UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINǍ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA
ŞCOALA DOCTORALǍ FACULTATEA DE AGRICULTURĂ
Ing. DANIELA CAMELIA MARELE
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
Influenţa mutagenă in vitro a unor agenţi chimici în vederea obţinerii de mutaţii utile pentru procesul
de ameliorare la soia (Glycine max (L.) Merril)
Conducător ştiinţific:
Prof. univ. dr. SAVATTI MIRCEA
CLUJ-NAPOCA
2009
3
Rezumatul tezei de doctorat
Majoritatea studiilor efectuate timp de un secol în domeniul vitroculturilor vegetale
au servit la elucidarea mai multor aspecte privind regenerarea, creşterea, organogeneza,
embriogeneza somatică ş.a., a unor structuri tisulare sau a unor tipuri celulare, în funcţie de
compoziţia mediului de cultură şi a condiţiilor ecofiziologice din recipientele de cultură şi
a camerei de creştere. Există, însă, încă, numeroase necunoscute cu privire la unii factori
implicaţi în morfogeneză (în special la nivel celular şi molecular), precum şi referitor la
transmiterea şi a informaţiei genetice nou dobândite.
Culturile in vitro au găsit într-un timp foarte scurt numeroase aplicaţii practice în
ameliorarea numeroaselor specii de cultură, implicit la soia, privind multiplicarea
genotipurilor valoroase, propagarea stocurilor libere de viroze, conservarea resurselor
genetice ş.a. În plus, variaţia genetică manifestată de plantele regenerate în cultura in vitro
(variabilitatea somaclonală), sau cea obţinută prin mutageneză indusă, a putut şi este
folosită în obţinerea de genotipuri valoroase.
Pornind de la aceste constatări ne-am străduit ca pe lângă sintetizarea rezultatelor
pro- şi contra, privind problema multiplicării şi creării de mutaţii in vitro la soia, să
încercăm să elaborăm propriile noastre păreri în cadrul tezei de doctorat: “Influenţa
mutagenă in vitro a unor agenţi chimici în vederea obţinerii de mutaţii utile pentru
procesul de ameliorare la soia (Glycine max (L.) Merril)”.
În abordarea acestui subiect s-a urmărit elucidarea unor aspecte privind
posibilităţile de regenerare şi multiplicare in vitro la soia, crearea de variabilitate genetică
şi selecţia mutantelor de soia, in vitro.
În scopul celor menţionate, abordarea noastră se referă la unele aspecte majore care
să evidenţieze următoarele:
- optimizarea protocolului pentru organogeneza directă a cultivarelor de soia;
- implicarea unor citochinine în morfogeneza in vitro la soia;
- capacitatea de regenerare in vitro a unor tipuri de explante de naturǎ diferitǎ la soia;
- reacţia genotipurilor de soia, in vitro, în culturile de meristeme şi calus;
- inducerea de mutaţii in vitro la soia, folosind agenţi mutageni chimici (DES, DMS şi
EMS);
- relaţia dintre tratamentul mutagen şi frecvenţa aberaţiilor cromozomale;
4
- utilizarea selecţiei in vitro pentru evidenţierea unor genotipuri de soia tolerante la ionii de
aluminiu (Al+);
- detectarea polimorfismului la mutantele de soia utilizând markeri RAPD.
Pe parcursul elaborării tezei de doctorat ne-am străduit să dăm un răspuns cât mai
plauzibil elucidării aspectelor luate în studiu, corelând datele proprii cu multiplele sugestii
oferite de literatura de specialitate.
Prin natura sa biologică, plantă autogamă, dar cu posibilităţi de multiplicare
vegetativă, metodologia de lucru adoptată conferă posibilitatea decelării formelor biologice
ale multiplicării genotipurilor de soia, in vitro şi adaptarea neoplantulelor la efectul
mutagen al agenţilor chimici.
Crearea de variabilitate genetică prin utilizarea factorilor mutageni capabili să
amplifice frecvenţa mutaţiilor in vitro, în cazul soiei este destul de puţin menţionată în
literatura de specialitate.
Regenerarea şi oragnogeneza in vitro la unele specii de plante constituie o condiţie
esenţială pentru reuşita multiplicării plantelor respective pe cale vegetativă. Procesele de
morfogeneză şi organogeneză se realizează sub influenţa factorilor endogeni şi exogeni.
Conţinutul endogen de hormoni, tipul acestora, precum şi echipamentul enzimatic sunt
factori cu rol de reglare a regenerării. Natura fitohormonilor utilizaţi precum şi
concentraţia lor, diferenţele balanţelor hormonale au un rol important în procesele de
organogeneză.
Materialul biologic utilizat a fost constituit din trei genotipuri autohtone soia,
Diamant, Perla şi Agat, create la SCDA Turda.
Cercetările efectuate, în perioada 2006-2008, au fost realizate în Laboratorul de
biotehnologii a Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Cluj-Napoca.
Asupra materialului biologic menţionat, ne-am îndreptat atenţia privind:
optimizarea protocolului privind implicaţiile unor citochinine în morfogeneza in vitro la
soia, capacitatea de regenerare a unor tipuri de explante, de naturǎ diferitǎ ş.a., aspecte
urmărite în prima etapă a cercetărilor. Pe baza observaţiilor efectuate s-a trecut la a doua
etapă a studiilor noastre, cu privire la crearea variabilităţii genetice la soia, utilizând factori
mutageni chimici şi realizarea selecţiei in vitro pentru depistarea unor linii tolerante la ionii
de Al+.
5
Pentru prelevarea de meristeme şi inocularea acestora pe mediul de cultură în
vederea iniţierii unor culturi in vitro corespunzătoare au fost utilizate, şi cu scopul de a le
verifica eficienţa, trei medii de bază, Murashige-Skoog (MS), Gamborg (B5) şi
Lindsmaier-Skoog (LS), (vezi tabelul 1). Tabelul 1
Experienţele realizate pentru optimizarea unui protocol pentru organogeneza directă a meristemelor de soia Layout of the experiments carried out to optimize a protocol for direct organogenesis of soybean meristems
Varianta
Experiment Sursa explantelor Explant source
Cultivarul Cultivars
Mediul şi regulatori de creştere Media and plant growth regulators
I
Meristeme tulpinale şi coronare Stem and crown meristems
Diamant Perla Agat
B5 (0,2 mg/l ANA) B5 (0,2 mg/l AIA +0,2 mg/l 2iP); la 30 zile transferate pe acelaşi mediu at 30 days transferred to the same medium LS (0.004 mg/l PIC+1 mg/l K la 30 zile transferate pe RL (0.2 mg/l AIA) at 30 days transferred to RL
II Meristeme tulpinale Stem meristems
Diamant Perla Agat
MS (fără regulator de creştere-plant growth regulator free);la 15 zile transferate pe acelaşi mediu at 15 days transferred to the same medium LS (0.004 mg/l PIC+1 mg/l K la 15 zile transferate pe RL (0.2 mg/l AIA) at 15 days transferred to RL
III Meristeme tulpinale Stem meristems
Diamant Perla Agat
MS (0.004 mg/l PIC+1 mg/l K; la 15 zile transferate pe MS (0.2 mg/l AIA) at 15 days transferred to MS (0.2 mg/l AIA) LS (0.004 mg/l PIC+1 mg/l K) la 15 zile transferate pe RL (0.2 mg/l AIA) at 15 days transferred to RL
IV Meristeme tulpinale Stem meristems
Diamant Perla Agat
LS (0.003; 0.004; 0.005 mg/l PIC şi 0.5; 1.0 mg/l K) la 15 zile transferate pe RL (0.2 mg/l AIA) at 15 days transferred to RL
Legendǎ: MS = Murashige-Skoog ; B5 = Gamborg şi colab.;LS = Linsmaier-Skoog
Pentru inducerea de mutaţii in vitro, s-a utilizat un protocol similar celui folosit la
multiplicarea in vitro, adăugănd în mediul de cultură trei mutageni chimici, dietilsulfat
(DES), dimetilsulfat (DMS) în câte două concentraţii 0,2 şi 2,0 ppm şi etilmetansulfonat
(EMS) în trei concentraţii (0,3; 1,0; 2,0), (vezi tabelul 2).
Perioada tratamentului a fost condiţionată de capacitatea de absorbţie a
mutagenului de către materialul biologic tratat. După 24 de ore materialul biologic a fost
trecut pe mediu de cultură proaspăt, identic cu cel al variantei martor (mt).
6
Tabelul 2
Compoziţia mediului de cultură la Glycine max (L) Merril în vederea inducerii mutagenezei chimice Culture medium composition on Glycine max (L) Merril to induce chemical mutagenesis
Varianta Variant
Concentraţia agentului mutagen Mutagen agent concentration
(ppm)
Conţinutul în mediu Content in medium
(mg/l)
MS (1962) + chinetină 10 M (martor) (control)
AIA 0,5 MS (1962) + chinetină 10
AIA 0,5 DE1 0,2 DE 2
MS (1962) + chinetină 10 AIA 0,5 DE2 2 DE 2
MS (1962) + chinetină 10 AIA 0,5 DM1 0,2 DM 0,2
MS (1962) + chinetină 10 AIA 0,5 DM2 2 DM 0,2
0,3 MS (1962) + chinetină 10 1,0 AIA 0,5 EMS1
2,0 DM 0,2 0,3 MS (1962) + chinetină 10 1,0 AIA 0,5 EMS2 2,0 DM 0,2 0,3 MS (1962) + chinetină 10 1,0 AIA 0,5 EMS3 2,0 DM 0,2
Culturile in vitro au găsit numeroase aplicaţii practice în ameliorarea multor specii
de cultură, printre care multiplicarea genotipurilor valoroase, propagarea stocurilor libere
de viroze, conservarea resurselor genetice, crearea variabilităţii genetice ş.a.
Pornind de la dezideratele de mai sus, înaite de a aborda aspectele creării
variabilităţii genetice la soia prin mutageneză in vitro, s-a testat modul de comportare a
genotipurilor de soia, la nivelul culturilor in vitro.
7
Optimizarea protocolului în vederea organogenezei directe a meristemelor de soia a
urmărit evidenţierea comportamentului genotipurilor, sursa de explant, mediile de cultură
(MS, B5 şi LS) şi combinaţia regulatorilor de creştere, în patru variante (vezi tabelul 3). Tabelul 3
Mediul MURASHIGE-SKOOG (MS), 1962 MURASHIGE-SKOOG medium (MS), 1962
A. Soluţia de MACROELEMENTE/MACROELEMENTS solution
Concentraţia în soluţia normală Concentration in normal
solution
Soluţia STOC concentrată de 10 ori STOCK solution 10 times concentrated
mg/l mM g/l mg/1000 ml NH4NO3 1650 20,6 16,5 16.500 K NO3 1900 18,8 19,0 19.000 CaCl2 x 2H2O 440 30 Se prepară separat soluţia stoc 15 g/100 ml MgSO4x 7 H2O 370 1,5 3,7 3700 KH2 PO4 170 1,25 1,7 1700
B. Soluţia de MICROELEMENTE/MICROELEMENTS solution
Concentraţia în soluţia normală Concentration in normal
solution
Soluţia STOC concentrată de 10 ori STOCK solution 10 times concentrated
mg/l mM mg/100 ml mg/1000 ml H3BO3 6,2 100 6200 620 Mn SO4x 4H2O 22,3 100 22300 2230 ZnSO4x 7 H2O 8,6 30 8600 860 NaMoO4x 2H2O 0,25 1,0 250 25 CuSO4x 5H2O 0,025 0,1 25 2,5 CaCl x 6 H2O 0,025 0,1 25 2,5 KI 0,83 5 Se prepară separat soluţia Stoc 75 mg/100 ml
C. VITAMINE/VITAMINS solution
Concentraţia în soluţia normală Concentration in normal
solution
Soluţia STOC concentrată de 1000 ori STOCK solution 1000 times concentrated
mg/l mg/100 ml Acid nicotinic/Nicotinic acid 0,5 50 Piridoxină HCl/Piridoxine 0,5 50 Tiamină HCl/Tiamine 0,1 10 Mezo-inozitol/Mesoinositol 100 10000 D. Soluţia FeEDTA 40 Se prepară separat soluţia stoc FeSO4×7H2O 27,8 5,57 Na2EDTA 37,3 7,45 E. Soluţia de aminoacizi: Glicina/Glycine 2 F. Soluţii de REGULATORI DE CREŞTERE/GROWTH REGULATOR solution AIA/IAA 1 – 30 50,0 Chinetină/Kinetin 0,04 - 10 21,5 G. Zaharoză/Sucrose 30% H. Difco Bacto 9 Agar 10 g/l
8
S-au utilizat organe vegetative, meristeme tulpinale şi coronare, supuse
dezinfecţiei prin scufundare în etanol 70% (2’) şi în hipoclorit de sodiu 2% (7’) cu o
picătură de Tween 20/100 ml.
Observaţiile efectuate la 15, 30 şi 60 de zile de cultură au evidenţiat faptul că pe
mediul de cultură B5, suplimentat cu ANA ca sursă de auxină s-a format calus (varianta I).
Toate celelalte combinaţii de mediu şi regulatori de creştere au favorizat o creştere normală
a vitroplantulelor fără formare de calus.
S-a evidenţiat faptul că procesele de organogeneză la soia, se diferenţiază în funcţie
de sursa de explant, mediile de cultură şi combinaţia regulatorilor de creştere. Acest fapt
este reflectat de diferenţa dintre soiurile Diamant şi Perla pe de o parte, şi Agat pe de altă
parte (vezi tabelul 4). Tabelul 4
Talia lăstarilor (mm) dezvoltaţi din meristeme crescute pe mediile B5 (0,2 mg/l IAA+0.2 mg/l 2iP) şi LS (0.004 mg/l PIC+1.0 mg/l K) după 30 de zile de cultură (Varianta I)
Height (mm) of shoots developed from meristems grown on media B5 (0,2 mg/l IAA+0.2 mg/l 2iP) and LS (0.004 mg/l PIC+1.0 mg/l K) after 30 days of culture (Experiment I)
Cultivarul Cultivar
Meristeme tulpinale Stem meristems
Meristeme coronare Crown meristems
B5 LS B5 LS Diamant 5,0 5,8 5,9 8,6 Perla 4,4 5,0 5,6 ns 6,2 ns Agat 6,7 * 7,2 * 7,6 * 10,4 * Media
Average 5,4 6,0 6,4 8,4
DL 5% LSD 5% 0,51 0,63 0,54 0,76
Cultivarul Cultivar ns *
Mediul Medium ns *
Cult.×Mediu Cult.×Medium ns *
media a 3 cultivare în 3 repetiţii pe cultivar ; average of 3 cultivars, 3 replicates per cultivar ns - diferenţă nesemnificativă ; ns indicates non-significant differences * - diferenţă semnificativă (DL 5%) ; * - indicates significant differences (LSD 5%)
Compararea mediilor de cultură MS şi LS, cu acelaşi nivel al regulatorilor de
creştere, sub aspectul formării neoplantulelor, evidenţiază uşoara superioritate a mediului
LS, comparativ cu MS, cu diferenţe nesemnificative la nivelul parametrilor observaţi,
creând certitudinea că utilizarea celor două medii de cultură este propice pentru
multiplicarea in vitro a soiei (vezi tabelele 5,6).
9
Tabelul 5
Compararea mediului de cultură MS (fără regulator de creştere) şi LS (0.004 mg/l PIC+ 1,0 mg/l K pentru 15 zile, RL+0.2 mg/l AIA după 15 zile) după 60 de zile de cultură (Varianta II)
Comparison of media MS (plant growth regulators free) and LS (0.004 mg/l PIC+ 1,0 mg/l K, for 15 days, RL+0.2 mg/l IAA afterward) after 60 days of culture (Experiment II)
Cultivarul Cultivar
Număr de lăstari/meristem
Number of shoots/meristem
Număr de rădăcini/meristem
Number of roots/meristem
Înălţime (mm)
Height
Diamant Perla Agat Media MS ; Average MS Media LS ;Average LS
5,6 5,0 5,8 5,5 6,6
1,7 1,1 2,3 1,7 3,7
2,6 1,8 2,6 2,3 3,2
Media generală ; General average 6,0 2,7 2,5
Semnificaţia Signification Cultivarul Cultivar * * ns Mediul Medium * ns ns Cult.×Mediu Cult.×Medium ns ns ns DL 5% LSD 5% Cultivarul Cultivar 0,82 1,00 - Mediu Medium 0,53 - -
Tabelul 6
Compararea mediului de cultură MS şi LS cu acelaşi nivel de regulatori de creştere după 60 de zile de cultură (variantele III-IV)
Comparison of media MS and LS with similar levels of plant growth regulators after 60 days of culture (Experiments III-IV)
Cultivarul Cultivar
Număr de lăstari/meristem
Number of shoots/meristem
Număr de rădăcini/meristem
Number of roots/meristem
Înălţime (mm)
Height
MS LS MS LS MS LS Diamant Perla Agat Media Average
5,4 5,2 5,6
5,4
5,0 5,0 5,3
5,1
2,1 2,3 2,4
2,3
2,0 2,0 2,3
2,1
26,3 26,4 27,2
26,6
26,1 26,0 25,5
25,9
Semnificaţia Signification Cultivarul Cultivar * * ns Mediul Medium - ns ns Cult.×Mediu Cult.×Medium ns ns ns
DL 5% LSD 5% 0,63 1,26 1,00 Cultivarul Cultivar Mediu Medium 0,60 - -
Pentru completarea unor aspecte ale studiului anterior s-a încercat să se
aprofundeze rolul a două citochinine, benziladenina (BA) şi 2-izopentil-adenina (PiP)
asupra evoluţiei plantulelor de soia, obţinute in vitro din apex, nod, boboc floral şi pǎstǎi
juvenile, sub aspectul regenerării şi organogenezei lor (vezi tabelele 7, 8).
10
Tabelul 7 Mediile de bază folosite în cultura de soia
Composition of aseptic media in plant regeneration in soybean
Elemente (mg/l) Elements
Regenerare Regeneration
Multiplicare Multiplication
Macroelemente Macroelements MS MS
Microelemente Microelements MS MS
FeEDTA MS MS Mezo-inozitol Mezo-inozitum 100 mg 100 mg
Tiamină Tiamine 0,5 1,0
Piridoxină Pyridoxine 0,5 1,0
Acid nicotinic Nicotinic acid 0,5 1,0
Zaharoză Sucrose 30 g/l 30 g/l
Agar 7 g/l 7 g/l Sulfat de adenină (AdSO4) Adenin sulfat 40 g/l 80 mg/l
pH 5,7 5,7 MS – mediu de bază după Murashige-Skoog, 1962 MS - basal medium after Murashige-Skoog, 1962
Tabelul 8
Balanţa hormonală experimentală în cazul explantelor de soia Experimental hormonal balance for soybean meristems
Varianta Variant
Mediul de bază Basal
medium
Citochinine Cytokinines
Concentraţia Concentration
(mg/l)
Auxina Auxines
Concentraţia Concentration
(mg/l)
Adaosul Addition AdSO4 (mg/l)
Bonificare Bonus
T0 MS - - - - 40 xx
T1 MS BAP 1,0 ANA 0,5 40 xxxx
T2 MS BAP 2,0 ANA 1,0 80 xxxxx
T3 MS 2iP 1,0 ANA 0,5 40 xxxx
T4 MS 2iP 2,0 ANA 1,0 80 xxxxx
S-a constatat că apexul este capabil să regenereze plante complet formate şi cu
rădăcină. Comparativ, din nod şi boboc floral se formează mai puţine neoplantule (vezi
tabelul 9).
11
Tabelul 9
Morfogeneza in vitro a explantelor de soia, cultivate pe medii cu benzilaminopurinǎ (BAP) şi 2 izopentil-adenină (2iP)
In vitro morphogenesis of soybean explants, cultivated on media with benzylaminopurine (BAP) and 2 izopentyl-adenine (2iP)
Varianta Variant
Explant Expant
% de regenerare
Regeneration percentage
Nr. de plante No of plants
Înălţimea Height (cm)
Nr. de rădăcini
No of roots
Lungime rădăcini Roots length
Alte tipuri de ţesuturi
Other types of tissues
T0 80 1 1,5 1-2 2,5 - T1 85 2 1,0 3 2,5 - T2 90 5 1,1 5 2,0 - T3 90 2 1,3 3 2,5 - T4
Apex Apex
94 3 1,1 8 2,0 - T0 70 2 1,0 2 1,8 - T1 80 8 0,7 4 1,0 - T2 70 6 0,8 - - calus (50%) T3 82 9 1,0 5 1,5 - T4
Nod Node
88 6 0,9 - - calus (30%) T0 57 3 0,8 2 1,0 - T1 60 8 1,8 5 1,0 - T2 50 14 0,8 2 0,4 calus T3 61 10 1,5 5 0,6 - T4
Boboc Bud
50 16 0,5 5 0,5 calus T0 82 6 0,9 3 1,0 - T1 86 12 1,2 4 1,0 calus T2 93 14 1,5 3 0,5 - T3 93 10 1,6 5 0,5 - T4
Pǎstaie juvenilǎ Juvenile
pod 97 18 0,8 5 0,5 -
Efectele fito-fiziologice ale citochininelor pot fi rezumate, în funcţie de
concentraţie şi tipul acestora, ca facilitând formarea de muguraşi şi de tulpiniţe
(caulogeneză), fiind antagoniste, de regulă rizogenezei.
Am fost interesaţi de capacitatea regenerativă in vitro a cultivarelor de soia, în
funcţie de organele donatoare de explante ale plantei, natura acestora şi mediul de cultură
utilizat. Acest aspect a fost urmărit pe patru medii abreviate (T1 şi T4) care au evidenţiat
faptul că pe mediul T1 explantele provenite din nod au un procent de regenerare de 94%,
formând însă din fiecare nod 1-2 neoplantule cu un început de sistem radicular. Spre
deosebire de mediul T4, numărul plantelor pe nod este mai mic, dar au o rizogeneză
puternică (vezi tabelul 9). Se constată că evoluţia apexurilor este mai bună sub aspectul
multiplicării, decât a nodurilor şi a bobocului floral, dar cu o viabilitate mai scăzută. Cele
mai bune rezultate sub aspectul regenerǎrii, a numǎrului de plantule şi a rizogenezei se
realizeazǎ la nivelul explantelor recoltate din pǎstǎi juvenile.
12
Concluzionând cele de mai sus, se poate considera că există o strânsă corelaţie între
mediul de cultură şi aportul regulatorilor de creştere şi procesele de organogeneză şi
rizogeneză, influenţate într-o măsură mai mică de organele donatoare. Contrar acestei
situaţii, doar în cazul apexului se constată o influenţă asupra rizogenezei in vitro.
După cum s-a mai menţionat, iniţierea culturilor de ţesuturi in vitro necesită
formarea unui mediu de bază cu o anumită formulă minerală, care să suporte şi să
stimuleze o diviziune celulară rapidă a explantului meristematic. Formula minerală este
suplimentată cu auxine şi citochinine pentru a iniţia sau bloca organogeneza radicelelor sau
lăstarilor. În experienţele noastre s-au utilizat pentru eficientizarea mediilor de cultură
auxine şi citochinine. Auxinele utilizate pentru inducerea diviziunii celulare şi a
rizogenezei au fost acidul indolilacetic (AIA), acidul indolilbutiric (AIB) şi acidul alfa-
naftilacetic (ANA) în concentraţie de 0,5-2,0 mg/l. Citochininele de sinteză utilizate au
fost kinetina (K) (6-furfuril-aminopurina) şi BAP (6-benzil-aminopurina).
Pentru a evidenţia modul lor de acţiune, pe un mediu de cultură Murashige-Skoog
s-a acţionat cu hormoni de creştere individuali şi apoi prin utilizarea mai multora în mediul
de cultură de bază s-a urmărit contribuţia fiecăruia asupra neoformării de plantule in vitro.
Reacţia cultivarelor la influenţa AIA (acidul β-indoliacetic), marchează rezultate
asemănătoare, în procesul de organogeneză, cu AIB, cu diferenţa că indicii optimi în
procesele de rizogeneză şi calusogeneză se evidenţiază la concentraţia de 1,0-1,5 mg/l. În
cazul rizogenezei s-au obţinut rezultate pozitive la o concentraţie de 1,5-2,0 mg/l la toate
cultivarele de soia (vezi tabelul 10).
13
Tabelul 10
Influenţa acidului indolilacetic (AIA) asupra organogenezei neoplantulelor de soia obţinute din meristeme apicale
Influence of indole-acetic acid (IAA) on organogenesis of soybean neoplantules from apical meristeme
Evoluţia organogenezei % Evolution of organogenesis Cultivarul
Cultivar
AIA/ IAA
(mg/l) Fără dezvoltare No development
Calusogeneză Calusogenesis
Rizogeneză Risogenesis
Caulogeneză Caulogenesis
0,0 100,0 0 0 0 0,5 85 7 15 0 1,0 68 12 23 0 1,5 60 16 36 0 2,0 73 6 30 0 3,0 80 6 12 0
Diamant
% 73,2 9,4 23,2 0 0,0 100,0 0 0 0 0,5 73 10 20 0 1,0 61 16 27 0 1,5 65 9 36 0 2,0 51 12 30 0 3,0 84 3 15 0
Perla
% 66,8 10,0 25,6 0,0 100,0 0 0 0 0,5 59 16 32 0 1,0 36 17 41 0 1,5 39 12 46 0 2,0 50 8 38 0 3,0 68 2 10 0
Agat
% 50,4 11,0 33,4
X /genotip 63,5 10,2 27,4 0
Introducerea acidului β-indolilbutiric (AIB) în mediul de cultură influenţează
organogeneza la nivelul concentraţiilor de 1,0-2,0 mg/l (vezi tabelul 11).
Organogeneza, indiferent de cultivar, se reflectă mai ales asupra procesului de
rizogeneză la nivelul concentraţiilor de 0,5-2,0 mg/l. Sub aspectul calusogenezei se
constată diferenţieri genotipice; cultivarul Diamant manifestă o tendinţă sporită spre acest
fenomen, comparativ cu soiurile Perla şi Agat, situaţie inversă însă sub aspectul
caulogenezei.
14
Tabelul 11
Influenţa acidului indolilbutiric (AIB) asupra organogenezei neoplantulelor de soia obţinute din meristeme apicale
Influence of indole butyric acid (IBA) on organogenesis of soybean neoplantules from apical meristeme
Evoluţia organogenezei % Evolution of organogenesis
Cultivarul Cultivar
AIB/IBA (mg/l)
Fără dezvoltare
No development
Calusogeneză Calusogenesis
Rizogeneză Risogenesis
Caulogeneză Caulogenesis
0,0 100,0 0 0 0 0,5 50 10 27 0 1,0 55 12 23 2 1,5 55 9 36 6 2,0 45 10 32 4 3,0 65 3 14 0
Diamant
% 54 6,80 26,8 2,40 0,0 100,0 0 0 0 0,5 73 3 25 3 1,0 75 3 26 5 1,5 60 6 36 5 2,0 70 5 32 5 3,0 82 2 7 0
Perla
% 72,0 3,80 25,2 3,60 0,0 100,0 0 0 0 0,5 65 0 26 3 1,0 66 0 30 4 1,5 60 3 31 8 2,0 69 3 36 7 3,0 80 0 12 2
Agat
% 68,0 1,20 27,0 4,80
X /genotip 64,7 3,93 26,4 3,60
Spre deosebire de cele două auxine menţionate (AIA şi AIB), se constată că acidul
n-naftilacetic (ANA) are o influenţă pozitivă mai ales asupra calusogenezei (vezi tabelul
12). În cazul soiului Diamant se realizează un procent mediu de 54,2% caulogeneză,
evident superioară rezultatelor obţinute de cultivarele Perla şi Agat.
15
Tabelul 12
Influenţa acidului naftilacetic (ANA) asupra organogenezei neoplantulelor de soia obţinute din meristeme apicale
Influence of naphthaleneacetic acid (NAA) on organogenesis of soybean neoplantules from apical meristeme
Evoluţia organogenezei % Evolution of organogenesis Cultivarul
Cultivar ANA/NAA
(mg/l) Fără dezvoltare No
development
Calusogeneză Calusogenesis
Rizogeneză Risogenesis
Caulogeneză Caulogenesis
0,0 100,0 0 0 0 0,5 26 56 55 0 1,0 26 64 70 3 1,5 30 68 66 6 2,0 38 65 60 2 3,0 46 18 19 0
Diamant
% 33,2 54,2 54,0 2,2 0,0 100,0 0 0 0 0,5 23 40 63 0 1,0 32 42 60 7 1,5 30 42 68 3 2,0 30 36 53 3 3,0 49 12 20 1
Perla
% 32,8 34,4 52,8 2,8 0,0 100,0 0 0 0 0,5 30 55 50 1 1,0 36 65 50 3 1,5 42 78 46 9 2,0 48 70 45 3 3,0 56 15 21 2
Agat
% 42,4 46,6 42,4 3,6
X /genotip 36,1 48,4 49,7 2,9
Analizând efectele auxinelor artificiale asupra organogenezei soiei, se constată
reacţii diferenţiate condiţionate de genotip. De aici, ipoteza că procesul de multiplicare in
vitro trebuie individualizat, în sensul că fiecare cultivar îşi are un specific al reacţiei faţă de
activitatea hormonală, din structura mediilor de cultură.
Influenţa chinetinei (K) are un efect marcant asupra caulogenezei, la concentraţia
de 1,5-2,0 mg/l (vezi tabelul 6.11). Spre deosebire de auxinele menţionate anterior,
chinetina (K) nu are efecte rizogene, influenţând calusogeneza şi în special caulogeneza. O
creştere a concentraţie de la 0,5 la 2,0 mg/l are un efect marcant asupra fenomenului de
caulogeneză la soiul Agat.
Benzilaminopurina (BAP) evidenţiază practic acelaşi efect cu cel obţinut în cazul
utilizării chinetinei (K), cu efecte majore asupra caulogenezei, apoi a calusogenezei, şi mai
puţin asupra rizogenezei (vezi tabelul 13).
16
Tabelul 13
Influenţa chinetinei (K) şi a benzilaminopurinei (BAP )asupra organogenezei neoplantulelor de soia obţinute din meristeme apicale
Influence of kinetin (K)and of benzylamino purine (BAP on organogenesis of soybean neoplantules from apical meristeme
Evoluţia organogenezei %
Fără dezvoltare Calusogeneză Rizogeneză Caulogeneză
Cultivarul Concentraţia
chinetinei (mg /l)
K BAP K BAP K BAP K BAP 0,0 100,0 100,0 0 0 0 0 0 0 0,5 40 70 31 18 0 0 53 18 1,0 40 68 44 20 0 2 61 45 1,5 46 48 44 21 2 3 63 51 2,0 36 39 35 16 1 2 52 36 3,0 39 75 30 7 0 0 48 16
Diamant
% 40,2 60,0 36,8 16,4 0,6 1,4 54,6 33,2 0,0 100,0 100,0 0 0 0 0 0 0 0,5 43 61 38 12 0 0 50 20 1,0 40 76 38 22 1 0 63 50 1,5 32 70 53 22 1 2 60 46 2,0 28 62 36 17 1 3 50 32 3,0 36 76 29 8 0 0 42 9
Perla
% 35,8 69,0 38,8 16,2 0,6 1,0 53,0 31,4 0,0 100,0 100,0 0 0 0 0 0 0 0,5 25 60 41 20 1 0 58 17 1,0 20 60 44 22 2 1 62 46 1,5 20 53 52 23 2 3 70 58 2,0 27 58 38 15 3 3 60 47 3,0 30 70 28 6 1 0 38 18
Agat
% 11,4 60,2 40,6 17,2 1,8 1,4 57,6 37,2
X / genotip
29,1 63,1 38,7 16,6 1,0 1,3 55,1 33,9
Fitohormonii orientează procesul de dezvoltare in vitro. O valoare ridicată a
raportului auxină/citochinină, favorizează rizogeneza şi calusogeneza, iar o valoare mai
mică, duce la o proliferare a mugurilor axilari şi a organogenezei tulpinale.
S-a evidenţiat cǎ în absenţa citochininelor, dar şi a auxinelor procesul de diviziune
nu are loc. În prezenţa individualǎ a acestora în mediul de culturǎ se evidenţiazǎ procese de
organogenezǎ pe un anumit palier de dezvoltare a plantelor de soia, ceea ce impune
introducerea în procesele de organogenezǎ, în mod concomitent a unei citochinine şi a unei
auxine.
Necesitatea realizǎrii unei balanţe hormonale corespunzǎtoare, care sǎ faciliteze
organogeneza, implicǎ necesitatea tatonǎrii efectului cumulat a acestor fitohormoni.
17
Prezenţa în mediul de culturǎ a chinetinei şi auxinei favorizeazǎ procesul de
organogenezǎ. Se constatǎ însǎ, apariţia unor diferenţieri de rǎspuns în funcţie de genotip.
Soiul Agat manifestǎ cel mai favorabil rǎspuns la combinaţiile din balanţa hormonalǎ.
Cele menţionate sunt ilustrate de valorile medii procentuale ale genotipurilor,
evidenţiindu-se faptul cǎ cele mai echilibrate balanţe hormonale sunt realizate de
combinaţia K+AIA în cazul caulogenezei (Diamant 50%, Perla 50%, Agat 52,8%) şi a
rizogenezei (27% la Diamant, 25% la Perla, 27% la Agat). Rǎspunsul balanţei hormonale
evidenţiazǎ existenţa unei corelaţii negative între caulogenezǎ şi rizogenezǎ dacǎ
vizualizǎm rapoartele procentuale de concentraţie K cu cele trei auxine (AIA, AIB, ANA)
(vezi tabelul 14). Cea mai eficientǎ şi economicǎ formulǎ este K+AIA, în concentraţii de
1,0-1,5 mg/l, asigurând declanşarea organogenezei la soia. Tabelul 14
Efectul cumulat al fitohormonilor asupra organogenezei la soia Cumulative effect of phytohormones on soybean organogenesis
Cultivarul Cultivar
Variantǎ Variant
Fără diferenţieri
No differences
Calusogeneză Calusogenesis
Rizogeneză Risogenesis
Caulogeneză Caulogenesis
Diamant
K+AIA K+AIB K+ANA K+AIA+AIB+ANA
56,6 62,2 54,8 35,4
39,8 37,0 32,4 32,4
27,0 24,6 28,0 29,4
52,0 47,6 45,8 50,6
Perla
K+AIA K+AIB K+ANA K+AIA+AIB+ANA
57,4 58,6 50,6 40,0
40,8 37,6 34,6 34,0
25,6 24,2 30,2 29,6
50,6 47,4 42,6 48,8
Agat
K+AIA K+AIB K+ANA K+AIA+AIB+ANA
49,8 55,2 50,7 35,5
42,9 40,3 35,4 37,6
27,9 27,1 31,5 32,7
52,8 49,8 45,9 51,8
Efectuarea subculturilor stă la baza creşterii eficienţei de multiplicare in vitro la
soia. Ea constă în transformarea tulpiniţelor generate dintr-un inocul în micro şi minibutaşi.
Repicările derivate din cultura iniţială evidenţiază că pe parcursul ciclurilor de subcultură
apar diferenţieri ce indică reacţii genotipice diferite a cultivarelor de soia. Pe parcursul
celor trei cicluri de subculturǎ apar diferenţieri ce indicǎ reacţii genotipice. Se constatǎ în
subculturǎ cǎ din 150 de fragmente de lǎstari, provenite de la plantulele culturii iniţiale,
122 de plantule au proliferat (cca 80%) lǎstari, în subcultura a II-a au proliferat 61%, iar în
subcultura a III-a procentul proliferǎrii a fost de 40%. Rezultatele evidenţiazǎ o tendinţǎ de
senescenţǎ, pe mǎsura multiplicǎrilor în subculturǎ, tendinţǎ ce se manifestǎ prin scǎderea
procentului de proliferare (vezi tabelul 15).
Tabelul 15 Evoluţia multiplicării in vitro în subcultură a soiei
In vitro multiplication evolution in subcultivation for soybean
Cultura iniţială Initially culture
Subcultura I Subcultivation I
Subcultura II Subcultivation II
Subcultura III Subcultivation III
Plantule cu proliferare
Plantlets with proliferation
Plantule cu proliferare
Plantlets with proliferation
Plantule cu proliferare
Plantlets with proliferation
Rata plantulelor cu proliferare
Rate of plantlets with proliferation
Cultivar Cultivars
Plantule stadiul I Stage I
plantlets
Plantule cu proliferare
Plantlets with proliferation
Semnif. Significa
tion
Fragmente de lăstari Offshoot
fragments nr. %
Semnif Significa
tion
Lăstari detaşaţi
Detached offshoots nr. %
Semnif Significa
tion
Lăstari detaşaţi
Detached offshoots nr. %
Semnif Significa
tion
Total lăstari
detaşaţi Total of detached offshoots
nr. %
Semnif Significa
tion
Diamant 50 fără proliferare - 50 40 80,0 - 100 60 60,0 - 150 50 33,6 - 300 150 50,0 -
Perla 50 fără proliferare - 50 27 54,0 0 100 54 54,0 - 150 45 30,0 - 300 126 42,0 -
Agat 50 fără proliferare - 50 45 90,0 × 100 70 70,0 × 150 95 63,3 ×× 300 210 70,0 ×
Total/ media
150/ 50 150/
50 122/ 40 73,0 300/
100 184/61,3
184/ 61,3 450/
150 190/63,3
126,9/ 42,3 900/
300 486/ 162
162/ 54
DL 5% 16,3 15,7 13,4 16,0 DL 1% 20,4 21,7 19,0 28,0 DL 0,1% 32,8 32,5 28,0 35,8
În vederea realizării de mutante in vitro trebuie avute în vedere procesele şi etapele
ce trebuiesc realizate şi care se rezumă la: realizarea mutagenezei la nivel celular, utilizarea
celui mai adecvat sistem experimental, realizarea selecţiei la nivel celular, decelarea
expresiei caracterului mutant a plantulelor regenerate şi transmiterea caracterelor mutante
în descendenţă.
În procesul de mutageneză, se constată că diferitele concentraţii a factorilor
mutageni chimici determină o letalitate evidentă a plantelor. Acest fapt face necesară
cunoaşterea DL 50% (doza letală 50%). În cazul genotipurilor de soia, doza letală 50% se
situaează la nivelul variantelor cu concentraţia de 0,2-2,0 ppm a factorilor mutageni în
cazul mutagenilor DES şi DMS şi 1,0-2,0 ppm în cazul EMS (vezi tabelele 16,17,18). Tabelul 16
Efectul tratamentului cu agenţii chimici mutageni asupra viabilităţii explantelor şi determinarea dozei letale DL50% la soiul Diamant
The effect of chemical mutagenic agents on explants variability and determines the lethal dose LD50% on variety Diamant
Soiul Cultivar
Factorul mutagen
Mutagenic agent
ConcentraţiaConcentration
Nr. explante tratate
Number of treated explants
Explante viabile Viable
explants
% explante viabile
Percent of viable
explants
Explante neviabile Nonviable explants
% explante neviabile Percent of nonviable explants
v0- netratat/ untreated 100 100 100 - -
v1 = 0,001 100 98 98 2 2 v2 = 0,01 100 86 86 14 14 v3 = 0,1 100 76 76 24 24 v4 = 0,02 100 78 78 22 22 v5 = 0,2 100 54 54 46 46 v6 = 2,0 100 48 48 52 52
DES Dietilsulfat
Diethyl sulphate
v7 = 3,0 100 32 32 68 68 v0 - netratat 100 100 100 - - v1 = 0,001 100 95 95 5 5 v2 = 0,01 100 76 76 24 24 v3 = 0,1 100 71 71 29 29 v4 = 0,02 100 70 70 30 30 v5 = 0,2 100 58 58 42 42 v6 = 2,0 100 51 51 49 49
DMS Dimetilsulfat
Dimethyl sulphate
v7 = 3,0 100 30 30 70 70 v0 - netratat 100 100 100 - - v1 = 0,01 100 84 84 13 13 v2 = 0,1 100 76 76 24 24 v3 = 0,02 100 80 80 20 20 v4 = 0,2 100 68 68 32 32 v5 = 1,0 100 54 54 46 46 v6 = 2,0 100 46 46 54 54
Dia
man
t
EMS Etilmetansulfonat
Ethyl methanesulfonate
v7 = 3,0 100 23 25 75 75
3
Tabelul 17
Efectul tratamentului cu agenţii chimici mutageni asupra viabilităţii explantelor şi determinarea dozei letale DL50% la soiul Perla
The effect of chemical mutagenic agents on explants variability and determines the lethal dose LD50% on variety Perla
Soiul Cultivar
Factorul mutagen
Mutagenic agent
ConcentraţiaConcentration
Nr. explante tratate
Number of treated explants
Explante viabile Viable
explants
% explante viabile
Percent of viable
explants
Explante neviabile Nonviable explants
% explante neviabile Percent of nonviable explants
v0 - netratat 100 100 100 - - v1 = 0,001 100 91 91 9 9 v2 = 0,01 100 88 88 12 12 v3 = 0,1 100 80 80 20 20 v4 = 0,02 100 83 83 17 17 v5 = 0,2 100 57 57 43 43 v6 = 2,0 100 52 52 48 48
DES Dietilsulfat
Diethyl sulphate
v7 = 3,0 100 36 36 64 64 v0 - netratat 100 100 100 - - v1 = 0,001 100 90 90 10 10 v2 = 0,01 100 80 80 20 20 v3 = 0,1 100 76 76 24 24 v4 = 0,02 100 76 76 24 24 v5 = 0,2 100 55 55 45 45 v6 = 2,0 100 48 48 52 52
DMS Dimetilsulfat
Dimethyl sulphate
v7 = 3,0 100 30 30 70 70 v0 - netratat 100 100 100 - - v1 = 0,01 100 93 93 7 7 v2 = 0,1 100 84 84 16 16 v3 = 0,02 100 80 80 20 20 v4 = 0,2 100 77 77 23 23 v5 = 1,0 100 54 54 46 46 v6 = 2,0 100 49 49 51 51
Perla
EMS Etilmetansulfonat
Ethyl methanesulfonate
v7 = 3,0 100 27 27 63 63
4
Tabelul 18
Efectul tratamentului cu agenţii chimici mutageni asupra viabilităţii explantelor şi determinarea dozei letale DL50% la soiul Agat
The effect of chemical mutagenic agents on explants variability and determines the lethal dose LD50% on variety Agat
Soiul Cultivar
Factorul mutagen
Mutagenic agent
ConcentraţiaConcentration
Nr. explante tratate
Number of treated explants
Explante viabile Viable
explants
% explante viabile
Percent of viable
explants
Explante neviabile Nonviable explants
% explante neviabile Percent of nonviable explants
v0 - netratat 100 100 100 - - v1 = 0,001 100 92 92 8 8 v2 = 0,01 100 87 87 13 13 v3 = 0,1 100 80 80 20 20 v4 = 0,02 100 83 83 17 17 v5 = 0,2 100 56 56 44 44 v6 = 2,0 100 50 50 50 50
DES Dietilsulfat
Diethyl sulphate
v7 = 3,0 100 38 38 62 62 v0 - netratat 100 100 100 - - v1 = 0,001 100 92 92 8 8 v2 = 0,01 100 80 80 10 10 v3 = 0,1 100 76 76 14 14 v4 = 0,02 100 77 77 23 23 v5 = 0,2 100 56 56 44 44 v6 = 2,0 100 48 48 52 52
DMS Dimetilsulfat
Dimethyl sulphate
v7 = 3,0 100 31 31 69 69 v0 - netratat 100 100 100 - - v1 = 0,01 100 92 92 8 8 v2 = 0,1 100 80 80 20 20 v3 = 0,02 100 90 90 10 10 v4 = 0,2 100 78 78 22 22 v5 = 1,0 100 56 56 46 46 v6 = 2,0 100 50 50 50 50
Aga
t
EMS Etilmetansulfonat
Ethyl methanesulfonate
v7 = 3,0 100 21 21 79 79
Studiul mediului de cultură utilizat în mod obişnuit în culturile in vitro ca şi modul
în care substanţele mutagene DES, DMS şi EMSce pot influenţa dezvoltarea şi evoluţia
meristemelor in vitro, au drept punct de plecare observaţiile făcute asupra procentului de
regenerare de propagule din meristeme. Rezultatele, inclusiv a variantei netratate (mt)
evidenţiază o regenerare redusă de 14,3% de propagule formate la soiul Diamant, 14,5% la
soiul Perla şi 17,2% la soiul Agat (vezi tabelul 19).
5
Tabelul 19 Număr de propagule regenerate (%) la soiurile Diamant, Perla şi Agat
Number of regenerated propagules (%), Diamant , Perla and Agat cultivars Diamant
Varianta/ concentraţia
Variant/ x ±s x ±d
Semnif. dif. Difference
signification
r-martor/varianta r - control variant
r-doze mutageni r – mutagens
dose Martor/Control 14,3 - - - 1,000 -
DES1=0,2 14,9 1,17 +0,6 - 0,500 -
DES2=2,0 14,0 1,02 -0,3 - 0,863 -0,364
DMS1=0,2 12,7 2,63 -1,6 0 -0,500 -
DMS2=2,0 12,0 2,76 -2,3 0 -0,765 -0,688
EMS1=1,0 8,7 1,86 -5,6 000 -0,500 -
EMS2=2,0 7,8 2,33 -6,5 000 -0,480 -0,189
Media/Average 11,7 1,96 2,8
DL (LSD) 5% = 1,06 ; DL (LSD) 1% = 2,67 ; DL (LSD) 0,1% = 4,52 Perla
Varianta/ concentraţia
Variant/ x ±s x ±d
Semnif. dif. Difference
signification
r-martor/varianta r - control variant
r-doze mutageni r – mutagens
dose Martor/Control 13,7 - - 1,000 -0,239 DES1=0,2 14,5 1,26 0,8 - 0,364 DES2=2,0 14,0 1,37 0,3 - 0,500 DMS1=0,2 13,0 2,64 0,7 - 0,836 -0,463 DMS2=2,0 12,2 2,32 1,5 - 0,656 EMS1=1,0 10,4 3,46 3,3 0 0,436 -0,646 EMS2=2,0 8,5 3,10 5,2 00 0,500 Media/Average 12,10 2,35 1,96
DL (LSD) 5% = 2,36 ; DL (LSD) 1% = 4,85 ; DL (LSD) 0,1% = 5,32 Agat
Varianta/ concentraţia
Variant/ x ±s x ±d
Semnif. dif. Difference
signification
r-martor/varianta r - control variant
r-doze mutageni r – mutagens
dose Martor/Control 17,2 - - - 1,000 - DES1=0,2 17,2 - - - - - DES2=2,0 16,8 2,40 -0,4 - 0,326 -0,264 DMS1=0,2 15,6 2,11 -1,6 - 0,500 -0,536 DMS2=2,0 14,3 3,16 -2,9 0 0,743 - EMS1=1,0 11,6 3,56 -5,6 000 0,650 0,746 EMS2=2,0 9,3 5,25 -6,9 000 0,864 Media/Average 14,3 2,74 2,9
DL (LSD) 5% = 2,40 ; DL (LSD) 1% = 3,63 ; DL (LSD) 0,1% = 5,12 S-a constatat un efect de uşoarǎ stimulare a mutagenului DES1 privind formarea
neoplantulelor, mai ales în cazul concentraţiei de 0,2 ppm, mai evidentǎ la soiurile Perla şi
6
Diamant. Utilizarea mutagenului DMS determină o evidentă scădere a procentului de
propagule regenerate, pe măsura creşterii concentraţiei de la 0,2 la 2,0 ppm.
Faţǎ de efectele manifestate de mutagenii DES şi DMS, în ambele concentraţii,
introducerea în mediul de culturǎ a mutagenului EMS (1,0-2,0 ppm) evidenţiazǎ un efect
negativ vizibil asupra procesului de regenerare a propagulelor de soia, la nivelul celor trei
soiuri analizate.
Efectul negativ cel mai evident se constatǎ la soiul Diamant cu o scǎdere de cca.
50% faţǎ de martorul netratat la tendinţa de formare a propagulelor. Efecte asemǎnǎtoare
se constatǎ la soiul Perla (25% la EMS1 şi 38% la EMS2) şi 33% la EMS1 şi 46% la EMS2
la soiul Agat. Din datele prezentate rezultǎ efectul negativ al mutagenului EMS asupra
formǎrii de neopropagule de soia, fǎrǎ a trage concluzii asupra efectului mutagen.
Influenţa compoziţiei mediului de cultură asupra ratei de multiplicare constituie o
etapă deosebit de importantă în fluxul tehnologic in vitro, de care depinde realizarea într-
un timp cât mai scurt a unui număr mare de indivizi identici cu planta mamă, excluzând
variabilitatea somaclonală. În baza acestui considerent s-a urmărit modul în care
compoziţia mediului de cultură, respectiv prezenţa unor substanţe cu efecte mutagene pot
influenţa coeficientul de multiplicare. Raportată la influenţa compoziţiei chimice a
mediului de cultură, cât şi a modului de reacţie a soiurilor de soia, s-a evidenţiat un
coeficient de multiplicare superior la soiul Agat, în condiţiile unui mediu de cultură
completat cu DES, 0,2 ppm, valoarea acestuia scăzând odată cu creşterea concentraţiei
mutagenului la 2,0 ppm.
Un efect negativ, evident se semnalează sub influenţa mutagenului DMS,
amplificat odată cu creşterea concentraţiei agentului mutagen, diferenţele faţă de martorul
netratat fiind semnificativ negativ (vezi tabelul 20).
O scǎdere a ratei de multiplicare s-a obţinut în cazul includerii în compoziţia.
Comportamentul materialului biologic studiat pe cele şase variante de medii de
cultură, a fost diferit de la un genotip la altul, sub aspectul procesului de rizogeneză.
Agentul mutagen DMS, determină diferenţe foarte semnificativ negative, în ambele
concentraţii la soiul Diamant. Se evidenţiază, de fapt, un comportament similar şi al
celorlalte soiuri studiate la efectele mutagenului DMS, diferenţele faţa de martor fiind
foarte semnificativ negative. Efectul cel mai pronunţat este semnalat în variantele cu
mutagenul EMS, la nivelul celor trei genotipuri analizate (vezi tabelul 21).
7
Tabelul 20 Rata medie de multiplicare (număr de propagule/explant)
Average rate of multiplication (propagules number/explant) Diamant
Varianta/ concentraţia
Variant/ x ±s x ±d
Semnif. dif. Difference
signification
r-martor/ varianta
r - control variant
r-doze mutageni
r – mutagens dose
Martor/Control 4,8 - - 1,000 DES1=0,2 4,4 1,30 -0,4 - 0,570 DES2=2,0 4,2 0,93 -0,6 0 0,876 0,364 DMS1=0,2 3,2 1,76 -1,6 0 0,832 DMS2=2,0 2,8 1,88 -2,0 00 0,530 0,564 EMS1=1,0 2,0 1,94 -2,8 00 0,367 EMS2=2,0 1,6 2,31 -3,2 00 0,763 -0,168 Media/Average
DL (LSD) 5% = 0,6 ; DL (LSD) 1% = 2,0 ; DL (LSD) 0,1% = 3,0 Perla
Varianta/ concentraţia
Variant/ x ±s x ±d
Semnif. dif. Difference
signification
r-martor/ varianta
r - control variant
r-doze mutageni
r – mutagens dose
Martor/Control 4,7 - - 1,000 DES1=0,2 4,3 1,63 -0,3 - 0,364 DES2=2,0 4,0 1,52 -0,7 0 0,765 0,455 DMS1=0,2 3,6 2,13 -1,1 00 0,832 DMS2=2,0 3,1 2,18 -1,6 00 0,456 0,566 EMS1=1,0 3,0 2,00 -1,7 000 0,256 EMS2=2,0 2,3 1,96 -2,4 000 0,463 0,602 Media/Average
DL (LSD) 5% = 0,4; DL (LSD) 1% = 1,0 ; DL (LSD) 0,1% = 1,5 Agat
Varianta/ concentraţia
Variant/ x ±s x ±d
Semnif. dif. Difference
signification
r-martor/ varianta
r - control variant
r-doze mutageni
r – mutagens dose
Martor/Control 5,3 - - 1.000 DES1=0,2 4,8 0,86 -0,5 - 0,345 DES2=2,0 4,6 1,13 -0,7 0 0,636 0,426 DMS1=0,2 4,2 1,05 -1,1 0 0,823 DMS2=2,0 4,0 1,23 -1,3 00 0,763 0,546 EMS1=1,0 3,6 1,87 -1,7 00 0,684 EMS2=2,0 2,6 2,00 -2,7 000 0,912 0,763 Media/Average
DL (LSD) 5% = 0,7 ; DL (LSD) 1% = 1,2 ; DL (LSD) 0,1% = 2,5
8
Tabelul 21 Rizogeneza plantulelor in vitro (nr.)
Rooting of plantlets obtained by in vitro cultures
Diamant
Varianta/ concentraţia
Variant/ x ±s x ±d
Semnif. dif. Difference
signification
r-martor/ varianta
r - control variant
r-doze mutageni
r – mutagens dose
Martor/Control 6,2 - - 1,000 DES1=0,2 6,0 1,86 -0,2 - 0,236 DES2=2,0 5,6 2,15 -0,6 0 0,500 0,655 DMS1=0,2 5,6 2,02 -0,6 0 0,636 DMS2=2,0 4,8 1,98 -1,4 00 0,856 0,082 EMS1=1,0 3,1 2,14 -3,1 000 -0,736 EMS2=2,0 2,0 2,36 -4,2 000 -0,463 0,856 Media/Average
DL (LSD) 5% = 0,5 ; DL (LSD) 1% = 1,6 ; DL (LSD) 0,1% = 2,9 Perla
Varianta/ concentraţia
Variant/ x ±s x ±d
Semnif. dif. Difference
signification
r-martor/ varianta
r - control variant
r-doze mutageni
r – mutagens dose
Martor/Control 6,1 - - 1,000 DES1=0,2 6,2 1,36 +0,1 - 0,326 DES2=2,0 5,8 1,76 -0,3 - 0,500 0,633 DMS1=0,2 5,1 0,94 -1,0 0 0,626 DMS2=2,0 4,7 0,98 -1,4 0 0,536 0,545 EMS1=1,0 3,0 1,93 -2,9 000 0,784 EMS2=2,0 2,0 2,13 -3,9 000 0,812 0,836 Media/Average
DL (LSD) 5% = 0,6 ; DL (LSD) 1% = 1,8 ; DL (LSD) 0,1% = 2,9 Agat
Varianta/ concentraţia
Variant/ x ±s x ±d
Semnif. dif. Difference
signification
r-martor/ varianta
r - control variant
r-doze mutageni
r – mutagens dose
Martor/Control 5,8 - - 1,000 DES1=0,2 5,4 1,86 -0,4 0 0,436 0,436 DES2=2,0 5,0 1,76 -0,8 0 0,55 DMS1=0,2 4,8 1,94 -1,0 0 0,764 0,688 DMS2=2,0 4,3 1,03 -1,5 00 0,823 EMS1=1,0 3,0 2,04 -2,8 000 0,913 0,866 EMS2=2,0 1,8 2,00 -4,0 000 0,814 Media/Average
DL (LSD) 5% = 0,4 ; DL (LSD) 1% = 1,3 , DL (LSD) 0,1% = 2,5
9
Concluzionând comportamentul explantelor în culturile in vitro, de la prelevare
până la elaborarea radicelelor plantelor neoformate, se constată că introducerea în cultura
de bază a celor trei agenţi mutageni, provoacă modificări fenotipice la nivelul ambelor
genotipuri. Introducerea în mediul de cultură a mutagenului DMS şi EMS, în ambele
concentraţii, influenţează negativ atât neoformarea propagulelor din culturile de
meristeme, rata de multiplicare şi procesul de rizogeneză, evidenţiind faptul că
dimetilsulfatul (DMS) şi mai ales etilmetansulfonatul (EMS) sunt mutageni mai puternici,
comparativ cu efectele provocate de dietilsulfat (DES) şi ca atare ar avea capacitatea
producerii de posibile mutaţii într-un procent mai ridicat (vezi tabelele 22- 27 ). Tabelul 22
Efectul factorilor mutageni asupra soiului Diamant, în cultură in vitro, la un tratament de 48 h
Neoformare Plantule Rădăcini Medii
mutagene Concen traţia Varianţa
nr. înălţime (cm) nr.
lungime
(cm)
Observaţii: modificări fenotipice
V1 7 8,5 1 1,2 evoluţie normală, rădăcini bine dezvoltate V2 5 2,5 1 1,1 evoluţie normală M Martor V3 5 3,0 1 1,0 evoluţie normală
V1 6 1,5 1 2,4 rădăcini groase, ramificaţii secundare multe, masă de ţesut, evoluţie uniformă
V2 - - 1 0,3 ramificaţii de la colet a neoplantulelor, evoluţie neuniformă
M1 DES
0,2 ppm
V3 5 0,8 1 2,2 evoluţie neuniformă
V1 4 6,3 5 3,4 fără ramificaţii, plante de coloraţie roşietică
V2 - - - - masă de ţesut , fără neoplantule diferenţiate M2
DES 2,0 ppm
V3 3 1,0 1 2,4 rădăcini groase, nodozităţi, ramificaţii la baza coletului, evoluţie neuniformă
V1 3 7,3 1 4,5 evoluţie interesantă, rădăcini lungi, frunze adevărate, roşietice
V2 - - - - fără evoloţie M3 DMS
0,2 ppm V3 3 0,8 4 2,4 evoluţie lentă, explantele abia se înalţă V1 1 6,0 1 4,5 rădăcini lungi, pubescente V2 - - - - fără evoluţie M4
DMS 2,0 ppm V3 1 0,3 - - rădăcini multe şi ramificate, frunze
adevărate
V1 2 4,0 3 2,5 evoluţie lentǎ, normală, rădăcinǎ dezvoltatǎ
V2 1 2,8 1 1,8 evoluţie lentǎ, neuniformă M5 EMS
1,0 ppm V3 1 1,0 1 1,5 rădăcini groase, evoluţie lentǎ V1 1 3,5 1 2,0 rădăcini alungite, pubescente
V2 1 0,8 1 0,6 evoluţie lentă, fǎrǎ ramificaţie, coloraţie roşiaticǎ M6
EMS 2,0 ppm
V3 1 0,5 1 0,5 fǎrǎ neoplantule diferenţiate
10
Tabelul 23
Tabel sinoptic privind modificările macroscopice observate la soiul Diamant Overview of the macroscopic changes observed in Diamant cultivar
VARIANTELE VARIANTS
Dietilsulfat/Diethyl sulphate (DES)
Dimetilsulfat/Dimethyl sulphate (DMS)
Etilmetansulfonat/Ethyl methanesulfonate (EMS)
M1 M2 M3 M4 M5 M6
Modificări macroscopice Macroscopic
changes V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3
La nivel radicular Roots level + - - + - - - - - + - - + - - + - -
La nivel foliar Leaves level - - - - - + - - - - - + - + - - + -
La nivel tulpini ramificate Branched stems level
- - + - - + + - - + - + - - + - - -
Coloraţii roşietice Reddish color + - - + + - - - - - - - - - - - + -
Anomalii, necroze Abnormalities, necrosis
- - - - - - - + + - + - - - - - - +
Tabelul 24
Efectul factorilor mutageni asupra soiului Perla, în cultură in vitro Neoformare
Plantule Rădăcini Medii mutagene Concentraţia Varianţa
nr. înălţime (cm) nr. lungime
(cm)
Observaţii: modificări fenotipice
V1 5 6,0 3 2,4 evoluţie normală, rădăcini normale V2 5 4,0 3 2,0 evoluţie normală M Martor V3 4 4,0 3 2,0 evoluţie normală V1 3 3,2 2 2,1 evoluţie neuniformă rădăcini torsionate V2 3 2,3 - - colet ramificat, coloraţie roşietică M1
DES 0,2 ppm V3 2 2,0 1 1,8 masă de ţesut fără diferenţieri, radicele
contorsionate V1 2 3,0 1 1,8 rădăcini groase, evoluţie neuniformă V2 - - - - masă de ţesut nediferenţiat M2
DES 2,0 ppm V3 1 3,0 2 1,5 evoluţie lentă, cu tendinţe de nediferenţiere
V1 1 3,0 1 2,2 rădăcini lungi, pubescente V2 1 2,5 1 2,0 ramificaţii secundare, rădăcini torsionate M3
DMS 0,2 ppm V3 1 2,0 1 2,0 rădăcini groase, început de nodozităţi
V1 1 2,0 1 1,0 evoluţie lentă V2 1 2,5 - - masă de ţesut, fără neoplantule diferenţiate M4
DMS 2,0 ppm V3 1 2,5 1 1,2 rădăcini lungi, pubescente
V1 1 1,0 1 1,0 evoluţie lentǎ, început de ramificare V2 1 1,0 1 1,0 rădăcini ramificate, apariţie frunze M5
EMS 1,0 ppm V3 - - - 0,8 fără evoluţie
V1 - - 1 0,8 calus, radicele V2 1 0,6 1 0,5 evoluţie lentă M6
EMS 2,0 ppm V3 1 0,5 1 0,5 evoluţie lentă, ramificaţii roşietice
11
Tabelul 25
Tabel sinoptic privind modificările macroscopice observate la soiul Perla Overview of the macroscopic changes observed in Perla cultivar
VARIANTELE VARIANTS
Dietilsulfat/Diethyl sulphate (DES)
Dimetilsulfat/Dimethyl sulphate (DMS)
Etilmetansulfonat/ Ethyl methanesulfonate (EMS)
M1 M2 M3 M4 M5 M6
Modificări macroscopice
Macroscopic changes
V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 La nivel radicular Roots level + - - + - + + - - + + + - + - + - -
La nivel foliar Leaves level - - - - - - - - - - - - + + - - + -
La nivel tulpini ramificate Branched stems level
- + - - - - - - - - - - + - - - - -
Coloraţii roşietice Reddish color - - - - - - - - - - - - - - - - - +
Anomalii, necroze Abnormalities, necrosis
- + - - - - - - - - - - - - - - + +
Tabelul 26 Efectul factorilor mutageni asupra soiului Agat, în cultură in vitro,
la un tratament de 48 h Neoformare
Plantule Rădăcini Medii mutagene
Concentra ţia Varianţa
nr. înălţime (cm) nr. lungime
(cm)
Observaţii: modificări fenotipice
V1 4 6,0 1 1,2 evoluţie normală, rădăcini dezvoltate V2 3 2,0 1 1,1 evoluţie normală M Martor V3 3 2,5 1 1,0 evoluţie normală V1 4 1,0 1 2,4 ramificaţii secundare, rădăcini groase torsionate V2 - - 1 0,3 evoluţie neuniformă M1
DES 0,2 ppm V3 2 0,8 1 2,0 ramificare la colet a neoplantulelor, coloraţie
neuniformă V1 2 11,0 5 3,5 fără ramificaţii, plante cu coloraţie roşietică V2 - - - - masă de ţesut, fără neoplantule diferenţiate M2
DES 2,0 ppm V3 1 1,0 2 2,4 rădăcini foarte groase, nodozităţi, ramificaţii la
baza coletului, evoluţie neuniformă
V1 3 2,0 1 4,1 evoluţie curioasă, rădăcini lungi, frunze adevărate, roşietice
V2 - - - - fără evoluţie M3 DMS
0,2 ppm V3 3 0,5 - - evoluţie lentă, explantele abia se înalţă V1 3 7,0 1 4,5 rădăcini lungi, pubescente V2 - - - - fără evoluţie M4
DMS 2,0 ppm V3 1 0,8 6 2,0 multe rădăcini ramificate, frunze adevărate
V1 5 3,0 1 2.4 evoluţie normalǎ, rǎdǎcini dezvolatate V2 3 2.5 1 2.0 evoluţie normalǎ, rǎdǎcini groase M5
EMS 1,0 ppm V3 2 2.0 1 1.5 rǎdǎcini torsionate
V1 3 2.0 - - evoluţie neuniformǎ V2 3 0.8 1 1.0 evoluţie lentǎ, rǎdǎcini ramificate M6
EMS 2,0 ppm V3 1 0.6 1 1.7 frunze adevǎrate, roşietice
12
Tabelul 27
Tabel sinoptic privind modificările macroscopice observate la soiul Agat Overview of the macroscopic changes observed in Agat cultivar
VARIANTELE VARIANTS
Dietilsulfat/Diethyl sulphate (DES)
Dimetilsulfat/Dimethyl sulphate (DMS)
Etilmetansulfonat/ Ethyl methanesulfonate (EMS)
M1 M2 M3 M4 M5 M6
Modificări macroscopice
Macroscopic changes
V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 La nivel radicular Roots level
+ - - + + - + - + + - - - + + - - +
La nivel foliar Leaves level
- - - - - - - - - + - - - - - - - +
La nivel tulpini ramificate Branched stems level
- - + - - + + - - - - - - - - + + -
Coloraţii roşietice Reddish color
+ - - - - - - - - - - - - - + - - +
Anomalii, necroze Abnormalities, necrosis
+ - - + + - + - + + - - + + - - - -
Modificările macroscopice, somatice, sunt redate în funcţie de efectul substanţelor mutagene (notat cu + sau -).
Legenda :
M = MB – martor (după Murashige-Skoog 1962) V1 =MS1/2 (după Murashige-Skoog 1962) M1= MB+DES 0,2ppm V2 =MB+BA-0,5 mg/l+ANA-0,5 mg/l M2= MB+DES 2,0 ppm V3 = MB+Z-0,5 mg/l+AIB-0,5 mg/ M3=MB+DMS 0,2 ppm M4=MB+DMS 2,0 ppm BA = benziladenină M5=MB+EMS 1,0 ppm Z = zeatină M6=MB+EMS 2,0 ppm AIB = acid indolil butiric
ANA = acid alfa-naftil-acetic S-a constatat că agenţii mutageni influenţează puternic în prima generaţie (M0)
unele caractere cantitative. Anomaliile morfologice din M0 afectează toate organele, dar
cel mai frecvent se întâlnesc la frunze şi tulpină. Exteriorizarea fenotipică a acestora
îmbracă forme foarte diferite în funcţie de genotip şi de mărimea concentraţiei mutagenului
administrat. Importanţa ce se acordă acestor anomalii derivă din faptul că ele servesc, în
unele cazuri, la aplicarea selecţiei încă din M0, cu scopul de a obţine o frecvenţă mai mare
de mutaţii în M1. Aspectul general al neoplantulelor poate fi caracterizat prin apariţia
sporadică a unor indivizi insuficient dezvoltaţi, debili, cu frunze clorotice, tulpiniţe
contorsionate ş.a. (vezi tabelele 22 - 27).
În condiţiile desfǎşurǎrii experimentelor şi a prezentǎrii tezei de doctorat în trei ani,
intercalarea unei generaţii gametice în experienţele noastre este greu de făcut; evidenţierea
posibilelor mutante, s-a realizat în generaţia M0-1 (poate impropriu notificat) bazându-ne pe
13
considerentul că mutantele apar în celulele somatice şi se pot exterioriza chiar în anul
tratamentului. Au fost prelevate meristeme de la plantele M0 obţinute în culturile in vitro,
considerate ca ascendenţi ai generaţie M0-1 obţinută prin multiplicare vegetativă in vitro.
În aceste condiţii, s-a constatat că generaţia M0-1 a fost identică, sub aspect
comportamental cu generaţia M0, sub aspectul numărului de propagule regenerate şi a
efectelor negative imprimate de mutagenul factorii mutageni (vezi tabelele 28 ,29). Tabelul 28
Procentul de plante similar fenotipice şi plante presupuse mutante la soia The percentage of similar phenotipical plants and presumed mutant plants in soybean
Soiul DIAMANT cultivar
Varianta Variant
% de plante similar fenotipice % similar phenotipical plants
% de plante presupuse mutante
% presumed mutant plants
Bonificarea Bonification
Martor/Control 100,0 - - DES1 (0,2 ppm) 97.0 3.0 × DES2 (2,0 ppm) 88.0 12.0 × DMS1 (0,2 ppm) 73.0 27.0 ×× DMS2 (2,0 ppm) 60.0 40.0 ×× EMS1 (1,0 ppm) 41.0 59.0 ××× EMS2 (2,0 ppm) 23.0 77.0 ×××
Soiul PERLA cultivar
Varianta Variant
% de plante similar fenotipice % similar phenotipical plants
% de plante presupuse mutante
% presumed mutant plants
Bonificarea Bonification
Martor/Control 100,0 - - DES1 (0,2 ppm) 93.0 7.0 × DES2 (2,0 ppm) 81.0 19.0 × DMS1 (0,2 ppm) 68.0 32.0 ×× DMS2 (2,0 ppm) 60.0 40.0 ×× EMS1 (1,0 ppm) 38.0 42.0 ×× EMS2 (2,0 ppm) 21.0 79.0 ×××
Soiul AGAT cultivar
Varianta Variant
% de plante similar fenotipice % similar phenotipical plants
% de plante presupuse mutante
% presumed mutant plants
Bonificarea Bonification
Martor/Control 100,0 - - DES1 (0,2 ppm) 90.0 10. × DES2 (2,0 ppm) 83.0 17.0 × DMS1 (0,2 ppm) 73.0 23.0 ×× DMS2 (2,0 ppm) 61.0 39.0 ×× EMS1 (1,0 ppm) 26.0 74.0 ××× EMS2 (2,0 ppm) 16.0 84.0 ×××
14
Legendă: – fără modificări/no changes; × uşoare modificări fenotipice sub 20%/under 20% phenotipical
changes ; ××modificări până la 25%/ changes to 25% ; ××× evidente modificări peste 50%/ obvious changes over 50%
Tabelul 29 Numărul de propagule regenerate în M1 Propagule number regenerated in M1
Soiul DIAMANT cultivar
Varianta Variant x ±s x s% ±d %
Semnificaţia diferenţei
Significance Martor/Control 5,4 0,86 8,3 - 100,0 -
DES1 (0,2 ppm) 5,2 1,02 7,6 -0,2 96,3
DES2 (2,0 ppm) 4,8 1,36 7,3 -0,6 88,9 0
DMS1 (0,2 ppm) 4,3 0,96 8,9 -1,1 79,6 0
DMS2 (2,0 ppm) 3,8 0,88 9,3 -1,6 70,4 00
EMS1 (1,0 ppm) 3,2 0,93 9,0 -2,2 59,3 000
EMS2 (2,0 ppm) 2,6 0,95 8,7 -2,8 48,1 000
DL5%= 0,60 ; DL1% = 1,4 ; DL0,1% = 2,2
Soiul PERLA cultivar
Varianta Variant x ±s x s% ±d %
Semnificaţia diferenţei
Significance Martor/Control 4,8 0,88 6,8 - 100,0 -
DES1 (0,2 ppm) 4,8 0,76 7,5 - 100,0 -
DES2 (2,0 ppm) 4,5 0,90 7,3 -0,3 93,8 -
DMS1 (0,2 ppm) 4,2 0,93 8,2 -0,6 87,5 0
DMS2 (2,0 ppm) 4,2 0,76 7,9 -0,6 87,5 0
EMS1 (1,0 ppm) 4,0 0,85 9,3 -0,8 83,3 0
EMS2 (2,0 ppm) 3,8 0,92 9,0 -1,0 79,2 0
DL5%= 0,60 ; DL1% = 1,5 ; DL0,1% = 2,8
Soiul AGAT cultivar
Varianta Variant x ±s x s% ±d %
Semnificaţia diferenţei
Significance Martor/Control 5,2 1,02 7,3 - 100,0 -
DES1 (0,2 ppm) 4,8 1,13 7,3 -0,4 92,3
DES2 (2,0 ppm) 4,3 1,00 7,0 -0,9 82,7 0
DMS1 (0,2 ppm) 4,3 0,98 8,6 -0,9 82,7 0
DMS2 (2,0 ppm) 4,0 0,83 8,2 -1,2 76,9 0
EMS1 (1,0 ppm) 3,6 0,76 9,0 -1,6 69,2 00
EMS2 (2,0 ppm) 2,8 0,93 9,6 -2,4 53,8 000
DL5%= 0,80 ; DL1% = 1,4 ; DL0,1% = 2,4
15
Variabilitatea fenotipică şi diferenţierea morfologică indusă de factorii mutageni,
poate fi explicată şi prin evidenţierea la nivel cromozomal a efectelor primare ale
tratamentelor aplicate, ca urmare a producerii diferitelor modificări structurale, în
principal, în anafaza mitozei. Genotipurile analizate, Diamant, Perla şi Agat, au etalat în
principal două tipuri de aberaţii cromozomale în anafaza mitozei, anafază cu cromozomi
retardaţi şi anafaza cu punţi (vezi tabelul 30). Cercetările au pus în evidenţă specificitatea
fiecărui genotip în declaşarea aberaţiilor cromozomale.
În ceea ce priveşte efectul factorului mutagen DES, acesta realizează un procent
inferior de aberaţii cromozomale, comparativ cu ambele concentraţii ale mutagenilor DMS
şi EMS.
Aberaţiile cromozomale menţionate, evidenţiază, credem, fără echivoc, existenţa
unor fenomene mutaţionale la soia, premiză pentru crearea de noi variabilităţi genetice.
Relaţia dintre tratamentele mutagene in vitro şi frecvenţa aberaţiilor cromozomale
s-au raportat la coeficientul de regresie şi evidenţierea corelaţiilor existente dintre apariţia
celulelor aberante şi dozele de mutageni (vezi fig. 1- 3). Coeficienţii de regresie şi cei de
corelaţie sunt semnificativi, demonstrând legǎtura cauzalǎ strânsǎ dintre tratamentul cu o
anumitǎ concentraţie de mutagen utilizat şi procentul celulelor aberante obţinute.
2 2,0 3,0
Doza (ppm)
Fig .1Regresia frecvenţei aberaţiilor cromozomale la soiul Diamant sub influenţa EMS
The regression of chromosomal aberrations frequency in Diamant cultivar under the influence of EMS
16
0,2 2,0 3,0 Doza (ppm)
Fig .2 Regresia frecvenţei aberaţiilor cromozomale la soiul Perla sub influenţa EMS The regression of chromosomal aberrations frequency in Perla
cultivar under the influence of EMS
0,2 2,0 3,0
Doza (ppm)
Fig .3 Regresia frecvenţei aberaţiilor cromozomale la soiul Agat sub influenţa EMS The regression of chromosomal aberrations frequency in Agat cultivar
under the influence of EMS
Tabelul 30
Frecvenţa aberaţiilor cromozomale la soiurile de soia Diamant, Perla şi Agat în urma tratamentului cu mutageni chimici (DES, DMS, EMS)
The frequency of chromosomal aberrations in soybean Diamant , Perla and Agat cultivasr, following treatment with chemical mutagens (DES, DMS, EMS)
Celule cu aberaţii din 100 de celule observate Cells with aberrations in 100 cells observed
Total Total
Cu fragmente With fragments
Cu punţi şi fragmente With bridges and fragments
Cultivar Varianta Variant (ppm)
x s x % x s x % x s x % Mt V0 0 - - 0 0 DES V1=0,1 4,0 0,08 4,00 - - - 1,0 0,08 1,00 DES V2=0,2 8,0 0,40 8,00 2,0 0,16 2,00 1,0 0,16 2,00 DES V3=2,0 14,0 1,12 14,00 5,0 1,00 5,00 3,0 0,27 3,00 DES V4=3,0 16,0 1,18 16,00 5,0 1,25 5,00 3,0 0,39 3,00 Mt V0 0 - - - DMS V1=0,1 3,0 0,01 3,00 1,0 0,80 1,00 1,0 0,03 1,00 DMS V2=0,2 7,0 0,08 7,00 1,0 0,90 1,00 - - DMS V3=2,0 15,0 1,14 15,00 6,0 1,12 6,00 2,0 0,82 2,00 DMS V4=3,0 26,0 1,16 18,00 6,0 1,35 6,00 4,0 0,93 4,00 Mt V0 0 - - EMS V1=0,1 2,0 0,3 2,00 - - - - - - EMS V2=0,2 3,0 0,6 3,00 1,0 1,00 1,00 - - - EMS V3=2,0 42,0 1,67 42,00 21,0 1,67 21,00 5,0 1,10 5,00
DI
AM
AN
T
EMS V4=3,0 64,0 1,96 64,00 13,0 2,01 13,00 7,0 1,32 7,00 Mt V0 0 - - 0 - - 0 - - DES V1=0,1 0 - - - - - - - - DES V2=0,2 3,0 0,80 3,00 1,0 0,80 1,00 - - - DES V3=2,0 8,0 1,10 8,00 3,0 1,10 3,00 - - - DES V4=3,0 12,0 1,80 12,00 5,0 1,13 5,00 - - - Mt V0 0 - - 0 - - 0 - - DMS V1=0,1 3,0 0,63 3,00 1,0 0,75 1,00 1,0 0,68 1,00 DMS V2=0,2 4,0 0,86 4,00 1,0 0,80 1,00 - - - DMS V3=2,0 12,0 1,12 12,00 3,0 1,83 3,00 2,0 1,23 2,00 DMS V4=3,0 16,0 1,36 16,00 6,0 2,01 6,00 3,0 1,76 3,00 Mt V0 0 - 0 0 EMS V1=0,1 3,0 0,93 3,00 1,0 0,63 1,00 - - - EMS V2=0,2 6,0 2,13 6,00 2,0 1,16 2,00 1,0 0,87 1,00 EMS V3=2,0 23,0 3,26 23,00 7,0 2,36 7,00 4,0 2,16 4,00
PE
RL
A
EMS V4=3,0 41,0 3,84 41,00 13,0 3,67 13,00 7,0 2,86 7,00 Mt V0 0 - - 0 - - 0 - - DES V1=0,1 5,0 1,84 5,0 2,0 1,05 2,00 1,0 0,83 1,00 DES V2=0,2 8,0 1,97 8,0 2,0 1,16 2,00 - - - DES V3=2,0 16,0 3,64 16,0 5,0 2,10 5,00 2,0 1,11 2,00 DES V4=3,0 19,0 3,83 19,0 9,0 2,46 9,00 - - - Mt V0 0 - - 0 - - 0 - - DMS V1=0,1 3,0 1,12 3,0 - - - - - - DMS V2=0,2 9,0 2,13 9,0 2,0 1,12 2,00 2,0 1,07 2,00 DMS V3=2,0 21,0 3,67 21,0 10,0 3,16 10,00 2,0 0,86 2,00 DMS V4=3,0 30,0 4,12 30,0 7,0 2,13 7,00 3,0 1,83 3,00 Mt V0 0 - - 0 - - 0 - - EMS V1=0,1 4,0 1,32 4,0 1,0 0,68 1,00 - - - EMS V2=0,2 8,0 2,16 8,0 2,0 1,17 2,00 2,0 1,06 2,00 EMS V3=2,0 46,0 4,83 46,0 19,0 3,76 19,00 7,0 2,76 7,00
AG
AT
EMS V4=3,0 76,0 6,56 76,0 15,0 3,27 15,00 12,0 3,12 12,00
Pentru a întări cele susţinute au fost efectuate cercetări în direcţia depistării unor
linii celulare de soia, posibile mutante, ce să manifeste toleranţă la concentraţiile ridicate
de ioni de aluminiu (Al+). În vederea celor menţionate au fost utilizate calusuri embriogene
şi neembriogene de soia provenite de la un material biologic netratat şi tratat cu agenţi
mutageni chimici (DMS şi EMS). S-a constatat că mediul acid determinat de ionii de
aluminiu influenţează negativ dezvoltarea calusului prin diminuarea creşterii şi apariţia pe
zone mai mult sau mai puţin extinse a necrozelor.
Menţionǎm cǎ materialul biologic utilizat la calusare a provenit de la plantule ce au
manifestat modificǎri morfocitologice în urma tratamentului cu mutagenii DMS şi EMS,
posibil mutante.
Materialul calusat a fost diferenţiat pe mediul de culturǎ asupra cǎruia s-a acţionat
cu concentraţii diferite de ioni de aluminiu pentru a decela capacitatea lor de rezistenţǎ şi
diferenţierea pe baza analizei RAPD a variabilitǎţii genetice, ca rǎspuns la tratamentele cu
agenţii mutageni.
Din materialul presupus mutant s-au diferenţiat 10 linii calusale (tabelul 32) ce au
fost supuse efectului toxic al ionilor de aluminiu. Tabelul 32
Linii celulare supuse testului de rezistenţǎ la Al+ Cell lines under test for resistance to Al +
Varianta Variant
Provenienţa liniei calusale The origin of callus line
Varianta Variant
Provenienţa liniei calusale The origin of callus line
LC1DMS LC2DMS LC3DMS LC4DMS LC5DMS
Diamant Perla Perla Agat Agat
LC1EMS LC2EMS LC3EMS LC4EMS LC5EMS LC6EMS LC7EMS LC8EMS LC9EMS LC10EMS
Diamant Diamant Perla Agat Agat Agat Agat Agat Agat Agat
Analizând rǎspunsul culturilor calusale (tabelele 33 şi 34) se evidenţiazǎ o reacţie
pozitivǎ, de toleranţǎ la ionii de aluminiu la ambele concentraţii de ioni, de 0,5 respectiv
1,0%, la nivelul liniilor LC2DMS, LC1EMS, LC2DMS, LC6EMS, LC7EMS şi LC8EMS.
3
Tabelul 33 Creşterea calusului la genotipurile de soia pe mediul de control şi cu diferite concentraţii Al+
The soybean genotypes callus development in the control medium and with different concentrations of Al+
Concentraţia de Al+
Al+ concentration Martor (fără Al+) Control (without Al+)
0,5% 1,0% Soiul Genotype
Număr calusuri
No callus Suprafaţa calusului Callus area
(mm2) %
Suprafaţa calusului Callus area
(mm2) %
Suprafaţa calusului Callus area
(mm2) %
Diamant 95 4136 100 2100 53,2 798 19,3
Perla 95 3210 100 1396 43,5 659 17,4
Agat 98 3024 100 942 23,4 130 4,3
Tabelul 34
Dinamica creşterii calusului la genotipurile de soia provenite de la plantule probabil mutante pe medii de cultură cu concentraţii diferite de Al+
Dynamic of callus growth in genotypes of soybean probably from mutant seedlings on culture medium with different concentrations of Al+
Concentraţia în Al+
Al+ concentration Martor (0) fără Al+
Control no Al+ 0,5% 1,0% Varianta Variant
Provenienţa Origin
Nr. calusuri Callus number mm2 % mm2 % mm2 %
LC1DMS Diamant 60 3310 100,0 3330 100,6 3290 99,4
LC2DMS Perla 60 3460 100,0 3480 100,6 3390 98,0
LC3DMS Perla 60 3432 100,0 3396 99,0 3000 87,4
LC4DMS Agat 60 3120 100,0 2990 95,8 3120 100,0
LC5DMS Agat 60 2990 100,0 2990 100,0 3100 103,7
LC1EMS Diamant 60 3336 100,0 3300 98,9 3225 96,7
LC2EMS Diamant 60 3415 100,0 3384 99,1 3300 96,6
LC3EMS Perla 60 3390 100,0 3380 99,7 3250 95,9
LC4EMS Agat 60 2876 100,0 3000 104,6 2915 101,4
LC5EMS Agat 60 3030 100,0 3040 100,3 3000 99,0
LC6EMS Agat 60 3114 100,0 3100 99,6 2998 96,3
LC7EMS Agat 60 2956 100,0 3000 101,5 2889 97,7
LC8EMS Agat 60 2970 100,0 2950 99,3 2950 99,3
LC9EMS Agat 60 2868 100,0 2900 100,4 2796 97,5
LC10EMS Agat 60 3013 100,0 2987 99,1 3000 99,6
4
Studiul efectuat utilizând embrioni somatici proveniţi de la plante considerate
potenţial mutante a reconfirmat supoziţia anterioarǎ privind toleranţa la ionii de aluminiu
(tabelul 35). Tabelul 35
Efectul mediului cu ioni de aluminiu 1,0% asupra embrionilor la liniile posibil mutante de soia The effect of medium with 1,0% aluminium ions on embryos from probalbly soybean mutants
Embrioni somatici /Somatic embryos
în culturǎ purǎ/pure culture Tolerante /tolerant Varianta Variant nr. % nr. %
LC1DMS 2,0% 75 100,0 69 92,0
LC2DMS 2,0% 60 100,0 60 100,
LC3DMS 2,0% 60 100,0 58 96,7
LC4DMS 2,0% 75 100,0 70 93,3
LC5DMS 2,0% 90 100,0 88 97,8
LC1EMS 2,0% 60 100,0 60 100,0
LC2EMS 2,0% 60 100,0 60 100,0
LC3EMS 2,0% 75 100,0 72 96,0
LC4EMS 2,0% 75 100,0 70 93,3
LC5EMS 2,0% 75 100,0 68 90,7
LC6EMS 2,0% 75 100,0 75 100,0
LC7EMS 2,0% 60 100,0 60 100,0
LC8EMS 2,0% 60 100,0 60 100,0
LC9EMS 2,0% 75 100,0 79 97,3
LC10EMS 2,0% 90 100,0 88 97,8
x 75.8 100,0 74,7 96,5
Sub aspectul reacţiei genotipurilor faţă de ionii de aluminiu, soiul Agat s-a dovedit
mai tolerant, comparativ cu soiurile Diamant şi Perla.
Menţionăm că plantele rezultate din liniile celulare ce au manifestat o oarecare
toleranţă la ionii de aluminiu nu au fost testate in vivo, informaţiile obţinute rezumându-se
la rezistenţa la nivel celular faţă de stresul acid. Liniile celulare tolerante evidenţiază o
variabilitate câştigată sub aspectul toleranţei la ionii de aluminiu, iar regenerarea de plante
din aceste linii poate constitui un material de studiu interesant pentru elucidarea
mecanismului genetic şi molecular a toleranţei la ionii de aluminiu şi selecţia unor
potenţiale genotipuri adaptabile culturii pe solurile acide.
5
Tehnicile markerilor moleculari, cum ar fi analiza RAPD au fost utilizate pentru a
evidenţia efectul factorilor mutageni chimici în culturile in vitro, respectiv determinarea
polimorfismului ADN la soia. Izolarea ADN şi amplificarea PCR au evidenţiat un profil
electroforetic, constatându-se cǎ primerii OP-0-01 şi OP-0-05 au generat fragmente
polimorfice .
Schimbǎrile în ADN cauzate de factorii mutageni au avut ca rezultat detectarea
unei variabilitǎţi genetice cu ajutorul analizei RAPD. Au fost detectate douǎ forme
polimorfe din 124 de fragmente ce indicǎ un nivel ridicat mutagen.
6
B I B L I O G R A F I E S E L E C T I VĂ
ARDELEAN, M., 1979, Cercetǎri privind transmiterea ereditarǎ a caracterului “pǎstǎi terminale” şi posibilitǎţile de utilizare a acestuia în ameliorarea geneticǎ a soiei, Tezǎ de doctorat, Institutul Agronomic Cluj-Napoca
BARAKAT, H., 2004, Genetic Fingerprinting and Relationships of Six Soybeans (Glycine max L.) Cultivars Based on Protein and DNA Polymorfism, Int. J. of Agric.&Biol., vol. 6, No. 5
BARANEK, M., M. KLADEC, JANA RADDOVA, M. VACHUN, M. PIDRA, 2002, Evaluation of Genetic Diversity in 19 Glycine max (L.) Merr. Accesions Included in the Czech National Collection of Soybean Genotypes, Czech J. Genet. Plant Breed., 38(2)
CARROLL, B.J., D.L. McNEIL, P.M. GRESSHOFF, 1986, Mutagenesis of soybean (Glycine max (L.) Merr.) and the isolation of non-nodulating mutants, Plant Sci., 47
CIALÂCU, M., 1991, Parametrii care influenţeazǎ dezvoltarea in vitro a embrionilor de soia, Buletinul ARCTV, vol. I
CRISTEA, V., C. DELIU, 1993, Efectul fitohormonilor şi a zaharozei asupra inducerii şi dezvoltării calusurilor de soia, În: Lucrările celui de-al V-lea Simpozion Naţional de Culturi de Celule şi Ţesuturi Vegetale, Bucureşti (ed. Anghel I., Brezeanu A., Cachiţǎ C.D.)
GAMBORG, O.L., T. MURASHIGE, A. THORPE, K. VASIL, 1976, Plant tissue culture media, In vitro 12
HOFMANN, N.E., R. RAJA, R.L. NELSON, S.S. KORBAN, 2004, Mutagenesis of embryogenic cultures of soybean and detecting polymorphisms using RAPD markers, Biologia Plantarum 48(2)
KRAUSSE, G.W., 1986, Mutation research and mutation breeding in soybean in the German Democratic Republic, Eurosoya, 4
MARELE, DANIELA, M. SAVATTI, MARIA ZǍPÂRŢAN, 2008, Obtaining the genetical variability and improvement trough mutagenosis in vitro on soybean (Glicine max L.), Bul. USAMV Cluj-Napoca, vol. 65 (1)
MARELE, DANIELA, M. SAVATTI, 2008, Determinating the lethal dose 50 DL at soja (Soja hispida L.) under the influence of the chemical mutagene inducted in vitro, Bul. USAMV Cluj-Napoca, vol. 65 (1)
7
MARELE, DANIELA, 2008, Determining the effect of treatment with chemical mutagen agents on soybean, in culture in vitro, Analele Universitǎţii din Craiova, Agriculturǎ, vol. XXXVIII/B, Ed. Universitaria Craiova
MARELE, DANIELA, 2008, Determining the best dose of chemical agents depending on the concentration of mutagen solution in the process of soybean amelioration, Analele Universitǎţii din Craiova, Agriculturǎ, vol. XXXVIII/B, Ed. Universitaria Craiova
MARELE, DANIELA, M. SAVATTI, 2009, Modificǎrile somatice apǎrute la soia, ca efect al agenţilor mutageni chimici, Bul. USAMV Cluj-Napoca, nr. 66 (1-2)
MURASHIGE, T., 1974, Plant propagation through tissue culture, Ann. Rev. Plant. Physiol., 25
MUREŞANU, E., LEONTINA CǍTINAŞ, A. CIORLǍUŞ, D. ŞERBU, LIDIA TǍNǍSESCU, 1989, Soiul precoce de soia “Diamant”, Cereale şi plante tehnice, vol. XLI, 6
MUREŞANU, E., LEONTINA CǍTINAŞ, V. LEGMAN, ADRIANA SǍMǍRTINEAN, I. TRIFU, 2000, “Agat” un nou soi timpuriu de soia cu inserţie înaltǎ a pǎstǎilor bazale, Analele ICCPT, vol. LXVII
NICOLAE, I., 1978, Mutageneza experimentală, Ed. Ceres, Bucureşti
RAICU, P., ELENA BADEA, 1986, Cultura de celule şi biotehnologiile moderne, Ed. Ştiinţificǎ şi Enciclopedicǎ, Bucureşti
SAVATTI, M., G. NEDELEA, M. ARDELEAN, 2004, Tratat de ameliorarea plantelor, Ed. Marineasa, Timişoara
SOARE, T., 1995, Studiul determinismului genetic al caracterului de prolificitate la soia, Tezǎ de doctorat, Universitatea de Ştiinţe Agricole Bucureşti
WILCOX, J.R., J.F. CAVINS, N.C. NIELSEN, 1984, Genetic alteration of soybean oil composition by a chemical mutagen, J. amer. Oil Chem. Soc. 61
ZĂPÂRŢAN, MARIA, M. SAVATTI, ANDRA IENCIU, 2003, Induction of in vitro multiplication to “Dacia” cultivar of Trifolium repens by treatment of dietylsulfat and dimetylsulfat, An. Univ. Oradea,, vol. IX
8
UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI
MEDICINǍ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA ŞCOALA DOCTORALǍ
FACULTATEA DE AGRICULTURĂ
Ing. DANIELA CAMELIA MARELE
Influence of in vitro mutagenic chemical agents to obtain useful mutations
for breeding process in soybean (Glycine max (L.) Merril)
Abstract of PhD Thesis
Conducător ştiinţific
Prof. univ. dr. SAVATTI MIRCEA
CLUJ-NAPOCA 2009
9
Influence of in vitro mutagenic chemical agents to obtain useful mutations for
breeding process in soybean (Glycine max (L.) Merril)
Abstract of PhD Thesis
Most of the research that has been carried out in the field of vegetal vitro-cultures
over a century has revealed essential aspects related to the regeneration, the growth, the
organogenesis, the somatic embryogenesis and other phenomena manifested in tissue
structures or cell types, in relation with the composition of the culture medium and the eco-
physiological conditions in the culture containers or in the growth chambers. However,
there are still numerous aspects that have remained unknown; some refer to the factors
involved in morphogenesis (especially at cell and molecular level), some others refer to the
transmission of the newly acquired genetic information.
In vitro cultures have found, in a relatively short time, several practical applications
in breeding a large number of crop species, including soybean, regarding the multiplication
of the valuable genotypes, the propagation of virus-free stocks, the preservation of
genetical resources and so on. Moreover, the genetical variation showed by in vitro
regenerated plants (somaclonal variability), as well as the one obtained through induced
mutagenesis, could and are used to obtain valuable genotypes.
Starting from these statements, we tried, besides the summing up of the pros and
cons concerning the multiplication and the creation of in vitro genetic mutations in
soybean, to elaborate our own views within the PhD thesis entitled: Influence of in vitro
mutagenic chemical agents to obtain useful mutations for breeding process in soybean
(Glycine max (L.) Merril).
In the present PhD thesis we tried to clarify several aspects regarding the in vitro
regeneration and multiplication possibilities of soybean, the creation of genetic variability
and the selection of soybean mutants, under in vitro conditions.
In order to achieve all these, our approach refers to several major aspects which can point
out the following:
- Optimizing the protocol for direct organogenesis of soybean cultivars;
- Involvement of several cytokinines in the in vitro soybean morphogenesis;
10
- The capacity of in vitro regeneration of several types of soybean explants;
- The in vitro reaction of soybean genotypes, in meristem and callus cultures;
- Inducing in vitro mutations in soybean by using chemical mutagen agents (DES,
DMS and EMS);
- Analyzing the relationship between the mutagenic treatment and chromosomal
abnormalities;
- Using in vitro selection in order to point out several genotypes of soybean that
are tolerant to aluminum ions (Al+);
- Detecting polymorphism in soybean mutants by using RAPD markers.
During the elaboration of the PhD thesis we tried to elucidate the aspects taken into
study, correlating our own data with the multiple suggestions offered by the scientific
literature.
As soybean is an allogamous plant with possibilities of vegetative multiplication,
the methodology we applied offers the possibility of in vitro determination of the
biological forms of soybean genotype multiplication, and also of adaptation of the
neoplantlets to the mutagenic effect of the chemical agents
The creation of genetic variability by using mutagenic factors capable to amplify
the frequency of in vitro genetic mutations, in the case of soybean, is not much mentioned
in the scientific literature.
In vitro regeneration and organogenesis at some species of plants is an essential
condition to accomplish vegetative multiplication. The morphogenesis and organogenesis
processes are achieved under the influence of the endogenous and exogenous factors. The
endogenous content of hormones, their type, and also the enzymatic equipment are factors
with an important role in controlling the regeneration process. The nature of the
phytohormones used, and also their concentration, the differences of the hormonal
balances have an important role in the organogenesis processes.
The biological material used was represented by three native soybean genotypes
Diamant, Perla and Agat, created by SCDA Turda.
The research was carried out between 2006-2008, in the Biotechnology Laboratory
of the University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine of Cluj-Napoca.
11
In the first phase of the research we were interested in optimizing the protocol
regarding the implication of several cytokinins in the in vitro morphogenesis of soybean, as
well as in the regeneration capacity of several explants types. Based on the observations
we made at this stage, we passed on to the second phase of our studies, regarding the
creation of genetic variability in soybean by using chemical mutagenic factors and the use
of in vitro selection in order to identify the lines tolerant to aluminum ions (Al+).
For meristem prelevation and their inoculation on the culture media in order to
initiate the corresponding in vitro cultures, as well as for checking their effectiveness, the
following three media were used: the basic one, Murashige-Skoog (MS), Gamborg (B5)
and Lindsmaier-Skoog (LS), ( table 6.1).
In order to induce in vitro mutations, we used a protocol similar to the one used for
in vitro multiplications, only adding three chemical mutagenic agents in the culture
medium, diethyl sulphate (DES) and dimethyl sulphate (DMS) with two concentrations, of
0.5 and 2.0 ppm , and ethyl methanesulfonate (EMS) with three concentrations (0.3; 1.0;
2.0), (see table 5.2.). The treatment period was conditioned by the capacity of absorbtion of
the mutagenic agent by the biological treated material. After 24 hours the biological
material was put on the fresh culture medium, identical to the one of the control variant
(mt).
The in vitro cultures found several practical applications in breeding several crop
species, among which the multiplication of valuable genotypes,the propagation of viruse-
free stocks, the preservation of genetical resources, the creation of genetic variability etc.
Starting from the conditions previously mentioned, before approaching the aspects
of creating genetic variability in soybean through in vitro mutanogenesis, we first tested
the behavior of soybean cultivars under in vitro culture conditions.
Optimizing the protocol for direct organogenesis of the soybean meristems aimed
at highlighting the behavior of the genotypes, the source of explant, the culture media (MS,
B5 and L2) and the combination of growth regulators, in five variants (see table 5.1.). We
used vegetative organs, stem and meristems, disinfected by sinking into ethanol 70% (2’)
and sodium hypochlorite 2% (7’) with a drop of Tween 20/100 ml.
The observations made after 15, 30 and 60 days of culture pointed out the fact that on
the culture medium B5, supplemented with ANA as a source of auxine, the callus was
12
formed (variant I). All the other combinations of medium and growth regulators allowed for
a normal growth of the in vitro plants with no callus formation
There was pointed out that the organogenesis processes in soybean are different
depending on the source of the explant, the culture medium and the combination of growth
regulators. This fact is reflected by the difference between the Diamant and Perla cultivars
on the one hand, and the Agat cultivar on the other hand (see table 6.2).
By comparing the culture media MS and L2, with the same level of growth
regulators, we could notice that, from the point of view of neoplantlet formation, there is a
slight superiority of the L2 medium over the MS medium,but with insignificant differences
at the level of the observed parameters. This which draws to the conclusion that the use of
the two culture media is good for the in vitro multiplication of soybean (see tables 6.3,
6.4).
In order to complete several aspects of the previous study we tried to look into the
role of the two cytokinins, benzyl adenine (BA) and 2-izopentyl-adenine (Pip), in the
evolution of soybean plantlets obtained in vitro from apex, node, floral bud and young
pods, under the aspect of regeneration and their organogenesis (see tables 6.5, 6.6). It was
observed that the apex is capable to regenerate plants completely formed, with roots. As a
comparison, the node and the floral bud formed less neoplantlets (see table 6.7.). The
phyto-physiological effects of the cytokinins can be summed up, depending on the
concentration and their type, as facilitating the formation of buds and stems (caulogenesis),
being antagonistic, as a rule, to root formation.
We were interested in the in vitro regenerative capacity of several soybean
cultivars, depending on the explants donor, their nature and the culture medium. This
aspect was analyzed on four abbreviated culture media (T1 and T4).On T1, the explants
prelevated from nodes gave a 92-95% regeneration percentage, forming 1-2 neoplantlets
out of each node, with an initiation of the root system. Unlike the T4 medium, the number
of plants on node is lower, but with a more powerful root formation process (see table 6.7).
It was observed that the evolution of apexes was better from the point of view of
multiplication, rather than from the point of view of the nodes or the floral bud, but with
lower viability. As regards regeneration, number of plantlets and root formation, the best
results were obtained with explants originating from young pods.
13
Concluding the things mentioned above, it can be considered that there is a strong
connection between the culture medium and the contribution of the growth regulators on the
one hand, and the organogenesis and root formation processes on the other, while the
influence of the donor organs is less obvious. On the opposite, in the case of the apex only,
there can be noticed an influence upon the in vitro root formation process.
As mentioned before, the initiation of in vitro tissue cultures requires the formation
of a base culture medium with a certain mineral formula, which can stand and stimulate a
rapid cellular division of the meristematic explants. The mineral formula is supplemented
with auxines and cytokinins in order to initiate or to block the organogenesis of the roots
and sprouts. In our experiments auxines and cytokinins were used for making the culture
medium more effective. The auxines used in order to induce the cellular division process
and the root formation process were the indolyl-acetic acid (AIA), the indolyl-butyric acid
(AIB) and the alpha naphthyl acetic acid (ANA) with a concentration of 0.5-2.0 mg/l. The
synthesis cytokinins used were kinetin (K) (6 furfurylaminopurine) and BAP (6-benzyl-
aminopurine).
In order to point out their way of action on Murashige-Skoog as the culture
medium, individual growth hormones were used and then, by using several of them on the
base culture media, we observed the contribution each of them had upon the neo formation
of in vitro plantlets.
The reaction of the cultivars to the influence of AIA (β- indolyl-acetic acid), is
similar, in the process of organogenesis, to that of AIB, with the difference that the optimal
indicators in the rooting process and caulogenesis are obvious for a concentration of 1.0-
1.5 mg/l. In the case of root formation positive results were obtained with a concentration
of 1.5-2.0 mg/l for all soybean cultivars (see table 6.8).
The introduction of the AIB in the culture medium influences upon organogenesis
at the level of the concentrations of 1.0-2.0 mg/l (table 6.9). Organogenesis, irrespective of
cultivar, is mainly reflected by the root formation process at concentrations of 0.5-2.0 mg/l.
Callus formation displays genotypical differentiations, the Diamant cultivar being more
representative for this process than the other two, while for caulogenesis the situation is
reversed.
14
Unlike the two mentioned auxines (IAA and IBA), the alpha naphthyl acetic acid
(ANA) has a positive impact upon callus formation (table 6.10). The mean percentage of
caulogenesis for the Diamant cultivar is 54.2%, obviously superior to Perla and Agat.
The analysis of the effects of artificial auxines upon soybean organogenesis
reveales different reactions conditioned by the genotype. From here, the hypotesis that the
process of in vitro multiplication must be individualized, in the way that each cultivar has a
specific reaction towards the hormonal activity in the culture medium structure.
The influence of kinetin (K) has a significant effect upon the caulogenesis, at the
concentration of 1.5-2.0 mg/l (see table 6.11.). As compared to the auxines mentioned above,
kinetin (K) does not have rhyzogene effects, influencing the callus formation process and
especially caulogenesis. An increase of the concentration from 0.5 to 2.0 mg/l has a significant
effect upon the phenomenon of caulogenesis in the Agat cultivar.
Benzylaminopurine (BAP) has practically the same effect as the one obtained in the
case of kinetin usage (K), with major effects upon caulogenesis, then upon callus
formation, and , to a lower extent,upon root formation (see table 6.12).
Phytohormones orientate the in vitro development process. A high value of the
ratio between auxine/cytokinin favours root and callus formation, whereas a low value
leads to a proliferation of axilar buds and stem organogenesis.
It was noted that in the absence of both cynokinins and auxines the division process
does not take place. In the presence of one of them, certain organogenesis processes
happen, which draws to the conclusion that cytokinins and auxines should be introduced
simultaneously.
The necessity of identifying the right hormonal balance, able to facilitate
organogenesis, implies the necessity to study the summed up effect of the phytohormones.
Tables 6.13-6.15 present the effects generated by the introduction of kinetin (K)
and auxines (AIA, AIB, ANA) in the base medium (concentrations of 0.5-3.0 mg/l) upon
soybean organogenesis.
The presence of kinetin and auxine in the culture medium favors the organogenesis
process, with differentiated responses according to genotype. The Agat cultivar provided
the most favorable response to the combinations in the hormonal balance.
15
These statements are sustained by the mean percentages of the genotypes. The most
balanced combinations were K+AIA in the case of caulogenesis (Diamant 50%, Perla 50%,
Agat 52,8%) and root formation (27% - Diamant, 25% -Perla, 27% -Agat). The response of
the hormonal balance highlights the existence of negative correlations between
caulogenesis and root formation, if we analyse the percentages of K and the three auxines
(table 6.16). The most effective and also economical formula is K+AIA, in concentrations
of 1.0-1.5 mg/l, which allows for initiation of organogenesis in soybean.
The subculture method is the base of increasing the efficiency of in vitro soybean
multiplication. It consists of the transformation of the stems formed from an inocul in
micro and minicuttings. Repication derived from the initial culture points out the fact that
during the cycles of subculture there are differences which indicate different genotypic
reactions in the case of soybean cultivars. The differentiations which occur during the three
subculture cycles indicate the presence of genotypic reactions. Out of the 150 sprout
fragments originating in the plantlets of the initial culture, 122 proliferated (about 80%) in
the first subculture, 61% in the second subculture and about 40% in the third.It is noticed,
as a general rule, that advancing in subcultures leads to a senescence of the cultures which
manifest itself through a decreased proliferation process (table 6.17).
In order to create in vitro mutant it is necessary that we should follow certain
processes and stages which can be summed up in carrying out mutanogenesis at the cell
level., using the most appropriate experimental system, selecting at cell level, determining
the mutagenic trait of the regenerated plantlets and transmitting the mutant traits in
descendence.
During the mutanogenesis process, it was noticed the fact that certain
concentrations of the mutagenic factors can be lethal to the plants. This requires for
awareness of DL 50% (the lethal dose 50%). For soybean cultivars, the lethal dose 50% is
at the level of variants with 0.2-2.0 ppm concentration of mutagenic factors DES and
DMS, and1.0-2.0 ppm for EMS (tables 7.2, 7.3, 7.4).
The study of the culture medium usually used for in vitro cultures, as well as of the
way in which mutagenic substances such as DES, DMS and EMS can influence upon the
development and evolution of in vitro meristems has as a starting point the observations
made on the regeneration percentage of the meristem propagules. The results, including the
16
control, show a low regeneration rate, of 14.3% for the Diamant cultivar propagules, 14.5
% for the Perla cultivar and 17.2% for the Agat cultivar (tables 7.5-7.7).
A slight stimulation of neoplantlet formation was noticed in the case of the DES1
mutagenic factor, especially with a concentration of 0.2 ppm and mainly for the Perla and
Diamant cultivars. The use of DMS with concentrations growing from 0.2 to 2.0 ppm leads
to an obvious decrease in the percentage of regenerated propagules.
Toward the effects manifested by DES and DMS mutagens, in both concentrations,
the introduction of the mutagen EMS in the culture medium (1.0-2.0 ppm) shows a visible
negative effect on the regeneration of soybean propagules in the three analyzed varieties.
The negative effect is most obvious in the Diamond cultivar with a decrease of
about 50% as compared with the untreated control in what regards the tendency to form
propagules. Similar effects are present for the Perla cultivar (25% EMS1, 38% EMS2) and
Agat (33% EMS1, 46% EMS2). The presented data show the negative effect of the EMS
mutagen on the formation of soybean neopropagules, without drawing any conclusions on
the mutagenic effect.
The influence of the medium composition upon the multiplication rate represents
an important stage of the in vitro technological flux; based on it, we can aim at creating a
large number of individuals identical to the parent plant, in a short period of time,
excluding somaclonal variability. According to this, we observed the way in which the
culture medium, namely the presence of some substances with mutagenic effect, can
influence the multiplication coefficient. When seen in relation with the chemical
composition of the medium and the responses of the soybean cultivars, the multiplication
coefficient proved to be higher for the Agat cultivar, under the conditions of a medium
enriched with DES, 0.2 ppm, its value going down with the increase in the concentration of
the mutagen to 2.0 ppm.
An obvious negative effect occurs under the influence of DMS, and it is amplified
by the increasing of the concentration of the mutagenic agent, the differences from the
untreated control being significantly negative (tables 7.8-7.10).
The behavior related to the root formation process, observed on six different
medium variants, was different from a genotype to the other. The DMS mutagenic agent
determines very significantly negative differences, for both concentrations, in the Diamant
cultivar. Actually, similar behavior towards DMS was noticed in the case of the other
17
cultivars too, the differences to the control being very significantly negative. The strongest
effect occurs in the variants containing the EMS mutagen, in the three studied genotypes
(tables 7.11-7.13).
In conclusion, the analysis of the behavior of explants in in vitro cultures reveals
the fact that the use of mutagenic agents in the base culture produces phenotypical
modifications of both genotypes. The presence of DMS and EMS, in both concentrations,
has a negative influence upon the propagule neoformation from meristem cultures, the
multiplication rate and the root formation process, also pointing out the fact that DMS and
especially EMS are stronger mutagens, as compared to the effects of DES, and therefore
they are able to produce higher percentages of mutations (tables 7.15-7.20).
It was noticed that in the first generation (M0), mutagenic agents have a stronger
influence upon certain quantitative traits. Morphological abnormalities in M0 affect all
organs, but are more frequent in leaves and stems. The phenotypical manifestation of these
can take various forms, according to genotype and mutagen concentration. The attention
that is paid to these abnormalities can be explained by the fact that they facilitate selection
even starting with M0, with the purpose of obtaining a higher frequency of mutations in M1.
The general aspect of neoplantlets can be characterized by random occurrence of some
individuals with insufficient development, weak, with clorotic leaves, twisted steams
(tables 7.15-7.20).
Since the experiment and the thesis were carried out over three years, it would have
been too difficult to introduce a gametic stage. The possible mutants were identified in the
M0-1 generation, considering the fact that mutants occur in somatic cells and can become
manifest starting with the treatment year. We prelevated meristems from the in vitro
obtained M0 plants, which were considered to be parents of the M0-1 generation, obtained
through in vitro vegetative multiplication.
Under these conditions, it was noticed that the M0-1 generation was identical, from the
behaviour point of view, with generation M0, under the aspect of the number of regenerated
propagules and the negative effects caused by the mutagen agents (see tables 7.21-7.26).
The phenotypical variability and the morphological differentiation induced by the
mutagenic factors, may be explained also on a chromosomal level for the primary effects
of the treatments applied, as a result of the several structural changes, mainly, the mitosis
phases. The analyzed genotypes, Diamant, Perla and Agat had two types of chromosomal
18
aberrations which take place in mitosis anaphase, with retarded chromosomes and bridges
anaphase (see tables 7.27-7.29). The research pointed out the specificity of each genotype
in the chromosomal aberrations.
Regarding the effect of the mutagen factor DES, this one achieves an inferior
percentage of chromosomal aberrations, as compared to both concentrations of DMS and
EMS mutagen agents
The mentioned chromosomal aberrations point out, with no hesitation, the existence
of several mutational phenomena in soybean, which can a starting point to create new
genetic variability.
The relationship between the in vitro mutagenic treatment and the frequency of the
chromosomal abnormalities depends on the regression coefficient, and the existent
correlations between the occurrence of the aberrant cells and the mutagen doses (fig. 7.1-
7.5). The regression and correlation coefficients are significant, which proves the cause-
effect relationship between a certain concentration of mutagen and the percentage of
abnormal cells that occur.
In order to sustain these statements, there has been research in the direction of
identifying possibly mutant soybean cell lines that are tolerant to high concentrations of
aluminum ions (Al+). Embryogenic and non-embryogenic soybean callus was used, some
from untreated material and some from material that had been treated with chemical
mutagenic factors (DMS and EMS). The acid medium created by the aluminum ions has a
negative influence upon the development of the callus (decreased growth, occurrence of
necrosis).
The biological material used for callus came from plantlets which displayed
morpho-cytologic modifications as a result of the treatment with DMS and EMS.
Callus was differentiated on the culture medium, upon which certain concentrations
of aluminum ions were applied, in order to study their resistance and the genetic variability
as a result of the mutagenic treatment (RAPD analysis).
Ten callus lines were differentiated out of the possibly mutant material (table 7.30).
The toxic effect of the aluminum ions was studied on them. A positive response-tolerance
to the aluminum ions- was noticed, for both concentrations of ions (0.5 and 1.0), in the
following lines: LC2DMS, LC1EMS, LC2DMS, LC6EMS, LC7EMS and LC8EMS. The
19
study based on somatic embryos from possibly mutant plants reconfirmed the conclusion
referring to the tolerance to aluminum ions (table 7.33).
From the point of view of the genotypes reaction to the aluminum ions, the Agat
cultivar proved itself to be more tolerant than Diamant and Perla.
We mention the fact that the plants resulted from the cell lines which manifested a
certain tolerance to the aluminium ions were not tested in vivo, the information obtained
being reduced to the cell resistance towards the acid stress. Tolerant cell lines point out a
variability earned under the aspect of tolerance to the aluminium ions, and plant
regeneration out of these lines may be an interesting material to study to elucidate the
genetic and molecular mechanism of tolerance to the aluminium ions and the selection of
several potential genotypes adaptable to crops on acid soils.
The techniques based on molecular markers, such as RAPD analysis, were used for
pointing out the effect of chemical mutagenic agents upon the in vitro cultures, namely the
determination of the DNA polymorphism in soybean. DNA isolation and PCR
amplification have revealed an electrophoresis profile, as the OP-0-01 and OP-0-05
primers generated polymorphic fragments. (photos 7.7 and 7.8)
The DNA changes caused by mutagens had as a result the identification, by means
of RAPD analysis, of genetic variability. Two polymorphic forms have been identified out
of 124 fragments, which stand for a high mutagen level.