Riarrangiamento dei geni
per le Immunoglobuline e
sviluppo dei linfociti B
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• I geni che codificano i recettori per gli antigeni
(BCR e TCR) sono presenti in uno “stato” non
funzionale nella linea germinale
• Diversi eventi di ricombinazione devono avvenire
durante lo sviluppo di ciascun linfocita per rendere
funzionali questi geni
• Ciascun evento richiede l’introduzione di doppie
rotture nel DNA cromosomico
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Chromosome localization of Ig loci
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• Sia le catene leggere che le catene pesanti sono codificate da famiglie multi-geniche separate
• Nel DNA della linea germinale ciascuna famiglia multi-genica contiene diverse sequenze codificanti, dette segmenti genici, separate da regioni non codificanti
• Durante la maturazione dei linfociti B questi segmenti genici vengono riarrangiati
• Il riarrangiamento crea un esone funzionale corrispondente alla regione variabile
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La regione VL è codificata
da più di un segmento genico
• La regione variabile della catena leggera (VL) è codificata da 2 segmenti genici – segmento genico V
• codifica per i primi 95-101 a.a.
– segmento genico J • codifica per pochi a.a. (fino a 13)
Il riarrangiamento dei segmenti V e J crea un esone (VJ)
che codifica per l’intera regione VL
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VL
CL
Corrispondenza tra segmenti genici e domini Ig
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La regione VH è codificata
da più di un segmento genico
• La regione variabile della catena pesante (VH) è codificata da 3 segmenti genici – segmento genico V
– segmento genico D
– segmento genico J
Il riarrangiamento dei segmenti V, D e J crea un esone (VDJ)
che codifica per l’intera regione VH
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VH
Cm1
Cm3
Cm2
Cm4
Corrispondenza tra segmenti genici e domini Ig
Cm1 Cm2 Cm3 Cm4 TM Cyt
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Germline organization of Ig light- and
heavy-chain loci in human genome
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Riarrangiamento catena k
DNA catena k germ-line
DNA catena k riarrangiato
Trascritto primario catena k
V-J joining
Trascrizione
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Trascritto primario catena k
RNA splicing + poliadenilazione
Coda poli-A
Traduzione
mRNA catena k
Polipeptide nascente catena k
Catena k
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DNA catena H riarrangiato
Trascritto primario
DNA catena H germ line
Riarrangiamento catena pesante
D-J joining
V-DJ joining
Trascrizione
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Catena Hm Catena Hd
splicing alternativo
Trascritto primario catena H
mRNA catena H
Polipeptide nascente catena H
Catena H
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Co-espressione di IgM e IgD
• Nelle cellule B naive il trascritto primario della catena pesante contiene sia gli esoni per i domini costanti della catena m che della d – il trascritto primario non contiene esoni per altre catene pesanti (g, e, a)
• Attraverso lo splicing alternativo vengono prodotti sia mRNA per m che per d
• La cellula B naive co-esprime IgM e IgD con la stessa specificità antigenica – stesso esone VDJ per dominio variabile delle catene pesanti m e d
– catena leggera associata identica
• Le altre classi di Ig non sono mai co-espresse
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Recombination Signal Sequence, RSS
• Accanto a ciascun segmento genico sono presenti delle sequenze dette recombination signal sequences (RSS)
– 1 RSS è collocata al 3’ di ciascun segmento V
– 1 RSS è collocata al 5’ di ciascun segmento J
– 1 RSS è presente al 5’ e un’altra al 3’ di ciascun segmento D
• Queste sequenze funzionano da segnali per i processi di ricombinazione
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Recombination Signal Sequence, RSS
• Ciascuna RSS contiene
– NONAMERO: sequenza conservata non codificante di 9 nucleotidi • sito di legame per RAG1; ancora le proteine RAG al DNA
– EPTAMERO: sequenza conservata non codificante di 7 nucleotidi • aumenta legame di RAG, specifica sito di taglio
– eptamero e nonamero sono separati da uno “spacer” di 12 o 23 paia di basi
• lo spacer varia di sequenza ma la sua lunghezza è conservata e corrisponde a uno (12 bp) o due (23 bp) giri di DNA doppia elica
• la lunghezza dello “spacer” è cruciale per la ricombinazione – permette corretta giustapposizione di nonamero ed eptamero
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Sequenze RSS
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“Regola 12/23”
Un segmento genico fiancheggiato da una RSS con uno spacer di 12 bp può
ricombinare con un segmento fiancheggiato da uno spacer con 23 bp
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Il complesso della ricombinasi V(D)J
• Il complesso di enzimi che opera la ricombinazione somatica V(D)J è detto ricombinasi V(D)J
• Recombinant-Activating Genes: RAG-1 e RAG-2 – i prodotti di questi geni costituiscono la componente della ricombinasi
specifica dei linfociti (B e T) • necessari per la generazione dei recettori per l’antigene
– topi KO per uno dei due geni Rag non sviluppano linfociti B né T
• sono espressi durante lo sviluppo dei linfociti solo quando avviene il riarrangiamento dei geni per il recettore dell’antigene
• La ricombinasi V(D)J include anche enzimi espressi ubiquitariamente e coinvolti nella riparazione del DNA – DNA ligasi IV, DNA-PK (DNA-dependent protein kinase), Ku70/80,
Artemis
• La ricombinazione avviene alle giunzioni tra le sequenze RSS e le sequenze codificanti
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Recombinant-Activating Genes:
RAG-1 e RAG-2
• Proteine nucleari, altamente conservate in vertebrati
• Costituiscono la componente della ricombinasi specifica
dei linfociti (B e T)
• Necessari per la generazione dei recettori per l’antigene
• Il core di RAG-1 contiene
– regione per legame a nonamero
– regione centrale che interagisce con eptamero e RAG2
– sito catalitico per taglio DNA
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• Il core di RAG-2
– è necessario per il taglio del DNA
– interagisce con RAG1
– aumenta l’affinità di legame con il DNA
• RAG2 contiene una regione che lega la lisina 4
trimetilata dell’istone H3 (H3K4me3)
– guidando il complesso RAG nelle regioni di cromatina attiva
Recombinant-Activating Genes:
RAG-1 e RAG-2
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Fasi della ricombinazione 1
• RAG1 e RAG2
riconoscono RSS – (alla formazione del complesso
partecipano anche altre proteine)
• le RSS di un segmento V e
di uno J sono portate in
prossimità
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Segmento genico V
Segmento genico J
RSS - 1 giro
RSS - 2 giri
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Fasi della ricombinazione 2
• taglio di un filamento di
DNA da parte di RAG-1 e
RAG-2 alla giunzione
delle RSS con le
sequenze codificanti
– tra eptamero e segmento
genico codificante
Segmento genico V
Segmento genico J
RSS - 1 giro
RSS - 2 giri
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Fasi della ricombinazione 3
• l’estremità tagliata del
segmento genico codificante,
viene unita al filamento
opposto producendo una
“forcina”
• all’estremità della RSS,
viene prodotta una doppia
rottura del DNA
Segmento genico V
Segmento genico J
RSS - 1 giro
RSS - 2 giri
• Vengono reclutate altre proteine – Ku70/Ku80
• La forcina viene tagliata in posizione casuale – RAG/Artemis
– l’estremità viene poi modificata da • esonucleasi
• TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase)
• Riparo e legame delle sequenze codificanti e di quelle segnale – DNA ligasi IV
Ricombinazione 4
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Generazione della diversità anticorpale
(GOD, Generation Of Diversity)
• Molteplici segmenti genici – diverse combinazioni V-(D)-J
• Flessibilità nel processo di giunzione – aggiunta e rimozione di nucleotidi
• Combinazione di catene pesanti e leggere
• Ipermutazione somatica – in linfociti B attivati
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200 1.2x106 6x103
6x103 0.72x106
1.92x106
120
Possibili combinazioni teoriche
x
x
=
=
+
=
Figure 3-6 Variabilità degli aminoacidi nelle Ig
Regione V catena pesante Regione V catena leggera
Variabili
tà
Variabili
tà
FR, frame region HV, hyper-variable region
HV3 ha una
varibilità maggiore
di HV1 e HV2
HV3 ha una
variabilità maggiore
di HV1 e HV2
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La regione del DNA dove avviene la giunzione V(D)J
codifica per la regione ipervariabile 3 (HV3) che
corrisponde al CDR3
HV regions
HV1 HV2 HV3
HV1 HV2 HV3
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Flessibilità nel processo di giunzione:
aggiunta e rimozione di nucleotidi
• l’estremità tagliata del segmento genico codificante, viene unita al filamento opposto producendo una “forcina”
• (v. diapo precedenti)
Eptamero della RSS
Eptamero della RSS
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Flessibilità nel processo di giunzione:
aggiunta e rimozione di nucleotidi
(P-addition)
• Il taglio della forcina genera un filamento singolo
• Gli enzimi di riparazione aggiungono nucleotidi complementari a questa sequenza generando una sequenza palindromica – P-nucleotidi
• Variazioni nella posizione del taglio della forcina generano variazioni in questa sequenza
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• Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) aggiunge fino a 15 nucleotidi alle giunzioni D-J e V-DJ.
• I nucleotidi aggiunti generano sequenze randomiche
• La N-addition contribuisce largamente alla variabilità del CDR3 della catena pesante
Flessibilità nel processo di giunzione:
aggiunta e rimozione di nucleotidi
(N-addition)
• La N addition si verifica quasi
esclusivamente nella catena pesante
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Ig TCRab
Diversità totale
(combinazioni
V(D)J e catene
L/H + diversità
giunzioni N/P
addition)
1011 1016
Tuttavia, in un determinato momento ciscun individuo ha un
repertorio di circa 107 cloni B e T
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Esclusione allelica
• Ciascuna cellula B esprime i geni riarrangiati
della catena pesante di un solo cromosoma e
i geni riarrangiati della catena leggera di un
solo tipo (k o l) e di un solo cromosoma
– esclusione allelica
• Assicura che una cellula B funzionale
esprima una sola catena pesante e una sola
leggera
una sola specificità antigenica
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Esclusione allelica in singole cellule B
I due aplotipi diversi sono espressi
in cellule diverse
Ceppo di aplotipo “a/a” per la catena pesante delle Ig
Ceppo di aplotipo “b/b” per la catena pesante delle Ig
Ibrido F1 di aplotipo “a/b” per la catena pesante delle Ig
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