1
2
3
Proizvodnja poliklonskih protutijela
-pripravci protutijela utječu i na specifičnost metoda i na njihovu osjetljivost
-specifičnost metode?
-osjetljivost metode?
-izbor vrste za proizvodnu protutijela ovisi i o količini antigena na raspolaganju i o željenoj
količini antiseruma
4
Svojstva imunogena
•različitost od vlastitog
•molekularna masa
•kemijski sastav i heterogenost
•podložnost preradi (procesiranju) i prikazivanju (prezentaciji)
Svojstva biološkog sustava
•genotip imunizirane životinje
•adjuvanti
•doza imunogena i način unošenja (nekoliko imunizacija u razmacima –
hiperimuni serumi (visoka konc. specifičnih protutijela)
• male neimunogenične
molekule (steroidi, lijekovi ..)
se konjugiraju na nosače
5
AFINITETNA KROMATOGRAFIJA
HETEROGENI ANTISERUMI
-razlikuju se od jedne do druge životinje
-sadrže nepoželjna nespecifična i križno-
reagirajuća protutijela
-odstranjivanje protutijela neželjenih
specifičnosti iz poliklonskih preparacija
protutijela je dugotrajno, rezultira velikim
gubitkom željenih protutijela i nije dovoljno
učinkovito u reduciranju heterogenosti
antiseruma
-direktna biokemijska purifikacija
monoklonskih protutijela iz poliklonskog
antiseruma nije moguća !!!
6 POLIKLONSKI ANTISERUM MONOKLONSKA PROTUTIJELA
7
Proizvodnja monoklonskih protutijela tehnikom hibridoma
-1975. Köler i Milstein (Nobelova nagrada 1984.)
-fuzionirali normalne B stanice (plazma stanice) s mieloma stanicama --- hibridne stanice (HIBRIDOMA)
-hibridoma stanice neograničeno se uzgajaju u kulturi stanica i luče protutijela
Kultura stanica
-primarne limfatičke stanice (dobivene izolacijom limfocita iz krvi, limfe ili limfatičkih organa) mogu se
propagirati samo određeno, ograničeno vrijeme
-stanične linije (nastale od tumorskih stanica, ili stanica transformiranih kancerogenima ili virusima) mogu
se propagirati neograničeno u kulturi stanica
• 1. stanična linija dobivena 1940. - mišja L stanica fibroblasta
• 1950.-tih HeLa stanica - humani cervikalni tumor
• do danas je uspostavljeno na stotine staničnih linija
-hibridne stanice (hibridom – klon stanica nastalih proliferacijom fuzioniranih stanica, imortalizirane stanične
linije)
8
Priprema hibridnih staničnih linija (hibridoma)
stanice mijeloma
9
http://highered.mheducation.com/olc/dl/120110/micro43.swf
VIDEO: Monoclonal Antibody Production (McGraw-Hill)
10
Hipoksantin Aminopterin Timidin medij
11
Hipoksantin Aminopterin Timidin medij
12
AMINOPTERIN (antifolatna tvar, inhibitor sinteze purina)
Hipoksantin Aminopterin Timidin medij
13 HGPRT – hipoksantin-guanin fosforibozil transferaza
TK – timidin kinaza
Hipoksantin Aminopterin Timidin medij
Pričuvni put sinteze purina i timidilata
AMINOPTERIN (antifolatna tvar, inhibitor sinteze purina)
14
Hipoksantin Aminopterin Timidin medij
Pričuvni put sinteze purina i timidilata
TK – timidin kinaza HGPRT – hipoksantin-guanin fosforibozil transferaza
AMINOPTERIN (antifolatna tvar, inhibitor sinteze purina)
Mieloma stanice: HGPRT- / TK-
15
Hipoksantin Aminopterin Timidin medij
16
Alternativi pristupi – “zamjena”
PROIZVODNJA MONOKLONSKIH PROTUTIJELA
17
Upotreba monoklonskih protutijela
-identifikacija fenotipskih markera koji su jedinstveni za određene tipove stanica – moderna klasifikacija
limfocita i ostalih leukocita prema vezanju monoklonskih protutijela koja su specifična za određene
populacije stanica (CD markeri – clusters of differentiation)
-imunodijagnostika – dijagnosticiranje sistemskih i infektivnih bolesti
-funkcionalna analiza molekula na površini stanica ili izlučenih iz stanica
-dijagnosticiranje tumora – tumor-specifična monoklonska protutijela u detekciji tumora
-imunoterapija tumora in vivo
-injiciranje pacijentima monoklonska protutijela u dijagnostičke ili terapijske svrhe - PROBLEMI!
KOJI PROBLEMI?
18
Ljudski organizam prepoznaje mišja protutijela kao strana – dolazi do anti-izotipskog odgovora – HAMA
odgovori (human antimouse antibody)
vrlo brzo se odstrane mišja protutijela iz krvotoka čovjeka i time se smanji njihova terapeutska
učinkovitost
cirkulirajući imuni kompleksi mogu uzrokovati alergijske reakcije, pa čak i po život opasne reakcije
(nakupljanje u bubrezima)
HUMANA MONOKLONSKA PROTUTIJELA
• upotreba tehnike hibridoma za proizvodnju humanih monoklonskih protutijela – mnogi tehnički problemi,
veliki izazov
(pokušavaju se razviti ljudske mieloma stanične linije kao fuzijski partneri s karakteristikama imortalnog rasta, osjetljivosti
na HAT selekciju i izostanak proizvodnje vlastitih protutijela; jer ljudske B stanice ne tvore učinkovito hibridome s
mišjim mielomskim staničnim linijama)
• alternativne metode stvaranja protutijela – pomoću rekombinantne tehnologije DNA - TEHNIKE
GENETIČKOG INŽENJERSTVA
19
KIMERNO MIŠJE-
LJUDSKO
PROTUTIJELO
-mišje varijabilne
domene
-ljudske
konstantne
domene
HUMANIZIRANO
PROTUTIJELO
-mišje CDR-ove
-ostatak molekule
je ljudski
-uvelike smanjio
problem anti-
izotipskog
odgovora (HAMA
odgovora)
20
21 http://www.kyowa-kirin.co.jp/antibody/english/about_antibody/history.html
KYOWA Hakko Kirin Co., Ltd.
22
23
Transgenični miševi (Ig knockout, HAC transgenični)
sadrži sve lokuse koji kodiraju teške lance i λ lance ljudi