Objectifs
• Citer les principaux acteurs du stress oxydant
• Definir un radical libre
• Décrire l’origine de ces marqueurs
• Citer les principales cibles des espèces réactives
• Citer différentes pathologies impliquant le stress oxydant
• Citer les principales méthodes d’exploration
Plan
1. Stress Oxydant : Origine et Définition
2. Espèces réactives de l’oxygène ou ROS1. Description
2. Principaux modes de production
3. Impact en physiopathologie
4. Mécanismes de protection
5. Exploration
Anoxie mortelle à court terme chez les aérobies
• Chute de l’ATP cellulaire ->Mort tissulaire
• Cerveau détruit en 3 minutes
• Foie, rein et myocarde en qq heures• Muscle, peau et phanères, bcp plus tard
Que se passe t-il au sein de nos
cellules ?
Cellules aérobies produisent des espèces
réactives de l’oxygène, neutralisées par les
antioxydants
Oxygène nécessaire au transfert d’e-
couplé aux phosphorylations oxydatives :
source principale d’énergie
Fuites au niveau mitochondrial
Stress oxydant
Déséquilibre de la balance pro-oxydants/antioxydants
Dommages oxydatifs des biomolécules
Helmut Sies (1985)
PRO-
OXYDANTS
UV, rad. ionisantes
Xénobiotiques
Inflammation
ANTIOXYDAN
TS
GSH (paracétamol)
Vit E, Vit C
Se, Cu
LIPIDES ADN
PROTEINES
ERO
ERNOxydation Oxydation
ROS et défense contre les micro-organismes
• Globules blancs : utilisent l’O2 pour tuer les bactéries phagocytées (via NADPH oxydase, iNOS)
• Monocytes et polynucléaires neutrophiles : mécanisme spécifique pour créer des radicaux libres oxygénés
• Rôle de la NADPH oxydase
• Rôle de la Myeloperoxydase
NO et transduction du signal
• (.NO) : radical libre issu de l’oxydation enzymatique du noyau guanidinium de l’arginine en présence d’oxygène et de NADPH, par NO synthase
• Signal diffusible: diffusion inter-cellulaire
• NO synthases:• constitutive dépendante du Calcium (second
messager)• inductible
NOActive les guanylyl-cyclases cytoplasmiques ->Relachement des cellules musculaires lisses : vasodilatation, hypotension, ...
Prodrogue
Apoptose
Nécrose
Mort
cellulaire
Croissance
Différentiation
Prolifération
Adaptation
SO
SignalisationRedox
Oxydations
réversibles
Oxydations
irréversibles
Red
Ox
Effets cellulaires des ERO et ERN fonction de leur
concentration
Adaptation cellulaire au stress oxydant
Induction
de gènes
Répression
de gènes
Enzymes
anti-oxydantes
et de
réparation
Enzymes
productrices des
ERO
Stress
oxydantAdaptation
Toxicité:
ADN, ARN
Protéines
Lipides
Cellules + H2O2 100 nM
24h 24h
H2O2 1
mM
Cellules + H2O2 1 mMMort cellulaire
Survie cellulaire
Mise en évidence de l’adaptation
Hormésie : réponse biologique favorable en réponse à l’exposition à de
faibles doses de toxiques
24h
Rôle dans la signalisation cellulaire
-Modification réversible des groupementsthiols
des cystéines des protéines
-Rôle de messagers secondaires
H2O2 NO
D’après Y. M.W. Janssen-Heininger. et al (2008)
Modifications réversibles des
cystéines
réactives des protéines
S-glutathionylationAcide sulfénique Acide sulfinique
S nitrosylation
disulfure
H2O2
H2O2H2O2
NO
GSH
TRX
GRX
TRX
GRX SRX
-Thiolate
SO3H
Acide sulfonique
Protéines cibles des oxydations réversibles
des cystéines
Phosphatases : Inactivées
Kinases : activées ou inactivées
Caspases (Inhibition par H2O2 etNO)
Métalloprotéinases (activées par H2O2 etNO)
Protéases : activées ou inactivées
Régulation des facteurs de Transcription
NKB activé par H2O2, inactivé par NO
Mécanisme de l’adaptation par une élévation modérée des ERO et ERN
Signalisation
cellulaire
O2-.
Expression de gènes
Enzymes antioxydantes
(adaptation)
peroxydases
Oxydation réversibles des
cystéines
Modifications d’activité (kinases,
phosphatases, facteurs de
transcription)
H2O2 , NO
inducteurs •Radiations,
•Exercise physique
(entraînement)
•Préconditionnement
ischémique
Thiols
Réductases
(TrX, GrX)
Nécrose
mort
cellulaire
Croissance
Différentiation
Prolifération
Adaptation
ApoptoseSO
Signalisation red ox
oxydations
réversibles
oxydations
irréversibles
Red
Ox
Effets cellulaires des ERO et ERN
Méfaits des ERO et ERN
• Stimulés par les radiations ionisantes
• Entrainnent :• Mutations de l’ADN
• Peroxydation lipidiques
• Altération des protéines
• Anomalies de la transduction des signaux
• Modulent les gènes et les protéines de stress régulant prolifération, différenciation cellulaire et apoptose
Toxicité
ADN: génotoxicité ->Mutagenèse
ARN: oxydation et altération
Lipides: peroxydation, toxicité des produits oxydés,
-> anomalie signalisation, athérosclérose ?
Protéines: oxydation des acides aminés (Cys, Met…)
Nitrosylation (NO), Carbonylation
dénaturation (protéines chaperones),
- > agrégation, maladies dégénératives ?
Glucides: glycation et dérivés
->Diabète
- Quelques exemples de dérivés d’oxydation des bases de l’ADN par les ROS.
Cibles Moléculaires ADN
Peuvent induire des mutations par mésappariement (8-OH hydroxy guanine – A) ou la mort cellulaire
Exemples
d’effets
des ROS
sur les lipides:formation de
l’isoprostane
Composé
Prostaglandine-
like
Cibles Moléculaires : LipidesAcide arachidonique
- Oxydation des lipides par les ROS
Cibles Moléculaires : Lipides
Aldéhydes dérivés
d’acides gras polyinsaturés
Dérivés du cholestérol: oxystérols
Dérivés d’acides aminés
Cibles Moléculaires : Protéines
Les modifications des protéines peuvent induire des altérations fonctionnelles
Acteurs du Stress Oxydant:
Espèces Réactives de l’Oxygène (et de l’Azote)
ESPECES RADICALAIRES
ESPECES NON RADICALAIRES
Radicalhydr
.oxyle
OHAnion
superoxyde
O2
-. NO
d’az.oteLO
LOO
. Monoxyde
Radicaux
lipidique.s
ONO2-
peroxynitrite
HOCl
Acide
hypochloreux
O2
H2O2
Peroxyde
d’hydrogène
LO° alcoxyleLOO° peroxyle
"Radical libre" (RL) =espèce chimique
- électron non apparié
- Existence indépendante ('libre')
1/ R.
2/ électriquement neutres ou chargés : radicaux cationiques r.+ et
anioniques R.-
3/ réactivité particulière avec d’autres atomes ou molécules
4/ oxydant ou réducteur
Radicaux libres (RL)
Formes réactives de l'oxygène (ROS)
Formes radicalaires (RLO) Formes non radicalaires _______________________________________________________
Superoxyde O°- Peroxyde d'hydrogène H2O2
Hydroxyle OH° Acide hypochloreux HOCl
Peroxyle ROO° Ozone O3
Alkoxyle RO° Oxygène singulet 1Dg
Aydroperoxyle HOO° Peroxynitrite ONOO-
___________________________________________________
____
2 grandes voies de production
Transfert d’électrons
O2 + e- O2- .
Lié au métabolisme cellulaire
Origines
Réduction progressive de l’oxygène
O2
1e-O2
-.
(anion superoxyde)
1e - Dismutation O2-.
H2O2
4e- (peroxyde d’hydrogène)
FentonFe2+
1e -
OH˙(radical hydroxyle)
1e -
H2O
O2-
Métabolisme et localisation
Mitochondrie
(respiration cellulaire)
EROs sont des produits 2aires
du métabolisme
Essential of Cell Biology » - Alberts et al - Ed. Garland
Fuites d’électrons au cours de la respiration cellulaire
H+ H+ H+
H+ATPADP
+Pi
O2 2H2O
e-
membrane interne
Membrane externe
MATRICE
NADH FADH2
e-
UQ
O2
O2- 5%
O2-
Production des Espèces Réactives de l’Oxygène et de l’Azote au cours du métabolisme
Mitochondrie
(respiration cellulaire)
Xanthine oxydase
(catabolisme des bases puriques)
Cyclooxygénase Lipoxygénases
(Synthèse des PGs et LOOH)
Cytochrome P450
(métabolisme des xénobiotiques)
EROs : produits 2aires
du métabolisme
NoxNADPH oxydases
EROs et ERNs : produits par
des enzymes spécifiques
NADPH Oxydase (Nox-2) des phagocytes
NADPH
NADP+
O2Nox-2
2O -.
H2O2
.OH
Explosion
respiratoire
Defense contre
les microorganismes
Rôle majeur dans l’inflammationet dans l’immunité innée
Principales Nox et physiopathologies
Types de Nox Distribution Fonctions
Nox-1
Nox-2Phagocytes
Cell endothéliales CardiomyocytesMuscle squelettique Fibroblastes Microglie, neurones
Nox-4Constitutive
Nox-5 Macrophages Lymphocytes
Duox-1 et 2
Produisent H2O2
Cell épithéliales (thyroïde, poumon)
Défense
Physiopathologies
Nox-3
Cell. Muscle lisseCell epithéliales
Oreille interne
Cell. Muscle lisseCell endothélialesFibroblastes
Défense Différentiation
Sénescence
Signalisation cellulaire Apoptose
Différentiation
Granulomatose
Maladies Cardio.Vasc.
Neurodégénérescence AngiogénèseCarcinome prostatique
Athérogénèse
Maladies Cardio-.Vasc.
Octoconies
Athérogénèse
Maladies Cardio- Vasc
NeurodégénerescenceAngiogénèse, Diabète
Infertilé masculine
Défense
Hormone
thyroïde
Hypothyroïdisme
O2-
Production des Espèces Réactives de l’Oxygène et de l’Azote au cours du métabolisme
Xanthine oxydase
(catabolisme des bases puriques)
Mitochondrie
(respiration cellulaire)
Cyclooxygénase Lipoxygénases
(Synthèse des PGs et LOOH)
Cytochrome P450
(métabolisme des xénobiotiques)
EROs sont des produits 2aires
du métabolisme
NoxNADPH oxydases
EROs et ERNs sont produits
par des enzymes spécifiques
des types cellumaires
ONOO-
NO
NO synthases
Arginine
i NOSNADPH
O2
Citrulline
Nox-2
O2-.
H2O2
.OH
NO NO
O2-.
O2ONOO-
NO Synthase inductible des phagocytesRôle majeur dans l’inflammation
NADP+
Nox-2
O2-
Cyclooxygénase Lipoxygénases
(Synthèse des PGs et LOOH)
Production des Espèces Réactives de l’Oxygène et de l’Azote au cours du métabolisme
Xanthine oxydase
(catabolisme des bases puriques)
Mitochondrie
(respiration cellulaire)
Cytochrome P450
(métabolisme des xénobiotiques)
H2O2
F
e
2+
Cu+
.OH
EROs sont des produits 2aires
du métabolisme
NoxNADPH oxydases
EROs et ERNs sont produits
par des enzymes spécifiques
ONOO-
NO
NO synthases
Myéloperoxydase
Cl-
HOCL
Arginine
i NOS
citrulline
NADPH
O2
O2-.
H2O2
.OH
NO NO
MPO
O2-.
O2
+ Cl- HOCL +OH-
ONOO-
Myéloperoxydase des neutrophiles:défense et inflammation
NADP+
Nox-2
Neutrophile
2 grandes voies de production
Transfert d’électrons
O2 + e- O2- .
Lié au métabolisme cellulaire
Scission homolytique des liaisons covalentes
Nécéssite de l’énergie
A.+ B.A. .B
Radiations ionisantes
.OH
Radiolyse de l’eau
irradiation
excitation.OH + H.
.OH + H+ + e-aq
ionisation
H2O
Lumière
Photolyse
H2O2UV
Photochimie
S
flavines
quinones
porphyrines
chlorophylles
S*3 O2
transfert d’e-
O2-.1 O2
h
transfert
d’énergie
.OH 1O2O2-.
UV
lumière
2.OH
Facteurs augmentant la production ERO et ERN
Radiations
Ionisantes, UV
Médicaments, Pesticides,
Solvants industrielsPolluants
atmosphérique
s
Facteurs environnementaux
Métaux lourds
Inflammation Ischémie/
reperfusion
Hyperglycémie
Hyperlipidémie
Facteurs endogènes
Surcharge
Fe, Cu
Infections
ERO, ERN
Etats pathologiques impliquant le stress
oxydant
Cause ou Conséquence?
Pathologies chroniques Pathologies aiguës
•Athérosclérose
•Cancer
•Diabète
•Cataracte, DMLA
•Maladie d’Alzheimer
•Vieillissement
•Lésions de reperfusion
post-ischémique (infarctus,
AVC, greffe d’organes)
•Hyperoxygénation (O2 hyperbare)
•Choc septique
•Inflammation
Etats pathologiques impliquant le stress
oxydant
Cause ou Conséquence
Pathologies chroniques Pathologies aiguës
•Athérosclérose
•Cancer
•Diabète
•Cataracte, DMLA
•Maladie d’Alzheimer
•Vieillissement
•Lésions de reperfusion
post-ischémique (infarctus,
AVC, greffe d’organes)
•Hyperoxygénation (O2 hyperbare)
•Choc septique
•Inflammation
Heinecke J W J Exp Med 2006;203:813-816
ERO
Oxydation des LDL dans l’initiation de l’athérosclérose
MCP1
ERO
mmLDL
Différentes formes de LDL oxydées
LOOH
LOOH
-NHX
-NHX
Native
Minimally oxidized
Extensively oxidized
Oxidatively modified
seeded
Facteurs de risques de la maladie coronarienne et concentration d’isoprostanes
Facteurs de risques
Fumeurs
Hypercholestérolémie
X 3 gros fumeurs
Isoprostanes(plasma, urine)
X 2 à 3
Diabète type 2 X 2 à 6
Obésité
Hypertension
X 3 à 4 - log isoP urinaire corrélé
au IMC
X 2 - log isoP urinaire corrélé
avec la pression systolique
Protéine C réactive X 1.5 (homocystéine élevée)
D’après Davies s.& Roberts , 2011
Etats pathologiques impliquant le stress
oxydant
Cause ou Conséquence
Pathologies chroniques Pathologies aiguës
•Athérosclérose
•Cancer
•Diabète
•Cataracte, DMLA
•Maladie d’Alzheimer
•Vieillissement
•Lésions d’ischémie/reperfusion
(infarctus,AVC, greffe
d’organes)
•Hyperoxygénation (O2 hyperbare)
•Choc septique
•Inflammation
ME
FADH2
NADH
Deshydrogénase
Succinate
Deshydrogénase
Cytochrome C
RéductaseCytochrome C
Oxydase
MI
Chaine respiratoire
e-
I II III
e-
IV V ANT
Désynchronisation de la chaîne respiratoire durant l’ischémiereperfusion
Ischémie: découplage avec excès e- et anoxie
ATP->ADP->AMP ---- Adénosine->HypoxanthineInduction de Xantine oxydase ->Anion superoxyde à la reperfusion
I II III
O2º-
IV V ANT
Modifications de la chaîne respiratoire durant l’ischémiereperfusion (2)
O2
O2º-
Reperfusion: apport massif O2 sur les e- accumulés
MnSOD
H2O2
CE : cellules endothéliales ; ERO : espèces
réactives de l’oxygène ; IL-1 : interleukine-1 ;
PNN : polynucléaires neutrophiles ; TNF-α: Tu m o r N e c r o s i s Fa c t o r α
Mécanismes lésionnels et initiation
de la réponse inflammatoire au
cours des phases précoce et tardive
de la reperfusion (d’après Jaeschke,
2003
Reaction de mono-oxygenation:
A-H + O2 + NADPH,H+ A-OH + H2O + NADP+
RE riche en cytochromes P450 impliqués dans les processus de métabolisme
des Xénobiotiques
Cytochrome P450 du réticulum endoplasmique
Rôle de l’exposition aux médicaments et toxiques
P450FeIII P450 –FeIII-SH
2e- NADPHCytP450
reductase
O2
P450-FeIII-SH
O22-
P450-FeIII-SH + O2- et/ou H2O2P450-FeIII
SOH
Génèse ERO via CYP450
Stress oxydant: adaptation et défense
1ère ligne
Molécules anti-oxydantes; GSH, Vit C, Vit E, biliverdine, Ac urique, Hème ….
2ème ligne
Induction ou répression des gènes
Activités enzymatiques anti-oxydantes: GPx, Cat, SOD, Hox…
Activités enzymatiques pro-oxydantes: CYP, oxydases…
Réparation: ADN, protéines (Trx, Trx réductase, chaperon)
Dernière ligne
Apoptose
Protections contre le stress oxydant
Confinement en organelles
Protections non spécifiques
Protections spécifiques
Mitochondries : principale source de production de radicaux libres
Exception pour le foie: microsomes
Mitochondries Microsome Peroxysome
Cytosol
45% 20% 30%
5%
Mitochondries Microsome Peroxysome
Cytosol
15% 45% 35%
5%
Origine subcellulaire
Confinement en organelles
• Mitochondrie
• COX, certaines oxydases
• Sensibilité de l’ADN mitochondrial
• Peroxysomes
• Contiennent de nombreuses oxydases
• Catalases et peroxydases
Rôles des peroxysomes
• Métabolisme des peroxydes, des ERO et ERN
• Synthèse des plasmalogènes
• b- et a-oxydation des acides gras
• Métabolisme du glyoxylate
• Métabolisme des acides aminés (dégradation des isomères D des acides aminés, catabolisme de la L-lysine, dégradation des polyamines)
inhibition
SOD
O-2
H2O2
CAT
H2O
GPx, GSH
LOH
2NO --
LOOH
ONOO
Enzymes de défense antioxydante
Enzymes clées(Housekeeping enzymes)
Superoxyde dismutases
Catalase
Glutathion peroxydases
H2O2
H2O + O2 H2O
O2.-
.OH
Superoxidedismutases
(Cu/Zn-Mn)
Catalase GSH-PeroxidaseGSH
GSSG
Fe2+Fe3
+
Première ligne de défense
Systèmes de Défense enzymatiques
Protéines non enzymatiques
-Sequestrants des minéraux
- Fe: Transferrine, ferritine, lactoferrine
- Cu: céruloplasmine, albumine
- Métallothionéines: Zn+, Cu+,Cd+, Hg2+
Protéines enzymatiques
-Thiols-disulfures oxydoréductases et transférases
- Système thiorédoxine (thiorédoxine/thiorédoxine
réductase/NADPH)
- Peroxirédoxines (thiorédoxine peroxydases)
- Système glutarédoxine (glutarédoxine/ glutarédoxine
réductase/GSH)
- Hème oxygénase
Autres protéines antioxydantes
Antioxydants de bas poids moléculaire
Endogènes- glutathion (synthèse via N-acétyl cystéine)- acide urique : 1O2, LOO°
- bilirubine : 1O2, LOO°
- acide lipoïque : .OH, LOO°, HOCL, ONOOH
- coenzyme Q10 :LOO°
Apportés par l’alimentation
- Vitamines E et C
- Caroténoïdes- Polyphénols, flavonoïdes
• Tripeptide (glycine, glutamate, cystéine)
• Dans toutes les cellules à des concentrations élevées
• Forme réduite: groupement –SH
• Forme oxydée: 2 tripeptides se lient de manière covalente
(S-S, pont disulfure)
• 2 atomes d ’H libérés: H2O2 --> 2H20
Glutathion
Réparation des lipides oxydés
Excision des bases oxydées
Réparation des protéines oxydées
En aval : systèmes de réparation non spécifique
Vitamines antioxydantes
• Rôle biologique essentiel
• Vitamines hydrophiles
• Acide ascorbique (vitamine C)
• Vitamines liposolubles
• Vitamines A & E
Techniques d’exploration
Isoprostanes dérivés de la famille des prostacyclines les Isoprostanes, dont la 8-epi PGF2 alpha
Peroxydation de l’acide arachidonique , indépendante de l’action des enzymes cyclooxygénase
et lipooxygénase
Hydroperoxydes lipidiques
Aldéhydes stables comme le Malondialdéhyde (MDA) et les 4 hydroxyalkenals comme le 4 HNE
(4hydroxynonenal)
Glutathion : Stress oxydant rapport glutathion réduit/glutathion oxydé
Dosage des défenses: acide ascorbique, a-tocophérol, b-carotène, ubiquinol, …
Total antioxydant status
mesure la capacité totale antioxydante du plasma
Marqueurs de la peroxydation des protéines
Protein adducts on protéines carbonylées.
Marqueurs de la peroxydation des acides nucléiques
8-0H-deoxyguanosine.
Marqueurs de l’activation des PN
Dosage de la myeloperoxydase, de la Lactoferrine et de l’elastase.
Dosages d’enzymes anti oxydantes
la SODs, la Glutathion peroxydase selenium dept ou indept, la catalase.
Techniques d’exploration
Stress oxydant : nouvelle définition
Déséquilibre de la balance pro-oxydants/antioxydants domages oxydatifs des
biomolécules Helmut Sies (1985)
ANTIOXYDANTS
PRO-OXYDANTS
LIPIDES ADN
ERO
ERNOxydation Nitrosylation
nitration
PROTEINES
Pr. J. Cillard, Pharmacie, Rennes
Perturbation de la signalisation et du contrôle de l’homéostasie redox (Dean Jones
2006)
Conclusion
-Homéostasie redox : équilibre entre production d’espèces
réactives et lutte contre ces espèces
-Impact positif dans la défense anti-microbienne
-Rôle du stress oxydant dans la signalisation et
l’adaptation cellulaire
-Impact en physiopathologie : cause ou conséquence?
Take home message
• Espèces radicalaires de l’oxygène et de l’azote :• Role physiologique
• Role pathologique
• Importance d’un équilibre redox, sinon induction d’un stress oxydant
• Important arsenal de protection : spécifique (Enzymatique+++) et aspécifique
• Peu exploré en pratique clinique quotidienne