de culoare sau prin fluorescenta.
Aceste metode au o sensibilitate de 105-106 bacterii/ml, ceea ce necesita o îmbogatire
prealabila, de obicei în doua etape (în bulion de îmbogatire). Caracteristicele unor metode
imunochimice sunt prezentate în tabelul 1.
TABEL 1
Caracteristicile unor metode imunochimice pentru detectare Listeria
METODA KIT LISTERIA LISTERIA TEK VIDAS
Tehnica Elisa tip sandwich Elisa tip sandwich ELFA (Enzime Linked
Fluorescent Assay)
Specificitate Listeria spp. Listeria spp. Listeria spp. Listeria
monocit.
Îmbogatire 2-3 zile 2 zile 2 zile 2 zile
Sensibilitate
(UFC/ml)
7x10 10 10 5x10
Rapiditate 1,5h 1,5h 45min. 1,1h
Tehnica de
evidentiere
Colorimetrie (Ac.
cuplati cu
peroxidaza)
Colorimetrie (Ac.
cuplati cu
peroxidaza)
Florimetrie
(Ac. cuplati cu
fosfataza
alcalina)
Florimetrie
(Ac. cuplati cu
fosfataza
alcalina)
14
Sistemul VIDAS permite detectarea Listeria spp. sau Listeria monocytogenes prin
tehnica ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay).
Dupa o dubla îmbogatire în bulionul Fraser, proba este depusa într-un cartus al
sistemului automat. Prin aspirarea probei cu ajutorul unui un con sensibilizat cu anticorpi
monoclonali se asigura fixarea specifica a germenilor din genul Listeria. Complexul antigen-
anticorp este pus în contact cu anticorpi marcati cu fosfataza alcalina, iar ansamblul este
evidentiat cu un substrat al acestei enzime ( 4-metil-umbeliferil-fosfat), prin determinarea
intensitatii fluorescentei la 450 nm.
Metode imunofizice
Aceste metode au la baza formarea complexului antigen-anticorp care este evidentiat
cu ajutorul unei tehnici fizice. Principalele metode sunt prezentate în tabelul 1.
Testul imuno-latex
KIT-ul Listeria Rapid Test (Unipath,Dardilly, France) este un test imunologic realizat
pe o placa ce contine anticorpi monoclonali anti antigenul flagelar B-Listeria, dispusi sub
forma de banda. Proba, dupa o dubla îmbogatire în bulion Fraser si LEB tamponat, este
depusa pe suportul absorbant al placii, care contine particule de latex bleo sensibilizate cu
anticorpi. Prezenta în proba a germenilor din genul Listeria va induce formarea de complexe
antigen-anticorp, cu anticorpii fixati pe particulele de latex. Aceste complexe vor migra prin
capilaritate, de-a lungul suportului pâna vor întâlni anticorpii monoclonali dispusi sub forma
de banda. Datorita imobilizarii complexelor produse, se formeaza o banda de coloare albastra,
în cazul reactiei pozitive.
Principalele avantaje ale acestei tehnici sunt: ergonomia, simplitatea de aplicare si
rapiditatea de interpretare.
Ca si în cazul metodelor ELISA si ELFA, sensibilitatea intrinseca a acestui kit nu
15
permite întotdeauna detectarea rapida a bacteriilor stresate, care se multiplica foarte lent.
TABEL 2
Metode imunofizice
METODA FLOW
CITOMETRY
IMUNO-LATEX IMUNOCAPTARE
Detectare Calitativa Calitativa Listeria
Rapid Test
Cantitativa
Lister Test
Calitativa
Lister Screen
Specificitate Listeria spp. Listeria spp. Listeria spp. Listeria spp.
Sensibilitate
intrinseca
(UFC/ml)
1 1
Îmbogatire 24h 42h fara 18h
Rapiditate* 26h 43h 27h** 42-66h
Sistem de
detectare Fluorescenta
Imobilizarea
complexelor Ag/Ac-
latex
Etalare pe
geloza dot-
blot
Etalare pe
geloza
PALCAM
* Fara confirmarea rezultatelor
**Cu confirmarea coloniilor prin dot-blot.
16
Flow-citometria
Aceasta metoda permite detectarea unei populatii bacteriene marcate, în mediu lichid.
Dupa o îmbogatire selectiva în bulion LEB, ADN-ul bacterian este colorat cu iodura
de propidium, apoi celulele bacteriene din genul Listeria, sunt marcate cu anticorpi specifici
cuplati cu izotiocianat de fluoresceina. În faza urmatoare, proba este expusa unui fascicul de
raze laser si se realizeaza interpretarea. Celulele bacteriene sunt caracterizate în functie de
morfologie, antigenele de suprafata si continutul în ADN.
Flow-citometria are o sensibilitate intrinseca de 106-107 Listeria monocytogenes/ml,
iar cu o faza de îmbogatire de 24h, contaminarea minima detectabila este de 102 Listeria
monocytogenes/ml. Tehnica este aplicabila si pe probe de consistenta solida, daca examinarea
se executa în bulion de îmbogatire
Imunocaptarea
Imunocaptarea este o metoda originala care permite detectarea si concentrarea
germenilor din genul Listeria existenti într-o proba. Bacteriile sunt captate cu ajutorul
anticorpilor policlonali fixati pe bile magnetice microscopice. Complexele Listeria-imunobile
sunt captate sub actiunea câmpului magnetic, apoi imunobilele sunt spalate, iar complexele
Listeria-anticorpi policlonali sunt evidentiate prin diferite metode. În combinatie cu separarea
imunomagnetica sunt utilizate numeroase sisteme rapide de detectare pentru Listeria: ELISA,
PCR, dot-blot, hibridare etc. Cea mai folosita metoda consta în etalarea imunobilelor pe agar
selectiv, ulterior coloniile caracteristice sunt supuse confirmarii.
Aceasta metoda prezinta avantajul ca permite concentrarea germenilor din genul
Listeria, existenti într-o proba. Datorita utilizarii unui numar mare de imunobile magnetice,
sensibilitatea metodei este foarte mare (1 bacterie/ml.).
Din punct de vedere comercial imunobilele VICAM (Watertown SUA) sunt distribuite
sub forma a doua chituri:
Lister Screen
17
Lister TestTM .
Lister Screen este o metoda calitativa, combinând imunocaptarea cu
etalarea pe agar selectiv PALCAM, totodata este o metoda foarte sensibila (0,5-1UFC/ml.) si
specifica, prezentând avantajul ca permite decelarea bacteriilor stresate din alimente.
Lister TestTM permite o analiza cantitativa a germenilor din genul
Listeria dintr-un produs alimentar sau o proba de mediu. Dupa etapa de imunocaptare
imunobilele sunt etalate pe agar selectiv cu ceftazidima si acid nalidixic. Coloniile
caracteristice sunt supuse confirmarii prin tehnica dot-blot, cu anticorpi monoclonali.
Complexele imune sunt apoi puse în evidenta printr-o reactie enzimatica.
Metoda MIPA (Magnetic Immuno PCR Assay) combina imunocaptarea cu detectarea
prin PCR (poymerase chain reaction). Prin imunocaptare, pe lânga concentrarea germenilor se
asigura si eliminarea unor inhibitori ai polimerizarii, prezenti în unele produse alimentare.
Timpul necesar obtinerii rezultatelor este de 55h.
Metode fizice
Impedansmetria
Aceasta metoda se bazeaza pe determinarea variatiilor electrice dintr-un mediu de
cultura, datorate metabolismului microbian. În cultura obtinuta în bulion se aplica 2 electrozi
care vor înregistra variatia impedantei în urma dezvoltarii culturii. Tehnica poate fi utilizata si
pentru determinarea numarului de germeni si prezinta o serie de avantaje: rapiditatea de
detectare (24h), automatizare, economie de medii si manopera. Totusi, detectarea este dificila
atunci când probele sunt puternic contaminate si impune utilizarea unor medii înalt selective.
Metode de biologie moleculara
18
Tehnicile de biologie moleculara permit detectarea secifica a germenilor din genul
Listeria, sau chiar a speciei Listeria monocytogenes cu ajutorul unor sonde nucleare a caror
tinte sunt localizate pe ADN sau ARN. Totodata sunt metode deosebit de specifice care
asigura detectarea inclusiv a tulpinilor atipice. Dupa utilizarea sondelor nucleare constituite
spre exemplu dintr-un fragment a genei care codifica listeriolizina O, [58], au fost sintetizate
oligonucleotide pentru detectarea bacteriei fie prin hibridare cu o sonda, fie prin tehnica PCR
cu ,,amorse".
Hibridarea cu sonde nucleare
Tehnicile de hibridare a acizilor nucleici se bazeaza pe capacitatea catenelor
complementare de ADN sau ARN de legare specifica si de a forma complexe stabile dublu
catenare. Pentru detectarea speciei Listeria monocytogenes prin hibridare nucleara, se
utilizeaza 2 sonde specifice de ARN ribozomal 16S (Metoda Gene Track sau AccuProbe).
Aceste metode necesita o faza de îmbogatire prealabila indiferent de sonda utilizata (Tabel 3).
TABEL 3
Metode de hibridare cu sonde comerciale pentru detectare Listeria
METODA GENE-TRACK ACCUPROBE TM
Specificitate Listeria spp. sau L.m. L. monocytogenes
Îmbogatire 24h 24-48h*
Sensibilitate
(UFC/ml)
5x104 106
Rapiditate 30 min. 2h 30min
Sistem de evidentiere Colorimetrie (Reactie
imuno-enzimatica)
Luminiscenta
(ester de acridinium)
19
*În caz de rezultat negativ se aplica o îmbogatire secundara.
Kit-ul Accuprobe TM(Gen-Probe sau Diego, USA) permite detectarea specifica a
speciei Listeria monocytogenes dupa îmbogatire si etalare pe geloza. Apoi celulele bacteriene
sunt lizate pentru a elibera ARN-ul ribozomal, iar hibridarea se realizeaza cu o sonda de ADN
monocatenar marcata cu ester de acridinium. Hibrizii sunt detectati prin luminiscenta
(cantitatea de lumina este direct proportionala cu cantitatea de ARN ribozomal).
Bibliografie1. CRAWFORD R.G., BELIVEAU C.M., PEELER J.T., DONNELY C. W. and
BUNNING V.K. (1989). Comparative recovery of uninjured and heat-injured Listeria monocytogenes cells from bovine milk. Appl. Environ. Microbiol. 55, 1490-1494.
2. DESTRO M.T., J.M. FARBER (1996) Use of molecular typing methodes to trace the dissemination of Listeria monocytogenesin a shrimp processing plant., Appl. Envir. Microb., 62, 2, 705-711.
3. DONNELY C.W. and BAIGENT G.J. (1986). Method for flow cytometric detection of Listeria monocytogenes in milk. Appl. Environ. Microbiol. 52:689-695.
20
4. BUDO-AMOAKO E., TOORA S., ABLETT R. and SMITH J. (1992). Evaluation of the ability of primary selective enrichment to resuscitate heat-injured and freeze injured Listeria monocytogenes cells. Appl. Environ. Mi-crobiol. 58, 3177-3179.
5. DOYLE M.P., L.M. MESKE and E.H. MARTH. (1985) Survival of Listeria monocytogenes during manufacture and storage of nonfat dry milk. J. Food Prot. 48, 740-742.
6. EL-KEST S.E. and MARTH E.H. (1992). Freezing of L.monocytogenes and other microorganism: A review. J. Food Prot. 55, 579-582
7. GOLDEN D.A. BEUCHAT L.R. and BRACKETT R.E. (1988). Inactivation and injury Listeria monocytogenes as affected by heating and freezing. Food Microbiol. 5, 17-23.
8. HUI Y.H., RICHARD GORHAM J., MURRELL K.D. and DEAN O. CLIVER. (1994). Foodborne Disease Handbook , Marcel Dekker, N.Y.
9. MEYER D.H. and DONNELLY C.W. (1992) - Effect of incubation temperature on repair of heat-injured Listeria in milk, J. Food Prot., 55, 579-582.
10.PALUMBO S.A. and WILLIAMS A.C. (1991). Resistance of Listeria monocytogenes to freezing in foods. Food Microbiol. 8, 63-68.
11.Mc CARTHY S.A. (1991). Pathogenicity of nonstressed , heat-stressed and resuscitatea Listeria monocytogenes 1A1 cells. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2389-2391.
12.THOMAS L.V. and J.W.T. WIMPENNY (1996) Investigation of the effect of combined variations in temperature, pH and NaCl concentration on nisin inhibition of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus., Appl. Envir.Microb., 62, 2, 2006-2012.
13.WALKER S.J., ARCHER P. and BANKS J.G. (1990). Growth of Listeria monocytogenes of refrigeration temperatures. J. Appl. Bacteriol. 68, 157-162.
14.BEUMER R.R. (1996)-Listeria spp. in domestic environments., Epidem. and Inf., 117, 3, 429- 437.
15. BAYLES D.O., B. A. ANNES and B.J. WILLKINSON (1996), Appl. Eviron Microb., 62, 3, 1116-1119.
16.Alexandru T.Bogdan, Iulian Țogoe, Gheorghe Câmpeanu ș.a, Microbiologia alimentelor-volumul I- Patogeni alimentari, Editura Ascelepius, Bucuresti, 2011.
17. Bărzoi D., Apostu S. – Microbiologia produselor alimentare, Ed. Risoprint, ClujNapoca, 2002, p. 150-155.
18. Bourgeois CM., Mescle J.F., Zucca J. - Microbiologie alimentaire, Aspect microbiologique de la sécurité et de la qualité des aliments, Tec et Doc Lavoisier, Paris, 1996.
19. Bradshaw J.G., Peeler J.T., Twedt R.M. - Thermal resistance of Listeria sp.in milk, I. Food Prot., 54, 1991, p. 12-14.
21