Download - Reacciones Antígeno-Anticuerpo
Reacciones Antígeno-Anticuerpoy sus Aplicaciones Diagnósticas
Prof. Edwin [email protected]
Universidad Central de Venezuela
Facultad de Medicina
Escuela de Medicina “José María Vargas”
Cátedra de Inmunología
Tema 42018-2019
Contenido
• Características de la unión Ag/Ac
• Aplicaciones Diagnósticas
•Interacción No Covalente•Afinidad y Avidez•Flexibilidad de la Molécula de Ig
•Serología•Técnicas Serológicas de Unión Primaria
•ELISA, Radioinmunoensayo, Inmunofluorescencia
•Técnicas Serológicas de Unión Secundaria•Aglutinación, Inmunoprecipitación
•Otras Aplicaciones•Inmunohemólisis, Citometría de Flujo
Interacciones Ag/Ac
Unión No Covalente
Interacción Antígeno/Anticuerpo
AntígenoHemaglutinina del Virus de la Influenza
AnticuerpoRegión VL y Región VH
No Covalente / Reversible / Específica
Scientific American 1993; 269(3):22
Inmunología de Kuby
Interacción Antígeno/Anticuerpo•Enlaces No Covalentes
•Muchas Interacciones Débiles = Unión Fuerte•Grupos Moleculares en Posiciones Precisas
•Puentes de Hidrógeno•Enlaces Iónicos•Interacciones Hidrofóbicas•Fuerzas de van der Walls
Inmunología de Kuby
Interacciones Ag/Ac
Afinidad y Avidez
• Es una medida termodinámica de la fuerza de interacción entre un sitio de unión de un anticuerpo y un único epítopo
Interacción MonovalenteAfinidad
Interacción Ag/Ac
Afinidad del AnticuerpoDiálisis de Equilibrio
A) En Ausencia de Anticuerpo
Tiempo, h
50
100
A
B
B) En Presencia de Anticuerpo
Tiempo, h
50
100
B
A
D
Inmunología de Kuby
• Es una medida de la fuerza de interacción entre múltiples sitios de unión de una molécula de anticuerpo y múltiples epítopos repetitivos en un antígeno polivalente
Interacción PolivalenteAvidez
Interacción Ag/Ac
IgMHasta 10 sitios de Unión
107
1011
Avidez
Anticuerpos
Afinidad y Avidez
Constante de
Equilibrio
IgGUnión
Monovalente
104
Afinidad
Aumento
de la
Energía de Unión
103
IgGUnión Bivalente
107
Avidez
Avidez = Afinidad Funcional
Interacciones Ag/Ac
Flexibilidad de la Ig
FV
Fb
CH2
CH3
Bisagra
Codo
EB’SF
AF
0°- 50°0°- 180°
0°- 180°
AF: Flexibilidad Axial (Rotación)
SF: Flexión Segmental
EB’: Flexión del Codo (180° - EB)
SF
AF
EB’
0°- 180°
0°- 180°
0°- 50°
FV
Codo
Fb
Bisagra
CH2
CH3
Fab
Fc
Modificado de: Fundamental Immunology-W.Paul-6th.edition-2008
Flexibilidad de la Molécula de Ig
Fv: VL + VH
Fb: CL + CH1
Fundamental Immunology-W.Paul-6th.edition-2008
Flexibilidad de la Molécula de Ig
http://uhaweb.hartford.edu/bugl/immune.htm
Flexibilidad de la Molécula de Ig
Cambio conformacionalal unirse el antígeno y el anticuerpo
AntígenoProteasa del VIH-1
Anticuerpo•Antes de unirse al Ag•Luego de unirse al Ag
CDRCadena Pesada
H1, H2, H3
Cadena LivianaL1, L2, L3
Inmunología de Kuby
Interacciones Ag/Ac
Reactividad Cruzada
Reacciones Cruzadas• Si dos antígenos diferentes comparten un
epítopo idéntico o muy similar, los anticuerpos específicos contra uno de los antígenos podría reaccionar en forma cruzada con el otro antígeno, aunque generalmente con menor afinidad.
elprofedebiolo.blogspot.com
losgrupossanguineos.blogspot.com
Pared Celular de BacteriasMembrana de Eritrocitos
Grupos Sanguíneos “ABO”Polisacáridos
Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac
Serología
Suero• Suero: es el líquido residual de la sangre,
después que la sangre o el plasma se han coagulado. En el Suero se encuentran los anticuerpos
SueroCoágulo
http://www.centro-medico-aleman.com/terapiaprp.php?lang=CAS
https://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/esp_imagepages/10026.htm
Sangre
Total
Antisuero• Antisuero: es una muestra de Suero que tiene
anticuerpos detectables específicos para un antígeno en particular
AntisueroPoliclonal
Inmunización
Inmunología de Kuby
Serología• Serología: es el estudio, a partir de una
muestra de suero, de los anticuerpos y sus reacciones con los antígenos
http://poderinformar.com/dengue-ante-la-gran-demanda-de-casos-febriles-suspenden-estudios-de-serologia/
Ig M Ig G
Antígeno1er. Reto
Antígeno2do. Reto
RespuestaPrimaria
RespuestaSecundaria
Ig M
Ig G
Tiempo
Latencia
Respuesta Primaria y Secundaria
•Memoria•Cambio de Isotipo
•Maduración de la Afinidad(Hipermutación Somática)
Inmunología de Kuby
Respuesta Primaria y Secundaria
Toxoplasma gondii
http://www.diasorin.com/sites/default/files/allegati_prodotti/m0870004275_toxoplasma_igg_igm_torch_flyer_low.pdf
Respuesta Primaria y Secundaria
Toxoplasma gondii
http://www.diasorin.com/sites/default/files/allegati_prodotti/m0870004275_toxoplasma_igg_igm_torch_flyer_low.pdf
Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac
Técnicas Serológicas de Unión Primaria y Secundaria
Técnicas Serológicas
• De Unión Primaria: mide directamente la cantidad de complejo Ag/Ac formado.Mayor sensibilidad (pg/mL), requiere sistema revelador
– ELISA (Reacción Colorimétrica – Enzima/Sustrato)
– Radioinmunoensayo (Isótopos Radioactivos)
– Inmunofluorescencia (Fluorocromos conjugados)
• De Unión Secundaria: mide la consecuencia o efecto de la unión Ag/Ac.
Menor sensibilidad (μg/mL), observación “directa”
– Aglutinación
– Inmunoprecipitación
Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac
ELISA
ELISAEnzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
• Permite medir la cantidad de complejo Ag/Ac formado, utilizando un reactivo detector conjugado a una enzima, que en presencia de un sustrato cromógeno resultará en una reacción colorimétrica.
• La intensidad de color será directamente proporcional a la cantidad de complejo Ag/Ac
ELISA Indirecto
•Detección de anticuerpos específicos en el suero del paciente
•Aplicaciones:•Diagnóstico de Infección o exposición a microorganismos
•Detección de Autoanticuerpos
•Respuesta a Inmunizaciones/Vacunas
Fase de
Captura
Ag de VIH-1Proteínas
Recombinantes
Diagnóstico de Infección por VIH-1
Fase de
Detección
Anti-IgGConjugados a
Enzima
Lavado
Revelado
Reacción de ColorSustrato Cromógeno
Lavado
Marcador
Identificado
IgG anti-VIH-1Anticuerpos en
Suero del Paciente
Agregar
Inmunología de Kuby
ELISA Tipo Sándwich
•Detección de antígenos específicos en el suero del paciente
•Aplicaciones:•Detección de Ag microbianos
•Determinación de Hormonas, Citoquinas, Drogas, Marcadores Tumorales, etc.
Fase de
Captura
Ac Anti-HBsAg
Determinación de Antígeno de Superficie del Virus de Hepatitis B
Fase de
Detección
Anti-HBsAgConjugados a
Enzima
Lavado
Revelado
Reacción de ColorSustrato Cromógeno
Lavado
Marcador
Identificado
HBsAgAntígeno en
Suero del Paciente
Agregar
Inmunología de Kuby
Anti-
h-CG
ELISA Competitivo
•El antígenos específico en el suero del paciente compite con el
antígeno unido a la fase sólida para unirse al anticuerpo. La intensidad de
color es inversamente proporcional a la cantidad de Ag en la muestra
•Aplicaciones:•Determinación de Hormonas, Citoquinas, Drogas, Marcadores Tumorales, etc.
Determinación de Gonadotropina Coriónica Humana (h-CG)
Fase de
Captura
h-CGProteínas
Recombinantes
IgG
Fase de
Detección
Anti-IgGConjugados a
Enzima
Lavado
Revelado
Reacción de ColorSustrato Cromógeno
Lavado
Marcador
Identificado
h-CGHormona en
Suero del Paciente
Agregar
Inmunología de Kuby
Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac
Radioinmunoensayo - RIA
Radioinmunoensayo – RIARosalyn Yalow* y Solomon Berson
* Premio Nobel 1977
Clin Chim Acta 1968; 22(1):51-69.
El RIA explota la habilidad de hormonas no marcadas presentes en plasma u otras
soluciones, de competir por su unión al anticuerpo con hormanas marcadas
radioactivamente, inhibiendo su unión.
Radioinmunoensayo - RIA
•Unión competitiva de antígenos radiomarcados y antígenos no
marcados a anticuerpos de alta afinidad. Ag marcado a concentraciones
que saturan sitios de unón del Ac.
•Aplicaciones:•Detección de Hormonas, Proteínas séricas, Vitaminas, Ag Microbianos
Diagnóstico de Infección por Virus de Hepatitis B
Inmunología de Kuby
Anti-IgE
marcada (I125)
IgE Total
PRISTIgE Específico
RAST
Radioinmunoensayo - RIA
Anti-IgE
marcada (I125)
RAST: Radio Allergo Sorbent TestPRIST: Paper Radio Immuno Sorbent Test
Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac
Inmunofluorescencia - IF
Estreptococos Anticuerpos Anti-estreptococo
Conjugados a Fluorocromo
Estreptococos“Fluorescentes”
Imagen microscópica de Estreptococos Marcados con
Anticuerpos + Fluocromo
IF DirectaIF Indirecta
CélulaCélula
Antígeno
Antícuerpo Primario
Antícuerpo Secundario
Fluorocromo
http://www.abcam.com/secondary-antibodies/direct-vs-indirect-immunofluorescence
La Inmunofluorescencia (IF) permite evaluar la presencia de antígenos
en células y tejidos; y la detección y titulación de anticuerpos
específicos, utilizando fluorocromos conjugados a anticuerpos
•Inmunofluorescencia Directa: un anticuerpo primario
específico conjugado con el fluorocromo se aplica directamente sobre la
muestra (tejido, célula, u otro) permitiendo identificar la estructura responsable
de la especificidad. Aplicaciones: identificar microorganismos y tipificar
células (por ejemplo: linfocitos T).
•Inmunofluorescencia Indirecta: un anticuerpos primario
no marcado se aplica directamente sobre el sustrato (tejido, célula, u otro) y se
visualiza la reactividad con un conjugado anti-inmunoglobulina-fluorocromo.
Aplicaciones: detección de autoanticuerpos.
Inmunofluorescencia
InmunofluorescenciaCultivos de Células Cerebrocorticales de Ratón
Identificación de Neuronas y Astrocitos
Cell Death and Differentiation 2007; 14:296–305
A
B
A. Neuronas marcadas con anticuerpos anti-MAP-2 (Microtubule Associated Protein-2) evidenciados por un
fluorocromo rojo (Alexa 647). El ADN nuclear se
marca con fluorescencia azul (Hoechst 33342)
B. Astrocitos marcados con anticuerpos anti-GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) evidenciados por un
fluorocromo verde (Alexa 488). El ADN nuclear se
marca con fluorescencia azul (Hoechst 33342)
Inmunofluorescencia
Anticuerpos Antinucleares – ANAPatrones Asociados a Enfermedades Autoinmunes
Diagnostic Pathology 2009, 4:1
http://www.diagnosticpathology.org/content/4/1/1
Patrón
Homogéneo(ADN-dc, Histonas)
•Lupus Eritematoso
Sistémico
•LES inducido por
Drogas
Patrón
Nucleolar
(PM-Scl, ARN Polimerasa I-III,
U3-RNP)
•Esclerosis Sistémica
•Polimiositis
Patrón
Punteado(ENA, RNP, Sm, SSA/Ro,
SSB/La, Scl-70)
•Lupus Eritematoso
Sistémico
•Enfermedad Mixta del
Tejido Conectivo
•Esclerosis Sistémica
•Sindrome de Sjogren
•Polimiositis
Patrón
Periférico(RNP, Sm, SSA/Ro)
•Lupus Eritematoso
Sistémico
•Esclerosis Sistémica
http://asc.dental.ufl.edu/ReferenceSera.html
Anticuerpos AntinuclearesDiferentes Patrones de Fluorescencia
Línea de Células Epiteliales Humanas Hep2
D
Patrón Nucleolar
Ag Asoc.Fibrilarina (U3-RNP)
Enf. Asoc.SSc
Patrón Homogéneo
A
Ag Asoc.dsDNA
Nucleosomas
Histonas
Enf. Asoc.SLE
Lupus Inducido por Drogas
Artritis Idiopática Juvenil
B
Patrón Granular Fino
Enf. Asoc.SjS, SLE,
Dermatomiositis
Ag Asoc.SS-A/Ro, SS-B/La,
Mi-2, TIF1γ, TIF1β,
Ku
C
Patrón Granular Grueso
Enf. Asoc.MCTD,SLE,
SSc
Ag Asoc.hnRNP, U1RNP, Sm,
ARN Polimerasa III
Ag Asoc.CENP-A/B(C)
Enf. Asoc.SSc limitada cutánea,
PBC
E
Patrón Centromérico
F
Patrón PCNA
Ag Asoc.PCNA
Enf. Asoc.SLE,
otras condiciones
http://www.chemgapedia.de/vsengine/tra/vsc/en/ch/25/orgentec/autoimmundiagnostik.tra/Vlu/vsc/en/ch/25/orgentec/autoimmundiagnostik.vlu/Page/vsc/
en/ch/25/orgentec/diagnostik_immunfluoreszenz_en.vscml.html
Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac
Inmunohistoquímica - IHQ
Tinción inmunohistoquímica de ganglio
linfático con anticuerpos anti-CD4
Inmunocitoquímica / Inmunohistoquímica(ICQ) (IHQ)
La ICQ (aplicada a células aisladas)
y la IHQ (aplicada a tejidos/biopsias)
utiliza anticuerpos específicos para
antígenos presentes en las células a
estudiar y los conjuga con enzimas.
La presencia de los antígenos en las
muestras de células/tejidos puede
visualizarse al añadir sustratos que
son modificados por las enzimas
conjugadas con el anticuerpo,
creando precipitados
coloreados insolubles en los sitios
precisos de unión
antígeno/anticuerpo.
http://www.msal.gob.ar/images/stories/bes/graficos/0000001339cnt-20180921-guia-inmunohistoquimica-para-tecnicos.pdf
InmunohistoquímicaCortes de Vaina Linfoide Periarteriolar (PALS) de Bazo de Rata
Identificación de Linfocitos T Totales y Citotóxicos
Toxicologic Pathology 2008; 36: 795-804,
B
D
A
C
A y C. Ratas Han Wistar(Ratas inmunocompetetntes)
B y D. Ratas Desnudas Atímicas(Carecen de Timo y Linfocitos T maduros)
A y BAnti-CD3
C y DAnti-CD8
Las muestras fueron incubadas secuencialmente con anticuerpos primarios (anti-CD3 o anti-CD8), anticuerpos secundarios
conjugados a peroxidasa, y diaminobezidina como sustrato, para dar una coloración marrón-rojiza en los sitios de unión Ag-Ac
Inmunohistoquímica Multiplex Cuantitativa
Cell Reports 2017; 19:203–217
Here, we describe a multiplexed immunohistochemical platform with computational
image processing workflows, including image cytometry, enabling simultaneous
evaluation of 12 biomarkers in one formalin-fixed paraffin-embedded tissue section.
Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac
Reacciones de Precipitación
Zona de Exceso de Anticuerpo
Zona de Equivalencia
Zona de Exceso de Antígeno
SobrenadanteExceso de Anticuerpo
Exceso de Antígeno
Cantidad de Antígeno Añadidomicrobiology4.blogspot.com
Reacciones de Precipitación• El anticuerpo y el antígeno en solución interactúan formando complejos
inmunes en forma de retículos, haciéndose insolubles y precipitando• El anticuerpo debe ser por lo menos bivalente
• El antígeno debe ser bivalente o polivalente
• La relación entre las concentraciones de Ac y Ag deben ser óptimas (Zona de Equivalencia)
Inmunología de Kuby
Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac
Reacciones de Precipitación en Gel
Reacciones de
Inmunoprecipitación en Gel• Permiten detectar la presencia y/o concentración de antígenos y/o
anticuerpos presentes, por la formación de bandas opacas de precipitado que corresponden a complejos antígenos-anticuerpos en la zona de equivalencia.
http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/micbio/classes_stud/en/nurse/Bacchalour%20of%20Sciences%20in%20Nurses/ptn/Microbiology/2/14%20The%20usage%20of%20im
munological%20reactions.htm
Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac
Reacciones de Precipitación en Gel
Inmunodifusión Doble (Outchterlony)
Inmunodifusión DobleOutchterlony
• Se basa en la difusión del Ag y el Ac en un medio semisólido (gel de agar), formando bandas de precipitación en el punto donde los reactantes alcanzan proporciones equivalentes.
Banda de PrecitaciónZona de Equivalencia Ag/Ac
Inmunología de Kuby
microbiology4.blogspot.com
Inmunodifusión DobleOutchterlony
http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/micbio/classes_stud/en/nurse/Bacchalour%20of%20Sciences%20in%20Nurses/ptn/Microbiology/2/14%20The%20
usage%20of%20immunological%20reactions.htm
Suerodel Paciente
AntígenosNucleares
•SSA/Ro
•SSB/La
Sindrome
de Sjogren
Inmunodifusión DobleAplicaciones
• Análisis de Ag y Ac
• Determinar la relación inmunoquímica entre dos Ag (Identidad, No Identidad e Identidad Parcial)
• Determinar monoespecificidad de un antisuero
• Conocer el título de los anticuerpos..
Palomo et al Eds: Fundamentos de Inmunología Básica y Clínica. Univ Talca, Chile, 2002
Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac
Reacciones de Precipitación en Gel
Inmunoelectroforesis
Inmunoelectroforesis• Combina la electroforesis en una dimensión
en un primer paso, con la inmunodifusión en dirección perpendicular en un segundo paso.
• Permite la identificación de diferentes antígenos en mezclas complejas
• Se utiliza en el diagnóstico de cierto tipo de Inmunodeficiencias y de Mieloma Múltiple
Palomo et al Eds: Fundamentos de Inmunología Básica y Clínica. Univ Talca, Chile, 2002
http://www.scielo.org.pe/pdf/afm/v64n3/a02v64n3.pdf
CCC P P P
Inmunoelectroforesis1. Colocar en pozos de gel de agarosa sueros de Paciente (P) y Control (C) apropiado
Palomo et al Eds: Fundamentos de Inmunología Básica y Clínica. Univ Talca, Chile, 2002
CCC P P P
+
-
Inmunoelectroforesis2. Someter las muestras a un campo eléctrico para separar por Electroforesis
Palomo et al Eds: Fundamentos de Inmunología Básica y Clínica. Univ Talca, Chile, 2002
CCC P P P
+
-
Inmunoelectroforesis3. Abrir canales en la placa de agarosa y colocar antisueros apropiados. Incubar para difusión
IgG IgA IgM κ λ
Anti Anti AntiAnti Anti
Palomo et al Eds: Fundamentos de Inmunología Básica y Clínica. Univ Talca, Chile, 2002
Anti
IgG
Anti
IgA +Anti
κ
Anti
λ
Anti
IgM
CCC P P P
Inmunoelectroforesis4. Evaluar arcos de precipitación
Conclusión: Paciente con Gammapatía Monoclonal IgG-KappaPalomo et al Eds: Fundamentos de Inmunología Básica y Clínica. Univ Talca, Chile, 2002
Anti IgG
Anti IgA
Anti IgM
Anti Kappa
Anti Lambda
Anti Inmunoglobulina
Control
Control
Control
Control
Paciente
Paciente
Paciente
Modificado de: Fundamental Immunology-W.Paul-6th.edition-2008
InmunoelectroforesisPaciente con Gammapatía Monoclonal IgG-Kappa
Aplicaciones Diagnósticasde las Interacciones Ag/Ac
Reacciones de Aglutinación
Un antígeno particulado (bacterias, eritrocitos), al interactuar con su
anticuerpo específico en proporciones óptimas, se une por medio de
enlaces cruzados. Este complejo de unión forma Agregados,
produciendo una reacción de aglutinación.
Reacciones de Aglutinación
Aglutinación de Glóbulos RojosHemaglutinación
Modificado de: Rev Bras Hematol Hemoter 2011; 33(4):297-301
Glóbulos RojosAnticuerpos
(Anti-A)Aglutinación
(Entrecruzamiento de GR)
Antígeno A
(Grupo “A”)
Determinación del Grupo Sanguíneo “ABO”Pruebas de Aglutinación
Se estudia la presencia de antígenos del sistema “ABO” en eritrocitos de un paciente, utilizando antisueros específicos para
dichos antígenos (Anti-A y Anti-B). En la figura se presenta además la reacción con el suero Anti-D, para la determinación del
factor Rh y una prueba “Control” negativa, para descartar autoaglutinación. En este caso el paciente es Grupo “A”, Rh: Positivo.
Determinación del Grupo Sanguíneo “ABO”Pruebas de Aglutinación
SueroAnti-A
SueroAnti-B
Grupo “A”
Grupo “B”
Grupo “AB”
Grupo “O”
Modificado de: www.biologycorner.com
Resultados e interpretación de la reacción de aglutinación de eritrocitos de pacientes
con los antisueros anti-A y anti-B, para la determinación del grupo sanguíneo “ABO”
¡GRACIAS!
Para estudiar por su cuenta
• Inmunodifusión Radial
• Aglutinación: Inhibición de la Aglutinación
• Pruebas de Inmunohemólisis: Fijación de Complemento
http://epidemiologiamolecular.com/reacciones-hemaglutinacion-lisis/
Prueba de Fijación de Complemento
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/1c/Coombs_test_schematic.png
Pruebas de Coombs: Directa e Indirecta