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1
Quantitative DC-AuswertungQuantitative DC-Auswertung
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2
Strahlengang im TLC Scanner 3Strahlengang im TLC Scanner 3
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3
Lichtstreuung in der SchichtLichtstreuung in der Schicht
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4
StartStart PeakPeak11
PeakPeak22
PeakPeak33
Abs
orpt
ion
[AE]
Laufstrecke [mm]
FrontFront
zF
Das Planar-ChromatogrammDas Planar-Chromatogramm
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5
1. Schritt: Spektrenmessung1. Schritt: Spektrenmessung
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6
1. Schritt: Spektrenmessung1. Schritt: Spektrenmessung
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7
SpaltscanSpaltscan
Auflösung steigt mit:Auflösung steigt mit:Anzahl der Messpunkte pro Längeneinheit, d. h. mit der Schrittweite (gerätespezifisch)abnehmender Breite des Lichtstrahls aber dadurch: verringerte Intensität des Mess-Signals
Spaltdimension:Spaltdimension:Spaltlänge:Spaltlänge:
Band: 50 – 75 %Punkt: 120 %
Spaltbreite:Spaltbreite:je grösser, umso mehr Lichtintensität
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8
SpaltgrösseSpaltgrösse -- zu zu grossgross??????
Kleineres Mess-Signal, da
bei Absorptionsmessung:nicht mit Substanz belegte Schichtreflektiert und erniedrigt das Mess-Signal
bei Fluoreszenzmessung:nicht fluoreszierende Schicht erniedrigt das
Mess-Signal
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9
in Lösungenin Lösungen auf DCauf DC--Schichten (Reflexion)Schichten (Reflexion)
d
II
II00
E =E = εε ** c c ** ddE ~ cE ~ c
dI
II00 RRdd
R R0
(1 (1 -- RR∞∞))22 αα2 R2 R∞∞ pp== ** cc
α Absorptionskoeffizientp StreukoeffizientR∞ absolute Remission (d = ∞)
KubelkaKubelka--MunkMunk--FunktionFunktion
Vorrausetzung: Vorrausetzung: d = d = ∞∞; ; RR00 = 0; keine gerichtete Reflexion, = 0; keine gerichtete Reflexion, dpdp < 1 mm< 1 mm
Quantitative BestimmungQuantitative Bestimmung
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10
Kalibrationskurve AbsorptionsmessungKalibrationskurve Absorptionsmessung
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11
Vorraussetzung: Vorraussetzung: streng monochromatisches Erregerlicht, kleine Konzentrationen
Vorteile: Vorteile: hohe Empfindlichkeit und Selektivität, weiter linearer Bereich
IIflfl = = k` k` ** II00 * * εε ** c c ** ddmessbare Fluoreszenzintensitätmessbare Fluoreszenzintensität
substanzsubstanz-- & gerätecharakteristischer Faktor& gerätecharakteristischer Faktor
Intensität des AnregungslichtesIntensität des Anregungslichtes
KonzentrationKonzentration
FluoreszenzmessungFluoreszenzmessung
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12
Kalibrationskurve FluoreszenzmessungKalibrationskurve Fluoreszenzmessung
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13
FluoreszenzmessungFluoreszenzmessung
Substanzen mit starrem MolekülbauFluorophor
Aromatische SystemeVerbindungen mit konjugierten
DoppelbindungenCarbonylverbindungenKondensierte Heterocyclen
Substanzen mit starrem MolekülbauFluorophor
Aromatische SystemeVerbindungen mit konjugierten
DoppelbindungenCarbonylverbindungenKondensierte Heterocyclen
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14Reagenzien zur Reagenzien zur FluoreszenzFluoreszenz--DerivatisierungDerivatisierung (Auswahl)(Auswahl)
Amine: Amine: DansylDansyl--ClCl, , NBDNBD--ClCl, FITC, OPA + 2, FITC, OPA + 2--Mercaptoethanol. Mercaptoethanol. IsothiocyanatoacridinIsothiocyanatoacridin, , FluorescaminFluorescamin, , PyridoxalPyridoxalAlkohole: Alkohole: NaphthylisocyanatNaphthylisocyanatCarbonsäurenCarbonsäuren: : BrBr--MmcMmc + Dibenzo+ Dibenzo--1818--KroneKrone--66Ketone, Ketone, AldehydeAldehyde, reduzierende Zucker: , reduzierende Zucker: DansylDansyl--hydrazinhydrazin
Lit.: Frey, Zieloff, Qual. und quant. DC, VCH Lit.: Frey, Zieloff, Qual. und quant. DC, VCH 19931993
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15
ungleichmässigeungleichmässige SubstanzverteilungSubstanzverteilung
Lichtstreuung verlängert den optischen Weg Lichtstreuung verlängert den optischen Weg in der Schichtin der Schicht
GrundlinienverlaufGrundlinienverlauf
Besonderheiten der Besonderheiten der Absorptionsmessung in RemissionAbsorptionsmessung in Remission
(1 (1 -- RR∞∞))22
2 R2 R∞∞~ c~ cRR∞∞ ~ c ;~ c ;
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16
Substanzverteilung nach Substanzverteilung nach RimmerRimmer
bei Rbei RFF = 0,55= 0,55
250 250 -- 200 200 μμm:m: 30 %30 %
200 200 -- 150 150 μμm:m: 21 %21 %150 150 -- 100 100 μμm:m: 20 %20 %100 100 -- 50 50 μμm:m: 15 %15 %
50 50 -- 0 0 μμm:m: 14 %14 %
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17
Grundlinie einer leeren SpurGrundlinie einer leeren Spur
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18
Strahlengang - ZweiwellenlängenmessungStrahlengang - Zweiwellenlängenmessung
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19
Ergebnis der ZweiwellenlängenmessungErgebnis der Zweiwellenlängenmessung
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20
ZweiwellenlängenmessungZweiwellenlängenmessung
2 Wellenlängen auf derselben Bahn2 Wellenlängen auf derselben Bahn:
1 Monochromator: sukzessiv
Wellenlänge maximaler Absorption
minus Wellenlänge minimaler
Absorption
2 Bahnen mit gleicher Wellenlänge:2 Bahnen mit gleicher Wellenlänge:
Probenbahn minus Leerbahn
(zwischen zwei Probenbahnen)
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21
![Page 22: QQuantitative DC-AuswertungQuantitative DC-Auswertungpapa-gey.de/kolloquien/2010-13.pdf · 2 Wellenlängen auf derselben Bahn:2 Wellenlängen auf derselben Bahn 1 Monochromator: sukzessiv](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050715/5d4bd3da88c993d34e8bc2af/html5/thumbnails/22.jpg)
Analyse von Fehlerquellen in der DCAnalyse von Fehlerquellen in der DC
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23 Fehler in der quantitativen DC
![Page 24: QQuantitative DC-AuswertungQuantitative DC-Auswertungpapa-gey.de/kolloquien/2010-13.pdf · 2 Wellenlängen auf derselben Bahn:2 Wellenlängen auf derselben Bahn 1 Monochromator: sukzessiv](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050715/5d4bd3da88c993d34e8bc2af/html5/thumbnails/24.jpg)
24Quellen des systematischen Fehlers
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25
Anforderungen an StandardsubstanzenAnforderungen an Standardsubstanzen
Definierte ReinheitVorrat genügender HomogenitätStabilitätGeeignete VerpackungLagerungsbedingungenBedarfsgerechte Packungsgrößen
Definierte ReinheitVorrat genügender HomogenitätStabilitätGeeignete VerpackungLagerungsbedingungenBedarfsgerechte Packungsgrößen
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26
Quellen der zufälligen FehlerQuellen der zufälligen Fehler
Quellen des zufälligen Fehlers
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27 Richtigkeit und Präzision
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Wann DC einsetzen ?
• Wenn die Anzahl der zu trennenden Substanzen nicht größer als 15, bzw. 40 bei AMD-Entwicklung ist
• Wenn Proben nebeneinander, nicht nacheinander analysiert werden sollen
• Wenn polare Matrix vorhanden ist, die bei einer Säulenchromatographie stört
• Wenn verschiedene Detektionsmöglichkeiten eingesetzt werden sollen
• Wenn ein hoher Probendurchsatz anfällt
Wenn Zeit und Kosten gespart werden sollen(nach Kaiser entstehen 20% der Kosten einer HPLC-Analyse)
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Möglichkeiten der modernen Planar-Chromatographie
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Wann DC einsetzen ?
• Wenn die Anzahl der zu trennenden Substanzen nicht größer als 15, bzw. 40 bei AMD-Entwicklung ist
• Wenn Proben nebeneinander, nicht nacheinander analysiert werden sollen
• Wenn polare Matrix vorhanden ist, die bei einer Säulenchromatographie stört
• Wenn verschiedene Detektionsmöglichkeiten eingesetzt werden sollen
• Wenn ein hoher Probendurchsatz anfällt
Wenn Zeit und Kosten gespart werden sollen(nach Kaiser entstehen 20% der Kosten einer HPLC-Analyse)
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Typische Aufgaben
• Qualitativ – Identifizierung– Verwechslung, Verfälschung
• Halbquantitativ– Rohstoffauswahl– In-Prozess-Kontrolle, Stabilitätsuntersuchungen,
Chargenkonformität
• Quantitative – Gehaltsbestimmung von Markern
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Die DC-Platte als multipler Informationsträger
alle Informationen aus einer Platte aus einer einmaligen Probenauftragung
Identität Reinheit Stabilität
Fingerprint Quantifizierung
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Schwerpunkt Identifizierung von Pflanzen
• Definition der Identität
– Biologisch / (genetisch) / chemisch• Referenzmaterial
– Biologisch, RBRM, chemisch• Natürliche Variabilität und chemische Rassen
• Verwechslung / Verfälschung
• DC - Methoden
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Botanische ID vs. HPTLCBotanische ID
• HochqualifiziertesPersonal
• Nur intakte Pflanzen(teile)
• Einzelpflanzen• Name • Positive Identität• Bleibt bestehen
HPTLC• Grundkenntnisse
Analytik• Universell geeignet
– Intakte Pflanzen(teile)– Pulver– Extrakte
• Mischproben• Fingerprint• Qualitative Identität• Kann sich ändern
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Echinacea Arten
E. purpurea Wurzel
E. angustifolia Wurzel
Wurzelpulver
Botanicals
?
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Echinacea – Identifizierung von Rohdrogen
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Analyse von Fertigprodukten
1 2 3
1 2 3Wur
zel
Kra
ut
Früc
hte
Produkt 1 Produkt 2 Produkt 3 Echinacea purpurea Kraut
Echinacea purpurea Wurzel 400 mg
Echinacea purpurea Blüten 360 mg Hydrastis canadensis Wurzel 125 mg
3
Goldsiegel
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Einzelpflanze vs. Mischprobe
Mis
chpr
obe
mit
Per
iplo
ca
Eleutherococcus senticosus
6 Einzelpflanzen Per
iplo
ca
Mis
chpr
obe
Mehrfachdetektion 1: UV 254 nm
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Einzelpflanze vs. Mischprobe
Mis
chpr
obe
mit
Per
iplo
ca
Eleutherococcus senticosus
6 Einzepflanzen Per
iplo
ca
Mis
chpr
obe
Mehrfachdetektion 2: UV 366 nm
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Einzelpflanze vs. Mischprobe
Mis
chpr
obe
mit
Per
iplo
ca
Eleutherococcus senticosus
6 Einzelproben Per
iplo
ca
Mis
chpr
obe
Mehrfachdetektion 3: Schwefelsäurereagenz
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Stabilität des HPTLC fingerprints?
Extraktion04/2004
Extraktion 01/2005Extraktion04/2004
Extraktion 01/2005
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Natürliche Variabilität
Black Cohosh, Cimicifuga racemosa
Yellow Cohosh, Cimicifuga americana
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Verschiedene “Cohosh”- Arten (Botanical Liasons)
1: Actein, 2: Cimiracemosid A, 3: Isoferulasäure, 4: Cimicifugin, 5: Cimicifugosid, 6: Kaffeesäure7: Actea racemosa (Black Cohosh root), 8: A. podocarpa (Yellow C. root), 9: A.pacypoda (White C. root)10: A. pacypoda (White C. leaves), 11: Caulophyllum thalictroides (Blue C. root)
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Chemische Rassen - Ashwaganda (Withania somnifera)
a) UV 254 nmb) Schwefelsäure, Weisslichtc) Schwfelsäure, UV 366 nm
Typ 1Typ 2Typ 3
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Identitätsprüfung Stephania tetrandra
Tetra
ndrin
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Andere betroffene Spezies
• Guang fangji, Fangji, Han fangji, Fen fangji, Mu fangji
• Guan mutong, Mutong, Bei mutong, Chuan mutong, Xiao mutong
• Qing muxiang, Muxiang, Guang muxiang, Chuan muxiang
• Xixin, Liao xixin, Bei xixin, Hua xixin
• Aristolochia fangji, Stephania tetrandra, Cocculus sp.
• Aristolochia manshuriensis, Akebia trifoliata, Clematis armandi
• Aristolochia debilis, Saussurea costus(Aucklandia lappa), Vladimiria soulei
• Asarum heterotropoides, Asarum sieboldii
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Verfälschung von Stephania mit Aristolochia
Aristolochia fangji1 und 10 μL
Stephania tetrandraverunreinigt mitAristolochia fangji10 und 1%, 10 μL
Stephaniatetrandra10 μL
Aristolochiasäurenmix 10 und 50 ng
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Unterscheidung: Roter Pfeffer -Paprika
Carotenoides
Paprika Roter PfefferCapsaicin
Paprika Roter Pfeffer
Cap
saic
in
Hot Pk
Flavonoide
Paprika Roter Pfeffer
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DC - Methoden aus der Literatur
Oft:
• Alt und basierend auf veralteter Methodik
• Zu komplex
• Nicht optimiert
• Nicht validiert, aber verwendet, wie validiert
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Beispiel - Johanniskraut
Ph.Eur.3 Suppl. 2000 * Ameisensäure-Wasser-Ethylacetat (6:9:90)DAC 86 Suppl. 3 Toluen-Ethylformat-Ameisensäure (50:40:10)DAC 1999 Ameisensäure-Wasser-Ethylacetat (6:8:86)USP 24 / NF 19 Ameisensäure-Wasser-Ethylacetat-Eisessig
(11:26:100:11)
Apothekenger.Prüfvorschr. Toluen-Ethylacetat-Ameisensäure (50:40:10)Pachaly (TLC Atlas) Ameisensäure-Wasser-Ethylacetat (10:5:85)CAMAG Ameisensäure-Wasser-Ethylacetat (2:1:20)EM Science* Ethylacetat-Dichlormethan-Eisessig-
Ameisensäure-Wasser (100:25:10:10:11)Zeller AG* Toluen-Ethylformat-Ameisensäure (50:20:5)
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Beispiel - Johanniskraut
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Optimierte Methode (EM Science)
• Reproduzierbar
• Gute Selektivität
• Stabilität von
– Probe
– Hypericin
– Mobiler Phase
Ethylacetat-Dichlormethan-Eisessig-Ameisensäure-Wasser (100:25:10:10:11)
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Schwerpunkt
Halbquantitative Vergleiche
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Rohstoffkonformität durch industriellen Anbau
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Produktkonformität -Mönchspfefferextrakt
![Page 56: QQuantitative DC-AuswertungQuantitative DC-Auswertungpapa-gey.de/kolloquien/2010-13.pdf · 2 Wellenlängen auf derselben Bahn:2 Wellenlängen auf derselben Bahn 1 Monochromator: sukzessiv](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050715/5d4bd3da88c993d34e8bc2af/html5/thumbnails/56.jpg)
Stabilitätstest
• Reproduzierbare (validierte) Methode
• Stabilität des Analyten
• Spezifizät
• Stresstest
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Stabilität im chromatographischenSystem
2D Chromatogramm von Angelica sinensis.
Links: Bildung von Artefakten (Pfeile), Rechts: Der Analyt ist stabil.
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2D- Chromatographie: Vitex agnuscastus
Flavonoide Diterpene Iridoide
![Page 59: QQuantitative DC-AuswertungQuantitative DC-Auswertungpapa-gey.de/kolloquien/2010-13.pdf · 2 Wellenlängen auf derselben Bahn:2 Wellenlängen auf derselben Bahn 1 Monochromator: sukzessiv](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050715/5d4bd3da88c993d34e8bc2af/html5/thumbnails/59.jpg)
Derivatization of iridoids with dimethylaminobenzaldehydereagent
Stabilität der Detektion
Derivatization of flavonoids with Natural Products reagent
Derivatisierung der Diterpene mitSchwefelsäurereagenz
![Page 60: QQuantitative DC-AuswertungQuantitative DC-Auswertungpapa-gey.de/kolloquien/2010-13.pdf · 2 Wellenlängen auf derselben Bahn:2 Wellenlängen auf derselben Bahn 1 Monochromator: sukzessiv](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050715/5d4bd3da88c993d34e8bc2af/html5/thumbnails/60.jpg)
Stresstest
![Page 61: QQuantitative DC-AuswertungQuantitative DC-Auswertungpapa-gey.de/kolloquien/2010-13.pdf · 2 Wellenlängen auf derselben Bahn:2 Wellenlängen auf derselben Bahn 1 Monochromator: sukzessiv](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050715/5d4bd3da88c993d34e8bc2af/html5/thumbnails/61.jpg)
Resultate für Iridoide
Con
trol
Lig
ht
Tri
fluor
acet
ic a
cid
Die
thyl
am
ine
Hea
t (di
ss.
extr
act)
Oxy
gen
Hea
t (dr
y ex
trac
t)
Con
trol
Ligh
t
HC
l
NH
3
H2O
2
Hea
t(dr
yex
trac
t)
Air
Hea
t(di
ss.
extr
act)
Die
thyl
am
ine
TFA
Auc
ubin
Agn
usid
e
![Page 62: QQuantitative DC-AuswertungQuantitative DC-Auswertungpapa-gey.de/kolloquien/2010-13.pdf · 2 Wellenlängen auf derselben Bahn:2 Wellenlängen auf derselben Bahn 1 Monochromator: sukzessiv](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050715/5d4bd3da88c993d34e8bc2af/html5/thumbnails/62.jpg)
Resultate: Iridoide
Densitometrie bei 576 nm
Kontrolle TFA (20 h)
![Page 63: QQuantitative DC-AuswertungQuantitative DC-Auswertungpapa-gey.de/kolloquien/2010-13.pdf · 2 Wellenlängen auf derselben Bahn:2 Wellenlängen auf derselben Bahn 1 Monochromator: sukzessiv](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050715/5d4bd3da88c993d34e8bc2af/html5/thumbnails/63.jpg)
In Prozess Kontrolle -Sägepalmenfrüchte
FrischeFrüchte
AlteFrüchte
Tinktur Flüssigextrakt Kapseln mitFlüssigextrakt
![Page 64: QQuantitative DC-AuswertungQuantitative DC-Auswertungpapa-gey.de/kolloquien/2010-13.pdf · 2 Wellenlängen auf derselben Bahn:2 Wellenlängen auf derselben Bahn 1 Monochromator: sukzessiv](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050715/5d4bd3da88c993d34e8bc2af/html5/thumbnails/64.jpg)
Wann DC einsetzen ?Wann die DC einsetzen ?
* Wenn die Anzahl der zu trennenden Substanzen nicht größer als 15, bzw. 40 bei AMD-Entwicklung ist
* Wenn Proben nebeneinander, nicht nacheinander analysiert werden sollen
* Wenn polare Matrix vorhanden ist, die bei einer Säulenchromatographie stört
* Wenn verschiedene Detektionsmöglichkeiten eingesetzt werden sollen
* Wenn ein hoher Probendurchsatz anfällt* Wenn Zeit und Kosten gespart werden sollen
![Page 65: QQuantitative DC-AuswertungQuantitative DC-Auswertungpapa-gey.de/kolloquien/2010-13.pdf · 2 Wellenlängen auf derselben Bahn:2 Wellenlängen auf derselben Bahn 1 Monochromator: sukzessiv](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050715/5d4bd3da88c993d34e8bc2af/html5/thumbnails/65.jpg)
Schwerpunkt: Quantifizierungen
• Definition der Leitsubstanz
• Zertifizierte Standards
• Ausreichende Trennleistung?
• Selektivität der Trennung
• Absicherung des Ergebnisses
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Assay: Tetrandrin in Stephaniatetrandra
Tetrandrin bei210 nm
![Page 67: QQuantitative DC-AuswertungQuantitative DC-Auswertungpapa-gey.de/kolloquien/2010-13.pdf · 2 Wellenlängen auf derselben Bahn:2 Wellenlängen auf derselben Bahn 1 Monochromator: sukzessiv](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050715/5d4bd3da88c993d34e8bc2af/html5/thumbnails/67.jpg)
Tetrandrin - Spezifität
Tetrandrin Standard
Tetrandrin im Extrakt
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Assay: Tetrandrin in Stephaniatetrandra
Spezifität: UV SpektrumLinearität: 50 – 112.5 ng absolut
y = -4.544 + 1.339xr = 0.9996
Bereich: 60 – 90 ng absolut (Target 75 ng)Präzision: (n=6) 0.45%
drei Platten 1.2%
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Verunreinigungen: Aristolochiasäure A in Stephania
Aristolochiasäure A steigende Menge
400 pg - - - - - - - - - - - 8 ng
Aristolochiasäure A steigende Menge
400 pg - - - - - - - - - - - - 8 ngSte
phan
iapu
re 1
0 μL
Ste
phan
iapu
re 3
0 μL
Step
hani
asp
iked
10 μL
Step
hani
asp
iked
30 μL
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Bestimmung von AA Verunreinigung in Stephania
Lineare Regression 200-4500pg
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Publikationen zum Thema
• American Herbal PharmacopoeiaTM, Post Office Box 5159, Santa Cruz, CA 95063, USA
• Reich E, Blatter A: HPTLC for the Analysis of Herbal Drugs, Herbal Drug Preparations and Herbal Medicinal Products. In: Sherma J, Fried B (eds) Handbook of Thin-Layer Chromatography 3rd edition, Chapter 18. New York: Dekker; 2003
• Reich E, Blatter A: Modern TLC: A Key Technique for Identification and Quality Control of Botanicals and Dietary Supplements. INSIDE LABORATORY MANAGEMENT, May/June 2004, 14-18
![Page 72: QQuantitative DC-AuswertungQuantitative DC-Auswertungpapa-gey.de/kolloquien/2010-13.pdf · 2 Wellenlängen auf derselben Bahn:2 Wellenlängen auf derselben Bahn 1 Monochromator: sukzessiv](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050715/5d4bd3da88c993d34e8bc2af/html5/thumbnails/72.jpg)
Identitätsprüfung Pfefferminzöl(nach Pharm. Eur)
Abbildung: CAMAG Applikationslabor
![Page 73: QQuantitative DC-AuswertungQuantitative DC-Auswertungpapa-gey.de/kolloquien/2010-13.pdf · 2 Wellenlängen auf derselben Bahn:2 Wellenlängen auf derselben Bahn 1 Monochromator: sukzessiv](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050715/5d4bd3da88c993d34e8bc2af/html5/thumbnails/73.jpg)
Identität von Safran auf HPTLC-K60-PlatteAufdeckung von Fälschungen (Unterricht in der Schule)
Nach Derivatisierung mitVanillin-Schwefelsäure-R.+ Ausheizen bei 120 °C
1 + 2: Safran 1. Klasse3 + 4: S. aus Ägypten5 + 6: S. aus der Türkei7 + 8: S. aus Deutschland
(Ostmann-Gewürze)
GLP-Platte Elke Hahn-Deinstrop Vortrag Symposium in Goslar
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Identitätsprüfung Brennesselblätter(Feststellung der Herkunft)
1: Droge aus Albanien2: Droge aus Ungarn3: Droge aus Deutschland4: Referenzsubstanzen5: Droge aus Deutschland6: Droge aus Bulgarien7: Droge aus Polen8: Referenzsubstanzen
Abbildung: Vortrag Katrin Koll, FAH Sinzig
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Auswahl von RohmaterialienMönchspfeffer
Diterpene
R
LC V
CAMAG Applikationslabor
Kroatien
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Überprüfung der natürlichen VariabilitätKanadische Gelbwurzel Flavanoide
Argentinien
Türkei Kroatien CAMAG Applikationslabor
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Detektion von FälschungenStephania
echt
Fälschung
CAMAG Applikationslabor
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Echinaceae purpureaIdentitätsprüfung auf HPTLC Kieselgel 60
Monographie voraussichtlich 2004 in der Ph.Eur.
1: Echi. p. officinalis2: Echi. p. „magnus“3: Echi. p. „alba“
Hy: Hyperosid, K: Kämpferol-3-rhamnosidoglucosid
Elke Hahn-Deinstrop Vortrag Symposium in Goslar
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Sage oil - Detection von Fälschungen
GC
CAMAG Applikationslabor
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InprozeßkontrolleGleichförmigkeit der Qualität
Mönchspfeffer
CAMAG Applikationslabor
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In-Prozeßkontrolle bei der Herstellung von Phytopharmaka(Bärentraubenblätter)
Abbildung: Vortrag Katrin Koll, FAH Sinzig
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Screening in der Archäologie
Food Science Forschungslabor Universität Bournemouth
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RückstandsanalytikAflatoxinbestimmung in Getreidemehl (Screening)
B1B2G1
G2
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GehaltsbestimmungAflatoxinbestimmung in Getreidemehl (quantitativ)
Abbildung CAMAG Labor
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RückstandsanalytikAflatoxinbestimmung in Kakaobohnen
• Probenvorbereitung über Immunoaffinitätssäulen
• Fertigplatte HPTLC KG 60• Chloroform/n-Hexan/
Aceton/Toluol (6/2/1/1)• Horizontalkammer S-
Konfiguration• Reihenfolge: G2, G1, B2, B1• NWG: 40ng/kg
S1 S3S2 S4Probe1 Probe2
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Stabilitätsuntersuchung(Zwei-Dimensionale Chromatographie)
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Chaste tree fruits Stabilitätstest
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CAMAG Applikationslabor
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Reinheitsprüfung
CAMAG Applikationslabor
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Lebensmittelfarbstoffe
Amaranth IA 121
Sunset yellow IA 122
Brilliant blue IA 123
Tartrazin IA 124
Ponceau 4-R IA 125
Azorubin IA 126
Arethrosan IA 127
Alufolie Merck KG60 F254
Iso-Amylalkohol/Essigsre/Wasser
2+1+1
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ArzneimittelprüfungGehaltsbestimmung
• Bestimmung von Gentamicinsulfat Gehaltsbestimmung: mikrobiologisch mind. 590 IE/mg
• Zusammensetzung: HPLC mit prächromatographischerDerivatisierung
C1: 25-50%C1a: 10-35%C2+2a: 25-55%
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Gentamicinsulfat in Injektionspräparaten
• Fertigplatten HPTLC KG60• Methanol/Chloroform/
Ammoniaklösung (5/5/6) getrocknete Unterphase
• Derivatisierung durch Tauchen in Ninhydrinlösung
• G1; G2+2a, G1• Gehaltsbestimmung:
lineare Regression
St.1St.1 St.2Pr.1 Pr.2
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Quantifizierung Hyperforin in Johanniskraut
CAMAG Applikationslabor
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QuantifizierungAlkaloidbestimmungKanadische Gelbwurzel
SS S S S S S
Hydrastin
CAMAG Applikationslabor
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Kopplungstechniken: HPTLC-MS
Inst. Lebensmittelchemie Uni Hohenheim, AK Prof.Dr. Schwack, CBS93
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Schicht: HPTLC KG60WRF 254 s
AMD-Entwicklung über 6 Stufen
Kopplungstechniken: HPTLC-MSIdentitäts und Galtsbestimmung Heterocyclische Amine in Fisch
Inst. Lebensmittelchemie Uni Hohenheim, AK Prof.Dr. Schwack, CBS93
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1 = Hydroxyatrazin2 = Formetanat * HCl3 = Triadimenol4 = Metalaxyl5 = Isoproturon6 = Diuron7 = DMSA8 = Methidathion9 = 2,4-D-iso-buthylester10 = Endrin11 = Ethalfluralin12 = DDD
1
2
4
3
5 6
7
89
10 11
12
Pestizide in Trink-/Oberflächenwasser - DIN 38407, Teil 11
CAMAG Applikationslabor
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Ph. Eur. bei Ginkgo biloba?Es lohnt sich HPTLC-Platten zu verwenden und mit dem Fließmittel zu experimentieren
DC-Kieselgel 60 F 254HPTLC-Kieselgel 60 F254
FM -HDUSP-FM FM-HD
Elke Hahn-Deinstrop
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Kopplungstechniken: HPTLC-MS
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Pharmakologische PrüfungenBioverfügbarkeitsstudie
• Sehr komplexe Aufgabenstellung:Prüfung des PräparatesPrüfung der Wirkstoffkonzentration in
Körperflüssigkeiten (Serum, Urin) Prüfung der Rückstände in Geweben und Organen
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Beispiel: Bioäquivalenzstudie
Sulfadimidin-Na
• Probenanfall: 240 Plasma- oder Serumproben, 96 bis 128 Organproben
• Zeitaufwand 25% der HPLC• Kosten 50% der HPLC• Vergleichbare Präzision und Genauigkeit• Nachweisgrenze: 5-15 µg/kg• Bestimmungsgrenze: 8-220µg/kg
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Sulfadimidin-Na in Leber
a Leber ohne SDMD
b Leber m. Zumischung
c Standard
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Content Uniformity Test(Gleichförmigkeit des Wirkstoffgehaltes in einzeln dosierten Arzneiformen)
• Untersuchung von mindestens 10 Proben mit 2 bis 3 Replika
• Zeitaufwand für die Bestimmung von jeweils 3 Wirkstoffen in 10 Proben auf einer HPTLC Platte einschließlich Herstellung der Prüflösungen in ca. 4 Stunden
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Arzneistofffreisetzung
• Blattrührapparatur mit 6 Gefäßen
• je nach Anwendungszweck untersch. pH-Werte
• mind. 4 Abnahmezeitpunkte
• nachweisstarke Methode (0,5 bis 1l Freisetzungsmedium)
Wirkstofffreisetzung Amoxicillin Trihydrat in Pellets
0102030405060708090
100
0 20 40 60 80 100Zeit (min)
Wirk
stof
ffrei
setz
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(%)
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Reinigungsvalidierung
Ziel: Sicherstellung der Rückstandsfreiheit von vorhergehenden Produkten bei mehrfach eingesetzten Geräten und Anlagen bis zu einem akzeptablen Grad.
Auswertung:Visuelle Auswertung nach Feststellung der NWGDensitometrische Auswertung.
Vorteile:Hoher Probendurchsatz (25 Auftragungen pro Plattenseite)Geringer Lösemittelverbrauch (10 ml)Kurze Analysenzeit
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Mikrobiologische DetektionNachweis biologisch aktiver Substanzen
BiolumineX (ChromaDex, Santa Anna)Leuchtbakterien als biologischer DetektorToxische Substanzen mindern die LuminiszenzZum Aktivitäts- und Toxizitätsscreeningvon komplexen Proben(Heilpflanzen, Nahrungsergänzungsstoffe, Lebensmittel)Hohe Reproduzierbarkeit und Automatisierung durch AMDNWG: pg-Bereich
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Mikrobiologische DetektionNachweis biologisch aktiver Substanzen
Chrom Biodip (Merck)Bacillus subtilis (antibiotisch wirksame Fraktionen hemmen das Wachstum der Mikroorganismen)Screening auf unerlaubte Anwendung von AntibiotikaScreening auf neue antibiotischwirksame Stoffe z.B. aus PflanzendrogenNWG: pg - Bereich
CAMAG Applikationslabor
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Schöllkraut
Elke Hahn-Deinstrop
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CHROMART
Titelbild der Weihnachtsausgabeder DAZ 1995
Joseph, Maria & das Baby
CHROMartaus den Blättern des Ginkgo biloba
Baumes
Elke Hahn-Deinstrop