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Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Caracterização molecular de um fitoplasma associado ao superbrotamento
do melão-de-São-Caetano (Momordica charantia L) com base nas
sequências dos genes 16S rRNA e secY
Elizeu Merizio Munhoz
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestre em Ciências. Área de concentração:
Fitopatologia
Piracicaba
2012
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Elizeu Merizio Munhoz
Engenheiro Agrônomo
Caracterização molecular de um fitoplasma associado ao superbrotamento do melão-de-
São-Caetano (Momordica charantia L) com base nas sequências dos genes 16S rRNA e
secY
Orientador:
Prof. Dr. IVAN PAULO BEDENDO
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestre em Ciências. Área de concentração: Fitopatologia
Piracicaba
2012
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação DIVISÃO DE BIBLIOTECA - ESALQ/USP
Munhoz, Elizeu Merizio Caracterização molecular de um fitoplasma associado ao superbrotamento do
melão-de-São-Caetano (Momordica charantia L) com base nas sequências dos genes 16S rRNA e secY / Elizeu Merizio Munhoz.- - Piracicaba, 2012.
63 p: il.
Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, 2012.
1. Curcubitaceae 2. Fitoplasma 3. Marcador molecular 4. Melão de São Caetano 5. Mollicutes I. Título
CDD 632.32 M966c
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
3
A Deus e Nossa Senhora Aparecida por sempre estarem nos abençoando e protegendo,
Aos meus pais José Roberto e Estela Merizio, pelo amor, educação e incentivo,
A minha noiva Michelly Silva, por sempre estar ao meu lado nos momentos difíceis, amando,
respeitando e incentivando,
A minha vó Edith M. Merizio (in memorian), por ter sido sempre tão carinhosa e inteligente.
DEDICO.
“Só existem dois dias no ano que nada pode ser feito. Um se chama ontem e o outro se chama
amanhã, portanto hoje é o dia certo para amar, acreditar, fazer e principalmente viver”.
Dalai Lama
A toda minha família em especial meus irmãos Rocco, Pablo e Kelli, meu cunhado Vander e
minha cunhada Simone, aos meus sobrinhos Maria Geovanna, Lucas Gabriel, João Ernesto,
Marcos Vinicius e Pedro Henrique pelo apoio e incentivo nos momentos difíceis, OFEREÇO.
4
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AGRADECIMENTOS
A Deus e Nossa Senhora Aparecida pelas bênçãos concedidas a toda a minha família.
Aos meus pais José Munhoz e Estela Merizio por todo o amor, carinho, respeito e
educação, meus heróis!
A minha noiva Michelly Silva por todo o apoio na realização desse trabalho, sempre
ao meu lado, amando, respeitando e dando força para nunca desistir dos nossos sonhos, amo
você!
A toda a minha família em especial aos meus irmãos Rocco, Pablo e Kelli, aos meus
cunhados Vander e Simone, pelo apoio, incentivo e carinho.
A Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, em especial ao Departamento de
Fitopatologia pela oportunidade da realização do mestrado.
Ao Prof. Dr. Ivan Paulo Bedendo pela orientação, ensinamentos, humildade, paciência
e por ter sido tão receptivo quando cheguei a Piracicaba fazendo toda a diferença.
Aos Professores e funcionários do Departamento de Fitopatologia, pela amizade e
ensinamentos, em especial ao Prof. Dr. Nelson Massola, Prof. Dr. Jorge Rezende, Prof. Dr
Francisco Tanaka, Renato Salaroli, José Edivaldo e Fabiana Wolak, por sempre estarem
dispostos a ajudar.
As pessoas que contribuíram para o desenvolvimento desse trabalho; Daniela Flôres,
Thays Benites, Rafaela Roma, Patricia Kreyci, Ana Paula, Laura Garita em especial Evandro
Ganem e Pedro Floresta, pela amizade, companheirismo e apoio.
Ao Prof. Dr. Luis Fernando C. Ribeiro por me incentivar a fazer o mestrado.
A todos os alunos do programa, em especial o Pedro Javier pelo apoio quando cheguei
a Piracicaba, tenho certeza que levarei grandes amizades.
Aos meus amigos de Alta Floresta por sempre estarem torcerem por mim, em especial
ao Tonicão, Margot, Martin, Dudu e Chico pela amizade verdadeira.
Aos amigos que fiz no Cena, em especial aos guerreiros do CENA FC, Baiano,
Evandro, Robinho, Geraldo, Baxote, Outro, Marcandalli, Gaúcho, Marcão, Flavio, Bob,
Hugão, Pavinato, Roger, Gabriel, Renato, Jordão, Thiagão, Pedro Floresta pelos anos que
jogamos juntos.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico pela bolsa
concedida nesses anos de mestrado.
MUITO OBRIGADO
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SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................................................................... 9
ABSTRACT ............................................................................................................................. 11
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................. 13
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................. 17
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 19
2 DESENVOLVIMENTO ........................................................................................................ 21
2.1 Revisão Bibliográfica ......................................................................................................... 21
2.1.1 Fitoplasmas ...................................................................................................................... 21
2.1.1.1 Detecção e classificação ............................................................................................... 22
2.1.2 Melão-de-São-Caetano .................................................................................................... 24
2.1.2.1 Doenças em melão-de-São-Caetano ............................................................................. 26
2.2 Material e Métodos ............................................................................................................. 27
2.2.1Amostras de plantas .......................................................................................................... 27
2.2.2 Extração de DNA total .................................................................................................... 28
2.2.3 PCR para detecção de fitoplasma .................................................................................... 29
2.2.4 Identificação de fitoplasmas por PCR ............................................................................. 30
2.2.5 Sequenciamento da região dos genes 16S rRNA e secY e análise das sequências .......... 31
2.2.6 Análise de RFLP in silico ................................................................................................ 31
2.2.7 Detecção por microscopia eletrônica de transmissão ...................................................... 31
2.2.8 Análise filogenética ......................................................................................................... 32
2.2.9 Fitoplasmas que foram utilizados neste trabalho. ............................................................ 32
2.3 Resultados e Discussão ....................................................................................................... 33
2.3.1 Detecção de fitoplasmas por PCR ................................................................................... 33
2.3.2 Identificação do fitoplasma por PCR .............................................................................. 36
2.3.3 Detecção por microscopia eletrônica ............................................................................... 38
2.3.4 Análise das sequências nucleotídicas .............................................................................. 39
2.3.4.1 Análise das sequências do gene 16S rRNA .................................................................. 39
2.3.4.2 Análise de RFLP in silico das sequências do gene secY .............................................. 40
2.3.4.2 Analise filogenética ...................................................................................................... 47
3 CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 49
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 51
APÊNDICES ............................................................................................................................ 61
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RESUMO
Caracterização molecular de um fitoplasma associado ao superbrotamento do melão-de-
São-Caetano (Momordica charantia L) com base nas sequências dos genes 16S rRNA e
secY
O melão-de-São-Caetano (Momordica charantia L) é uma cucurbitácea que ocorre em
todas as regiões geográficas brasileiras. A espécie apresenta duas “variedades” distintas,
comumente conhecidas por “variedade silvestre” e “variedade cultivada”, esta última
caracterizada por plantas de maior tamanho. Plantas da “variedade selvagem” são hospedeiras
de um fitoplasma do grupo 16SrIII-J, que causa superbrotamento de ramos, nanismo
generalizado, clorose, redução no tamanho de folhas e frutos. No entanto, não há informação
da “variedade cultivada” ser hospedeira de fitoplasmas. Assim, no presente estudo, plantas
sintomáticas desta “variedade” foram analisadas quanto à presença de fitoplasmas em seus
tecidos, visando associar este tipo de patógeno à doença. Neste mesmo trabalho, os isolados
do fitoplasma encontrados nas plantas sintomáticas da “variedade cultivada” foram
molecularmente analisados em relação ao gene secY, atualmente usado como um marcador
que permite identificar variações genéticas sutis. Buscou-se, com isto, identificar possíveis
variantes entre os isolados. Amplificações de fragmentos de DNA a partir dos genes 16S
rRNA (1,2Kb) e secY (1,6Kb) demonstraram a associação de fitoplasma do grupo 16SrIII com
as plantas sintomáticas de melão-de-São-Caetano da “variedade cultivada”. Nestas plantas,
corpúsculos pleomórficos, típicos de fitoplasmas, foram visualizados no floema dos tecidos
doentes, confirmando os resultados dos testes moleculares. Análises de RFLP virtual,
conduzidas com o fragmento genômico correspondente ao gene secY e diversas enzimas de
restrição, permitiram identificar o referido fitoplasma como pertencente ao subgrupo 16SrIII-
J. A análise filogenética evidenciou que o fitoplasma padrão do subgrupo 16SrIII-J emergiu
do mesmo ramo que o fitoplasma identificado no melão-de-São-Caetano, confirmando que
ambos estão estritamente relacionados. O emprego do gene secY como marcador para
diferenciação fina entre fitoplasmas não apontou variabilidade genética entre os isolados do
fitoplasma detectado tanto nas plantas da “variedade cultivada” como naquelas pertencentes à
“variedade selvagem”. Como conclusão, a “variedade cultivada” de M. charantia é
hospedeira do mesmo fitoplasma encontrado na “variedade selvagem”, o qual é afiliado ao
subgrupo 16SrIII-J; por sua vez, o gene seY não distinguiu geneticamente os isolados do
fitoplasma pertencente ao subgrupo 16SrIII-J, presentes nas plantas de melão-de-São-
Caetano.
Palavras-chave: Mollicutes; Amarelos; Cucurbitaceae; RFLP virtual
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ABSTRACT
Molecular characterization of a phytoplasma associated with Momordica charantia
witches’-broom based on the sequences of the genes 16S rRNA and secY
Momordica charantia is a species of the family Cucurbitaceae that occurs in all
Brazilian geographic regions. This species presents two distinct “varieties”, commonly called
“wild variety” and “cultivated variety”, whose plants are bigger than those belonging to the
“wild variety”. Plants of the “wild variety” are hosts of a phytoplasma of the group 16SrIII-J,
which is associated with shoot proliferation, stunting, chlorosis, and small leaves and fruits.
However, there is no information about the occurrence of phytoplasmas in plants of the
“cultivated variety”. Thus, in the present study, symptomatic plants belonging to this
“variety” were analysed in order to associate phytoplasmas with the disease. In addition,
strains of the phytoplasma found in symptomatic plants of the “cultivated variety” were
molecularly analyzed in relation to the gene secY, which is currently used as a marker for
identification fine of genetic diversity, aiming provide elements for construction of new
schemes for classification of phytoplasmas. The objective was to identify distinct strains
among the strains present in plants of the wild and cultivated varieties. Amplifications of
DNA fragments from the genes 16Sr rRNA (1.2Kb) and secY (1.6Kb) demonstrated the
association of a phytoplasma of group 16SrIII with the symptomatic plants belonging to
“cultivated variety”. These plants revealed the presence of pleomorphic bodies, typical of
phytoplasmas, which was visualized in the phloem vessel from diseased tissues, confirming
the results obtained by molecular assays. Virtual RFLP analysis, performed with the genomic
fragment corresponding to the gene secY and various restriction enzymes, allowed to identify
this phytoplasma as a member of the subgroup 16SrIII-J. Phylogenetic analysis revealed that
the phytoplasma used as reference for 16SrIII-J subgroup and the phytoplasma identified in
plants of M. charantia emerged from the same branch, confirming that both phytoplasmas are
closely related. The gene secY, used as marker for fine differentiation of phythoplasmas, did
not show genetic variability among the strains of the phytoplasma detected both plants
belonging to “cultivated variety” and “wild variety”. In conclusion, plants of the “cultivated
variety” are hosts of the same phytoplasma found in the “wild variety, which is affiliated with
the 16SrIII-J subgroup; in addition, the gene secY did not distinguish isolates of the
phytoplasma belonging to 16SrIII-J subgroup, present in plants of M. charantia.
Keywords: Mollicutes; Yellows, Cucurbitaceae; Virtual RFLP
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Comparativo das duas variedades de melão-de-São-Caetano (Momordica charantia
L). MS= variedade silvestre; MC= variedade cultivada....................................... 26
Figura 2 – Sintomas em plantas de melão-de-São-Caetano. Letras: A= má formação dos
frutos; B= redução do limbo foliar e nanismo (planta da direita); planta
assintomática (à esquerda); C= enrugamento da lâmina foliar e D= clorose........ 28
Figura 3 – Detecção de fitoplasmas em amostras de plantas de melão-de-São-Caetano por
meio da amplificação de fragmentos de DNA de 1,2 Kb, em reações de duplo
PCR conduzidas com os iniciadores P1/ P7 e R16F2n/R2. M = Marcador (1 Kb
Ladder); P1 a P5= amostras de DNA extraído de plantas de melão-de-São-
Caetano do tipo silvestre; P6 a P12= amostras de DNA extraído de plantas de
melão-de-São-Caetano do tipo cultivado; C+= padrão positivo da reação (vinca);
C-= padrão negativo (mix da reação+ água)........................ ... ............................. 35
Figura 4 – Detecção de fitoplasmas em amostras de plantas de melão-de-São-Caetano por
meio da amplificação de fragmentos de DNA de 1,6 Kb, em reações de duplo
PCR conduzidas com os iniciadores L15-F1A(III)/Map-R1A(III), e SecY-
F1(III)/SecY-R1(III). M = Marcador (1 Kb Ladder); P1 a P5= amostras de DNA
extraído de plantas de melão-de-São-Caetano do tipo silvestre. P6 a P12=
amostras de DNA extraído de plantas de melão-de-São-Caetano do tipo cultivado.
C+= padrão positivo da reação (chuchu); C-= padrão negativo (mix da
reação+água)......................................................................................................... 35
Figura 5 – Identificação de fitoplasmas em amostras de plantas de melão-de-São-Caetano por
meio da amplificação de fragmentos de DNA de 0,8 Kb, em reações de duplo
PCR conduzidas com os primers P1/P7 e R16(III)F2/ R16(III)R1. M = Marcador
(1 Kb Ladder); P1 a P5= amostras de DNA extraído de plantas de melão-de-São-
Caetano do tipo silvestre. P6 a P12= amostras de DNA extraído de plantas de
melão-de-São-Caetano do tipo cultivado. C+= padrão positivo da reação (chuchu);
C-= padrão negativo (mix da reação+água).. ............................. .......................... 37
Figura 6 – Identificação de fitoplasmas em amostras de plantas de melão-de-São-Caetano por
meio da amplificação de fragmentos de DNA de 1,1Kb, em reações de duplo PCR
conduzidas com os primers P1/P7 e R16(I)F1/R16(I)R1. M = Marcador (1 Kb
Ladder); P1 a P5= amostras de DNA extraído de plantas de melão-de-São-
Caetano do tipo silvestre. P6 a P12= amostras de DNA extraído de plantas de
14
melão-de-São-Caetano do tipo cultivado. C+= padrão positivo da reação (milho);
C-= padrão negativo (mix da reação+água).......................................................... 38
Figura 7 – Corpúsculos pleomórficos, observados ao microscópio eletrônico de transmissão,
presentes no lúmen de elemento de floema de planta sintomática de melão-de-
São-Caetano .. ....................................................................................................... 39
Figura 8 – Padrões de restrição de RFLP gerados pela digestão in silico de fragmentos de
DNA correspondentes à região do gene secY de fitoplasmas representantes do
grupo 16SrIII. Enzimas de restricão: AluI, BamHI, BfaI,BstUI, DraI, EcoRI,
HaeIII, HhaI, HinfI, HpaI,HpaII, KpnI, MboI, MseI, RsaI, SspI, TaqI, Tsp509I.
M=marcador φX174-DNA HaeIII digest. Fitoplasmas: CX (16SrIII-A), CYE
(16SrIII-B), PTB (16SrIII-C), GR1 (16SrIII-D), SP1 (16SrIII-E), MW1 (16SrIII-
F), WWB (16SrIII-G), JR1Ph
(PoiBI)................................................................................................................... 42
Figura 9 – Padrões de restrição de RFLP gerados pela digestão in silico de fragmentos de
DNA correspondentes à região do gene secY de fitoplasmas representantes do
grupo 16SrIII e do fitoplasma encontrado nas plantas de melão-de-São-Caetano.
Enzimas de restricão: AluI, BamHI, BfaI,BstUI, DraI, EcoRI, HaeIII, HhaI, HinfI,
HpaI,HpaII, KpnI, MboI, MseI, RsaI, SspI, TaqI, Tsp509I. M=marcador φX174-
DNA HaeIII digest. Fitoplasmas: MWB (16SrIII-J), MT117 (16SrIII-M), AKpot6
(16SrIII-N), ChWB (16SrIII-J)............................................................................. 43
Figura 10 – Mapas putativos de sítios de restrição envolvendo a região do gene secY de
fitoplasmas pertencentes ao grupo 16SrIII. Enzimas de restricao: AluI, BamHI,
BfaI,BstUI, DraI, EcoRI, HaeIII, HhaI, HinfI, HpaI,HpaII, KpnI, MboI, MseI,
RsaI, SspI, TaqI, Tsp509I. Fitoplasmas: CX (16SrIII-A), CYE (16SrIII-B), PTB
(16SrIII-C), GR1 (16SrIII-D), SP1 (16SrIII-
E)........................................................................................................................... 44
Figura 11 – Mapas putativos de sítios de restrição envolvendo a região do gene secY de
fitoplasmas pertencentes ao grupo 16SrIII e do fitoplasma identificado em plantas
de melão-de-São-Caetano. Enzimas de restricao: AluI, BamHI, BfaI,BstUI, DraI,
EcoRI, HaeIII, HhaI, HinfI, HpaI,HpaII, KpnI, MboI, MseI, RsaI, SspI, TaqI,
Tsp509I. Fitoplasmas: MW1 (16SrIII-F), WWB (16SrIII-G), JR1Ph (PoiBI)
(16SrIII-H), MWB (16SrIII-J), MT117 (16SrIII-
M).......................................................................................................................... 45
15
Figura 12 – Mapas putativos de sítios de restrição envolvendo a região do gene secY de
fitoplasmas pertencentes ao grupo 16SrIII. Enzimas de restricao: AluI, BamHI,
BfaI,BstUI, DraI, EcoRI, HaeIII, HhaI, HinfI, HpaI,HpaII, KpnI, MboI, MseI,
RsaI, SspI, TaqI, Tsp509I. Fitoplasmas: AKpot6 (16SrIII-N), ChWB (16SrIII-
J)............................................................................................................................ 46
Figura 13 – Árvore filogenética construída a partir de sequências do gene secY encontrado em
fitoplasmas afiliados a alguns subgrupos do grupo 16SrIII, fitoplasma identificado
em melão-de-São-Caetano (MWB) e os procariotos Acholeplasma laidlawi e
Acholeplasma palmae. Os números nos ramos indicam os valores de confiança
baseados no “Bootstraping”. (*) As sequências foram determinadas neste trabalho,
porém não foram depositadas no GenBank. Estas sequências estão apresentadas
no apêndice localizado no final do texto da dissertação. ........................... ............48
16
17
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Plantas hospedeiras de fitoplasma do grupo 16SrIII subgrupo J, no Brasil...........27
Tabela 2 – Sequências de nucleotídeos correspondentes ao gene secY de fitoplasmas
utilizados para a construção da árvore filogenética, seus respectivos grupos e
subgrupos, com números de acesso ao Genbank. ............................. .................. 33
Tabela 3 – Detecção de fitoplasmas em plantas de melão-de-São-Caetano utilizadas no
presente estudo, por meio de duplo PCR conduzido com os iniciadores específicos
da região 16S rDNA e secY .................................................................................. 34
Tabela 4 – Coeficientes de similaridade (F) calculados entre pares de fitoplasmas
representantes de diversos subgrupos do grupo 16SrIII e o fitoplasma identificado
em plantas de melão-de-São-Caetano (MWB). ................................................ .... 46
Tabela 5 – Tipos de padrões de restrição gerados por 10 das 18 enzimas usadas na digestão in
silico do gene secY, amplificado a partir de fitoplasmas pertencentes a diversos
subgrupos do grupo 16SrIII, incluindo o fitoplasma presente em melão-de-São-
Caetano. ...................................... ...........................................................................47
18
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1 INTRODUÇÃO
O melão-de-São-Caetano (Momordica charantia L) é uma planta originária da Ásia,
pertencente à família Cucurbitacea. Esta espécie é bem adaptada às condições de clima
tropical e ocorre, de forma generalizada, em todas as regiões brasileiras. Apresenta hábito
trepador, se desenvolvendo sobre outras plantas ou em cercas e muros, tanto em áreas de
campos como urbanas. M. charantia se apresenta sob duas formas ou tipo, uma delas
considerada como “variedade silvestre” ou “tipo silvestre” e a outra comumente referida
como “variedade cultivada” ou “tipo cultivado”. No Brasil, não se encontra referência desta
espécie ser utilizada comercialmente, no entanto, às vezes, a “variedade cultivada” pode ser
encontrada em mercados e feiras, como atrativo de fruto exótico. Contrariamente, em alguns
países a espécie é cultivada em larga escala tanto para uso medicinal como culinário. A
chamada “variedade silvestre” é considerada como planta daninha na cultura de cana de
açúcar, por competir eficientemente pela água, nutrientes e espaço físico.
Além do papel como espécie daninha em algumas culturas, o melão-de-São-Caetano
tem sido relatado como hospedeiro de vírus e fitoplasmas. No Brasil, experimentalmente, dois
potyvirus, agentes de doenças em plantas de mamão, abobrinha e melancia, se estabeleceram
em plantas da “variedade cultivada”, porém não infectaram plantas da “variedade silvestre”.
Este é um fato interessante, pois plantas de mesma espécie expressaram reações diferentes ao
mesmo patógeno. Fitoplasma também foi encontrado, naturalmente, em associação com
plantas da “variedade silvestre”, no entanto, não se tem informações da ocorrência de
fitoplasmas na “variedade cultivada”. A caracterização molecular deste fitoplasma permitiu
sua classificação como sendo pertencente ao grupo 16SrIII, subgrupo J, o qual também já foi
identificado em plantas de interesse econômico, como chuchu, couve-flor e tomate, entre
outras.
Fitoplasmas são procariotos sem parede celular, habitantes de floema e transmitidos
por cigarrinhas. Sua classificação tem sido fundamentada, principalmente, na diversidade de
sequências nucleotídicas do gene 16S rRNA. Com base neste critério, os fitoplasmas têm sido
classificados no sistema de grupos e subgrupos, utilizando-se a técnica de polimorfismo de
comprimento de fragmentos de restrição (RFLP). As análises de RFLP convencional ou, mais
modernamente, as análises de RFLP virtual destas sequências permitem a distinção destes
procariotos e sua alocação nos diferentes grupos e subgrupos. No entanto, devido à natureza
altamente conservada deste gene, dificuldades são encontradas para separar alguns
fitoplasmas, sobretudo ao nível de subgrupos. Assim, outros genes têm sido explorados para
20
esta finalidade, entre eles o gene secY. Estudos têm mostrado que este gene é um marcador
promissor que permite uma diferenciação genética mais fina entre os fitoplasmas,
distinguindo variantes que não são normalmente delineados com base na análise do gene 16S
rRNA.
Considerando-se que a “variedade silvestre” e a “variedade cultivada” reagiram de
forma diferenciada em relação aos potyvirus e que poderiam diferir também em relação ao
fitoplasma e que um fitoplasma do grupo 16SrIII-J infecta plantas da “variedade silvestre”,
porém não se sabe se o mesmo infecta a “variedade cultivada”, um dos objetivos deste estudo
foi investigar a ocorrência de fitoplasmas em plantas desta última “variedade” que exibiam
sintomas tipicamente induzidos por este tipo de patógeno. Ainda, desde que este estudo
mostrou, em sua primeira etapa, que somente um fitoplasma do subgrupo 16SrIII-J estava
presente tanto em plantas da “variedade silvestre” como naquelas da “variedade cultivada”, o
segundo objetivo foi determinar uma possível diversidade genética entre os isolados
(“strains”) deste fitoplasma, através de análises de RFLP virtual, tomando-se por base as
sequências nucleotídicas do gene secY.
21
2 DESENVOLVIMENTO
2.1 Revisão Bibliográfica
2.1.1 Fitoplasmas
Fitoplasmas são bactérias fitopatogênicas, nas quais a parede celular está ausente,
sendo o protoplasma envolvido por uma única membrana, resultando em pleomorfismo da
célula (BERTACCINI, 2007; WEISBURG et al., 1989). As dimensões celulares são variáveis
de 200 a 800 nm, bem menores do que aquelas encontradas nas eubactérias envolvidas com
diversas doenças de plantas. São procariotos pertencentes à classe Mollicutes, habitantes de
floema em plantas e de diversos órgãos e hemolinfa de insetos e estão associados a centenas
de doenças ocorrentes nas mais diversas regiões do mundo. A transmissão de fitoplasmas em
condições naturais é realizada principalmente por cigarrinhas pertencentes às famílias
Cacadellidea e Fulgoridea, que adquirem o fitoplasma ao se alimentarem no floema de plantas
infectadas. Uma vez no interior do inseto, o patógeno se multiplica e atinge as glândulas
salivares, podendo ser introduzido no floema de plantas sadias, quando o inseto delas se
alimentar. Ressalta-se que os fitoplasmas podem ser transmitidos durante toda a vida do vetor,
mantendo com o mesmo uma relação do tipo circulativa-propagativa (WEINTRAUB;
BEANLAND, 2006).
A primeira doença associada aos fitoplasmas foi relatada em 1902, em plantas de
rainha margarida (Callistephus chinensis Nees). Naquela época, a doença foi denominada de
“amarelo” (“Aster yellow”), sendo referida por Erwin Smith, um dos pioneiros da
Fitopatologia, como sendo uma das doenças mais obscuras e peculiares (HEWITT, 1987),
devido aos seus sintomas e à dificuldade de se esclarecer a sua etiologia. Outras doenças
apresentando características semelhantes foram relatadas a partir de então e, por falta de
conhecimento, foram atribuídas aos vírus, embora as evidências não fossem suportadas pelas
pesquisas posteriores. (LEE I-M, DAVIS RE, 1992). O agente causal dos “amarelos” somente
foi descoberto em 1967, por um grupo de cientistas japoneses, que observaram, com o auxílio
de microscópio eletrônico, a presença de corpúsculos pleomórficos em tecidos de plantas
doentes e sua ausência em plantas sadias (DOI et al., 1967). Por serem similares aos
micoplasmas, conhecidos como patógenos de animais, estes microrganismos foram
identificados como MLOs (“Mycoplasma Like-Organisms”). No Brasil, em 1968, foi feito um
dos primeiros relatos de uma doença associada aos fitoplasmas, a qual foi denominada de
cálice gigante, sendo seu agente detectado nas plantas de tomateiro infectadas através do
22
emprego de microscopia eletrônica de transmissão (KITAJIMA; COSTA, 1968). O termo
trivial fitoplasmas foi proposto por pesquisadores que trabalhavam com Mollicutes e passou a
ser adotado a partir de 1994 para designar estes patógenos vegetais (SEARS &
KIRKPATRICK, l994).
Os sintomas induzidos por fitoplasmas nas plantas são bastante diversos, podendo
ocorrer isoladamente ou em conjunto. O mecanismo de patogenicidade está relacionado com
desequilíbrios hormonais provocados pelo patógeno (LEE; DAVIS; GUNDERSEN-RINDAL,
2000) e entre os sintomas que ocorrem com maior frequência destacam-se a clorose em
folhas, o superbrotamento de ramos, o enfezamento generalizado da planta (nanismo), a má
formação dos frutos, a virescência (presença de clorofila em órgãos florais), a esterilidade de
flores, a filodia (conversão de órgãos florais em folhas), o avermelhamento foliar, a necrose
de vasos e o declínio de plantas (LEE; DAVIS; GUNDERSEN-RINDAL, 2000;
HOGENHOUT et al., 2008). A intensidade desses sintomas depende de fatores como a
suscetibilidade da espécie vegetal, o estádio fenológico da planta, a agressividade do patógeno
e as condições favoráveis do ambiente (DAVIS, 1995; BEDENDO, 2011).
No Brasil, os fitoplasmas estão associados a diversas doenças presentes tanto em
plantas cultivadas como hortaliças, cereais, ornamentais e frutíferas, como em espécies
daninhas e silvestres. Dentre as doenças associadas aos fitoplasmas, se destacam pela sua
importância econômica o enfezamento vermelho do milho (BEDENDO et al., 1998);
enfezamento do repolho (AMARAL MELO, 2007); superbrotamento do maracujazeiro
(RIBEIRO; BEDENDO, 2008); enfezamento da couve-flor (RAPUSSI; BEDENDO, 2008);
uma doença encontrada em plantas de citros com sintomas de HLB (TEIXEIRA et al., 2008);
a síndrome do amarelecimento foliar da cana de açúcar (SILVA et al., 2009); e o
superbrotamento da mandioca (FLÔRES, 2009).
O controle das doenças associadas aos fitoplasmas é feito através de medidas como o
uso de material vegetal livre do patógeno, eliminação de plantas doentes (“roguing”) e plantio
de variedades resistentes. O tratamento químico com o uso de antibióticos não é recomendado
na maioria dos casos, por ser inviável economicamente e apresentar risco à saúde humana
(GARCIA-CHAPA et al., 2003). O controle químico, por sua vez, somente é preconizado
para controlar os insetos vetores destes procariotos (WEINTRAUB, 2007).
2.1.1.1 Detecção e classificação
Uma das barreiras encontradas para o estudo dos fitoplasmas está relacionada com o
fato dos mesmos não serem ainda cultiváveis em meio de cultura. Durante sua evolução, estes
23
procariotos perderam muitas rotas metabólicas, como aquelas responsáveis pela síntese de
ATP, aminoácidos e até nucleotídeos, os quais passaram a ser obtidos diretamente dos seus
hospedeiros (BAI et al., 2006; OSHIMA et al., 2004). Como consequência, há
impossibilidade de se determinar as suas características fenotípicas e bioquímicas ou
fisiológicas, características estas exigidas para classificação de microrganismos dentro do
sistema binomial latino; por esta razão não são classificados taxonomicamente ao nível de
gênero e espécie. Ainda, o seu não cultivo em laboratório cria dificuldades para a detecção
destes patógenos em tecidos de plantas doentes, através do método de isolamento para
obtenção de colônias puras (PRESCOTT; HARLEY; KLEIN, 2002).
A metodologia usada inicialmente para associar os fitoplasmas às doenças tomava por
base os sintomas exibidos pela planta hospedeira e a visualização dos típicos corpúsculos
pleomórficos no floema de tecidos doentes, com o auxílio da microscopia eletrônica. O
sistema utilizado para classificar os fitoplasmas considerava os diversos tipos de sintomas
presentes na planta doente, a gama de espécies hospedeiras e a relação do patógeno com os
insetos vetores; no entanto, esta metodologia se mostrava pouco eficiente, além disto, era
muito trabalhosa, demandava muito tempo e as informações sobre os insetos vetores eram
insuficientes (CHIYOKOWSKI, 1989; LEE; DAVIS; GUNDERSEN-RINDAL, 2000).
Com o advento das técnicas moleculares foi possível realizar o sequenciamento de
uma região altamente conservada dos fitoplasmas, aquela correspondente ao gene 16S rRNA.
As sequências de nucleotídeos deste gene, apesar de bastante conservadas, têm sido adotadas
para estudos da variabilidade genética em procariotos. Estudos relacionados às sequências de
bases da região do 16S rRNA, confirmaram a alocação dos fitoplasmas dentro da classe
Mollicutes e levaram ao reconhecimento de um clado monofilético distinto dentro da classe,
a qual também abriga os micoplasmas encontrados em animais (VANDAMME et al., 1996;
GUNDERSEN et al., 1994). Entre as técnicas moleculares mais comumente utilizadas
destacam-se: PCR (Polymerase Chain Reaction), que amplifica determinados fragmentos
genômicos e possibilita a detecção de fitoplasmas em plantas suspeitas de infecção e RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphism), na qual enzimas geram padrões de restrição a
partir dos fragmentos genômicos amplificados em PCR, possibilitando a identificação
molecular dos fitoplasmas, o que serve de base para a classificação dos mesmos em grupos e
subgrupos (HARRISON et al., 1996; LEE et al., 1998). Estas técnicas permitem distinguir 19
grupos distintos e mais de 40 subgrupos (LEE et al., 1998). Recentemente, essa técnica
convencional de RFLP está sendo substituída, com vantagens, pela análise simulada em
computador, denominada RFLP virtual, na qual é feita a digestão in silico a partir do
24
sequenciamento da região 16S rDNA “F2n/R2”. Este novo esquema possibilitou novas
interpretações, resultando no surgimento de novos grupos e subgrupos, tanto que no atual
sistema, os fitoplasmas são classificados em 31 grupos e mais de 100 subgrupos (WEI et al.,
2007, 2008).
O desenvolvimento desta área de conhecimento mostrou que a diversidade de
fitoplasmas avaliada em relação ao gene 16S rRNA não permitia estabelecer distinções mais
acuradas à medida em que novas descobertas possibilitaram aumentar o número de
fitoplasmas conhecidos. A diferenciação molecular passou a ficar mais difícil pelo fato das
sequências da região do gene 16S rRNA serem muito semelhantes entre os fitoplasmas.
Assim, tornou-se necessária a utilização de outras ferramentas para distinções mais refinadas
(MARCONE et al., 2000; LEE et al., 2004, 2006, 2010). A solução encontrada foi a adoção
de novos marcadores moleculares, incluindo aqueles baseados nas proteínas ribossomais
(RP), sequências de genes TUF, vmp1 e secY, os quais estão sendo usados isoladamente ou
em conjunto com algum para esta finalidade (LEE et al., 2006; ARNAUD et al., 2007;.
MARTINI et al., 2007;. FIALOV'A et al., 2009;. PACIFICO et al., 2009;. MUROLO et al.,
2010).
O gene secY é responsável por codificar uma proteína que está envolvida com o
mecanismo de secreção de proteínas nas bactérias, em conjunto com o gene secA e outros
genes. Foi inicialmente identificado nos fitoplasmas através da clonagem aleatória de um
fragmento do DNA, usado originalmente como sonda de hibridização para detecção do
fitoplasma da flavescência dourada da videira (DAIRE et al., 1997). É considerado como um
dos marcadores mais eficientes para a diferenciação e classificação refinada de fitoplasmas,
devido a sua maior variabilidade genética em relação a outros marcadores. Ainda, tem sido
usado, especialmente, para detectar distinções entre estirpes dentro de um mesmo grupo
classificado com base no 16S rDNA (HODGETTS et al., 2008;.. LEE et al., 2006a;
MARTINI et al., 2007).
2.1.2 Melão-de-São-Caetano
O melão-de-São-Caetano (Momordica charantia L) pertence à família Cucurbitaceae e
tem sua origem na Ásia, sendo amplamente distribuído em diferentes partes do mundo,
adaptado principalmente às regiões de clima tropical e subtropical (YAMAGUCHI, 1983).
Curiosamente, o termo “momordica” é originário do latim e significa “mordida”, referindo-se
à conformação dos bordos das folhas. Em algumas regiões do Brasil recebe outros nomes
populares como erva-de-lavadeira, erva-de-São-Vicente, fruta da cobra e melãozinho. O nome
25
melão-de-São-Caetano se refere ao santo São Caetano, padroeiro de uma capela existente no
município de Mariana (MG), onde os escravos das minas de ouro cultivavam essa planta ao
redor do prédio (SOUZA, 2001). É uma espécie vegetal silvestre encontrada facilmente em
cercas, muros e sobre outras plantas, tanto em áreas urbanas como rurais, ocorrendo em vários
tipos de solo e diversos tipos de clima (RIBEIRO, 2004, GIRON et al., 1991; LANS;
BROWN, 1998).
No Brasil, são reconhecidas duas variedades ou tipos, em função do tamanho das
plantas, das folhas, dos frutos e das suas sementes (figura 1). Uma delas, denominada de
“variedade cultivada” ou “tipo cultivado”, apresenta frutos com cerca de 10-30 cm de
comprimento, às vezes comercializada em mercados e feiras como fruta exótica. A outra
variedade chamada de “silvestre” ou “tipo silvestre” produz frutos menores com tamanho
aproximado de 5-10 cm, sementes pequenas, além de folhas de tamanho reduzido (ZHAO,
2005). Em diversos países, esta espécie é principalmente usada para fins medicinais, como na
China, Colômbia, Cuba, Gana, Haiti, Índia, México, Malásia, Nova Zelândia, Nicarágua,
Panamá e Peru (GROVER, 2004; GÜRBÜZ et al., 2000). Centenas de pesquisas científicas
têm revelado suas propriedades curativas, entre elas, atividade antibacteriana,
antiulcerogênica, antinflamatória, antilipidêmica, hipoglicemiante, antihipertensiva,
anticancerígena, abortiva, larvicida, antilipidêmica e imunossupressora (SENER, 1998;
MIURA, 2001; ISMAIL, 1999).
A cultura tem capacidade de se desenvolver bem em vários tipos de solo
(CANTWELL et al., 1996; REYES et al., 1994) sendo resistente a amplitudes térmicas
(DESAI; MUSMADE, 1998), o que a torna uma das principais plantas infestantes na cultura
da cana-de-açúcar, por competir por água, nutrientes e espaço físico, acarretando prejuízos
consideráveis na cultura, sendo de difícil controle químico (OLIVEIRA; FREITAS, 2008)
26
Figura 1- Comparativo das duas variedades de melão-de-São-Caetano (Momordica charantia L). MS= variedade
silvestre; MC= variedade cultivada. (Foto gentilmente cedida por José Edivaldo Buriola)
2.1.2.1 Doenças em melão-de-São-Caetano
Em relação a esta espécie, poucos estudos têm sido desenvolvidos com relação à
suscetibilidade da cultura a determinados patógenos, mesmo nos países em que a planta é
explorada comercialmente. Algumas pesquisas mencionam o melão-de-São-Caetano como
hospedeiro alternativo de alguns vírus que afetam plantas de interesse econômico. Neste caso,
as plantas portadoras de vírus poderiam atuar como fontes de inóculo e possíveis vetores
poderiam transmitir o patógeno para a cultura principal. Existem relatos da suscetibilidade
desta espécie a alguns vírus de reconhecida importância como agentes de doença, como, por
exemplo, o “Melon yellow spot vírus” (MYSV) (SHIGEHARU et al., 2009), o “Papaya
ringspot vírus” (PRSV) (CHIN; AHMAD, 2007), o “Squash vein yellowing vírus” (SqVYV)
(ADKINS et al., 2008), “Watermelon bud necrosis virus” (WBNV) (KUNKALIKAR et al.,
2011).
Considerando os fitoplasmas, estudos revelaram a associação de um fitoplasma
pertencente ao grupo 16SrIII-J com plantas de melão-de-São-Caetano que apresentavam uma
doença denominada de superbrotamento (MONTANO et al., 2000). Inicialmente relatada no
estado do Rio de Janeiro, a doença foi atribuída a um fitoplasma que também estava associado
ao superbrotamento do chuchuzeiro. O fitoplasma presente em plantas de melão-de-São-
Caetano foi referido como Chayote witches’-broom phytoplasma [ChWbIII(Mor)]
27
(MONTANO et al., 2000). Como a doença não recebeu nome específico, ela será aqui
considerada como superbrotamento do melão-de-São-Caetano e passará a ser referida no
restante do texto como Momordica witches’-broom (MWB). Esta doença foi encontrada em
plantas de melão-de-São-Caetano localizadas em áreas cultivadas com chuchu, no estado do
Rio de Janeiro (MONTANO et al., 2000) e em áreas de pastagens e vegetação espontânea, no
estado de São Paulo (RIBEIRO et al., 2004). Este fitoplasma afiliado ao grupo 16SrIII
subgrupo J tem sido identificado em alguns países da América do Sul, demonstrando, até o
presente, que o mesmo parece estar limitado a esta região geográfica. No Brasil, além do
melão-de-São-Caetano, esse fitoplasma também tem sido encontrado em associação com
diversas doenças que afetam distintas espécies botânicas, como ilustrado na Tabela 1.
Tabela 1 - Plantas hospedeiras de fitoplasma do grupo 16SrIII subgrupo J, no Brasil
Família Espécie Referência
Amaranthaceae, Celosia spicata
Celosia argentea
Eckstein, 2008
Ampelidaceae Vitis vinifera Neroni, 2009
Brassicaceae B. oleraceae var. botrytis Rapussi-da-Silva, 2010
Cucurbitaceae Sechium edule
Momordica charantia
Cucurbita moschata
Montano et al., 2000, 2006
Solanaceae Nicandra physalodes Eckstein, 2010
2.2 Material e Métodos
2.2.1Amostras de plantas
Plantas de melão-de-São-Caetano que apresentavam sintomas de nanismo,
superbrotamento de ramos, má formação dos frutos, redução do limbo foliar, clorose e
enrugamento da lâmina foliar e (figura 2), sendo esses sintomas característicos de infecção
causada por fitoplasmas, foram amostradas no campo experimental do Departamento de
Fitopatologia e Nematologia da Esalq/USP. Estas plantas foram infectadas em condições
naturais, sendo coletadas amostras de 12 plantas, 5 delas da “variedade silvestre” e 7 da
“variedade cultivada”. Cada amostra foi composta por secções de caules, pecíolos e folhas.
28
Figura 2 - Sintomas em plantas de melão-de-São-Caetano. Letras: A= má formação dos frutos; B= redução do
limbo foliar e nanismo (planta da direita); planta assintomática (à esquerda); C= enrugamento da
lâmina foliar e D= clorose
2.2.2 Extração de DNA total
Foi realizada a extração de DNA total de cada amostra, com a utilização do “kit”
comercial DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen), segundo recomendação do fabricante. Dois
gramas de material vegetal foram macerados em nitrogênio líquido, em almofariz de
porcelana. Uma fração da amostra macerada foi transferida para microtubos de 1,5 mL, sendo
adicionados 400 μL do tampão AP1 e 4 μL de RNAse. Os tubos foram mantidos em “banho-
maria” à 65oC por 10 minutos. Após esse tempo, foram adicionados 130 μL do tampão AP2 e,
em seguida, os tubos foram mantidos a - 20oC por, 5 minutos. Posteriormente, o material foi
centrifugado a 13.000 rpm, por 5minutos, o sobrenadante foi transferido para uma coluna
montada sobre um tubo coletor e centrifugado por 5 minutos a 13.000 rpm. O filtrado foi
recolhido e transferido para um novo tubo, no qual foram adicionados 675 μL do tampão
AP3. Desta solução, foram transferidos 650 μL para nova coluna. O material foi centrifugado
por 1 minuto a 8.000 rpm e o filtrado foi descartado. A coluna contendo o DNA foi
transferida para um novo tubo. Um volume de 500 μL do tampão AW foi adicionado ao
centro da coluna, com posterior centrifugação por 2 minutos a 13.000 rpm, para lavagem do
DNA. Finalmente, foram adicionados 100 μL de tampão AE no centro da coluna para
29
promover a eluição do DNA, seguido de centrifugação por 1 minuto a 8.000 rpm. O DNA
extraído foi armazenado a - 200C.
2.2.3 PCR para detecção de fitoplasma
Para a detecção de fitoplasmas, foram utilizados oligonucleotídeos ou iniciadores
(“primers”) universais, cujas sequências foram delineadas a partir de dois genes presentes em
fitoplasmas, identificados por 16S rRNA e secY. As reações foram conduzidas usando-se
duplo PCR, com o DNA total extraído de cada amostra diluído em água milli-Q na proporção
de 1:5. O volume final de cada reação foi de 25,0 μL, de acordo com a metodologia proposta
por Lee et al. (1993), nas proporções de: 19,0 μL de água deionizada-destilada; 0,5 μL de
cada nucleotídeo - solução 20 pmol/μL- (dCTP, dATP, dGTP, dTTP); 2,5 μL de tampão PCR;
0,15 μL de Amplitaq 5U/μL (Invitrogen); 1,0 μL de DNA extraído da planta (25n/μL).
Os oligonucleotídeos universais utilizados para a detecção de fitoplasmas com base no
gene 16S rDNA, foram P1/ P7 (SMART et al., 1996; DENG; HIRUKI, 1991), para a
primeira reação e o par R16F2n/R2 (GUNDERSEN; LEE, 1996) para a segunda reação. Para
a detecção de fitoplasmas com base no gene secY, foram utilizados para a primeira reação, o
par de oligonucleotídeos L15-F1A(III)/Map-R1A(III) e os pares SecY-F1(III)/SecY-R1(III)
para a segunda reação (SUH et al., 1996; LEE et al., 2010). Os produtos gerados na primeira
reação foram diluídos em água Milli-Q autoclavada na proporção de 1:30 para servir de
modelo para a segunda reação. Um termociclador automático foi utilizado para processar as
amostras. Para os iniciadores R16 P1/ R16 P7 e R16F2n/R2, a programação utilizada foi de
35 ciclos, sendo que cada ciclo compreendeu uma etapa de desnaturação do ácido nucléico a
940C por 1 minuto, 2 minutos a 50ºC para o anelamento e 3 minutos a 72ºC para a fase de
extensão, uma única etapa inicial de 1 minuto a 94ºC e uma final de 7 minutos a 72ºC. Para os
iniciadores L15-F1A(III)/Map-R1A(III), o termociclador foi programado para 35 ciclos,
usando-se 940C por 30 segundos para a desnaturação, 1 minuto a 50ºC para o anelamento e 5
minutos a 68ºC para a fase de extensão dos iniciadores, 1 minuto a 94ºC para a etapa inicial e
10 minutos a 72ºC para a final. Para a segunda reação, com os iniciadores SecY-F1(III)/SecY-
R1(III), o número de ciclos foi de 38, sendo a desnaturação processada a 940C por 1 minuto,
o anelamento por 2 minutos a 50ºC e a extensão por 3 minutos a 72ºC, 2 minutos a 94ºC para
uma etapa inicial e 7 minutos a 72ºC para a etapa final.
As sequências dos oligonucleotídeos ou iniciadores utilizados foram:
30
R16 P1- 5’ AAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG GAT T 3’
R16 P7- 5’ CGT CCT TCA TCG GCT CTT 3’
R16 F2n- 5’GAA ACG ACT GCT AAG ACT GG 3’
R16 R2- 5’TGA CGG GCG GTG TGT ACA AAC CCC G 3’
L15-F1A(III)- 5’ CTTCTGGTAAAGGACATAAAGG 3’
Map-R1A(III)- 5’ GGTTCTTCGTGCAATTGCAAACC 3’
SecY-F1(III) 5' CTAGACCAGGTTTTGAAGG 3'
SecY-R1(III) 5' GACCTGCTTTTCTCATTATAGC 3'
Os produtos gerados pelo duplo PCR foram submetidos à eletroforese em gel de
agarose 1% e tampão TBE 0,5X. A eletroforese foi conduzida com voltagem constante de
65V por 60 minutos. Para a coloração dos produtos de amplificação utilizou-se Sybr safe®
(1%), sendo a visualização das amostras processadas realizada em transiluminador de
ultravioleta. O marcador molecular utilizado para definir o tamanho dos fragmentos
amplificados foi o 1 Kb Ladder (Life Technologies).
2.2.4 Identificação de fitoplasmas por PCR
Após a detecção de fitoplasmas realizada pela amplificação de fragmentos genômicos
pelos iniciadores universais, foram conduzidas novas reações de PCR para a identificação
destes fitoplasmas ao nível de grupo. Para isto, foram empregados iniciadores específicos para
a identificação de fitoplasmas dos grupos 16SrI e 16SrIII, usando-se os iniciadores
R16(I)F1/R1 e R16(III)F2/R1, respectivamente (LEE et al., 1994). Os iniciadores específicos
de grupo foram empregados somente na segunda reação, sendo assim, utilizou-se uma
alíquota de 1 μL do produto gerado na primeira reação com os iniciadores P1/ P7 como molde
para a segunda reação com os iniciadores específicos para grupos. As reações de PCR foram
processadas nas mesmas condições descritas anteriormente para os iniciadores universais.
Como padrão positivo de reação para o grupo 16SrI foi utilizado o DNA de plantas de milho
infectadas pelo fitoplasma associado ao enfezamento vermelho, enquanto para o grupo
16SrIII foi usado o DNA extraído de plantas de chuchu portadoras do fitoplasma associado ao
enfezamento.
As sequências dos iniciadores de grupo estão especificadas a seguir:
R16(I)F1- 5’TAA AAG ACC TAG CAA TAG G 3’
R16(I)R1- 5’CAA TCC GAA CTG AGA CTG T 3’
R16(III)F2- 5’AAG AGT GGA AAA ACT CCC 3’
R16(III)R1- 5’TCC GAA CTG AGA TTG A 3’
31
2.2.5 Sequenciamento da região dos genes 16S rRNA e secY e análise das sequências
O fitoplasma detectado em cada uma das amostras foi considerado como um isolado
ou “strain”, totalizando doze isolados. Para o sequenciamento, foram enviados fragmentos
genômicos amplificados na segunda reação de PCR conduzida com os pares de iniciadores
R16F2n/R2 e SecY-F1(III)/SecY-R1(III). As sequências correspondentes a cada um dos
genes foram montadas em “contigs”, usando-se os programas Bio Edit V. 7.0.9.0 (HALL,
1999), sendo estas sequências analisadas pelo programa Multiple Sequence Alignment -
CLUSTALW.
2.2.6 Análise de RFLP in silico
Para cada isolado, a análise de RFLP das sequências amplificadas a partir do gene
secY foi conduzida in silico, empregando-se programa de computador. O alinhamento e corte
das sequências de nucleotídeos foi realizada com auxílio do programa Bio Edit V. 7.0.5.3
(HALL, 1999). As sequências geradas pela segunda reação de PCR, com aproximadamente
1,6 kb, foram alinhadas com uma sequência do gene secY depositada no GenBank e cortadas
para aproximadamente 1,27 Kb. Após este procedimento, a digestão foi simulada em
computador (WEI et al., 2007), utilizando-se o programa pDRAW32 (AcaClode Software).
Foram utilizadas 18 enzimas de restrição, sendo 17 delas previamente estabelecidas para
determinar a classificação dos fitoplasmas em grupos e subgrupos: AluI, BamHI, BfaI, BstUI
(ThaI), DraI, EcoRI, HaeIII, HhaI, HinfI, HpaI, HpaII, KpnI, SauAI (MboI), MseI, RsaI, SspI,
TaqI. A enzima Tsp509I foi adicionada às demais enzimas. Após a digestão, a eletroforese foi
simulada em gel de agarose a 3%. Os padrões de restrição gerados foram analisados e um
coeficiente de similaridade (F) foi calculado para cada par de isolados de fitoplasmas, de
acordo com a fórmula F = 2Nxy / (Nx + Ny), onde Nx e Ny são os números totais de bandas
no perfil de cada isolado e Nxy é o número de bandas em comum entre os mesmos (LEE et
al., 1998; NEI; LI, 1979). Na determinação do coeficiente de similaridade, as bandas até 50
pb foram consideradas para o cálculo.
2.2.7 Detecção por microscopia eletrônica de transmissão
Parte das amostras coletadas no campo foi preparada para análise dos tecidos em
microscópio eletrônico de transmissão, visando à detecção direta de fitoplasmas no interior de
vasos do floema. Para isto, cortes de pecíolos com aproximadamente 5 mm de comprimento
por 2 mm de diâmetro foram fixados em solução de Karnovsky modificado
(glutaraldeiodo2,5%+paraformaldeido2,5%,tampão cacodilato 0,05M pH 7,2+CaCl2 0,005M)
32
por 1 hora. Em seguida, os tecidos foram lavados 3 vezes por 10 minutos em tampão
cacodilato 0,005M e pós-fixados em solução de tetróxido de ósmio a 1% (OsO4 1% tampão
cacodilato 0,1 M) por 1 hora. A etapa de contraste foi conduzida usando-se acetato de uranila
a 0,5% por uma noite. Posteriormente, foi realizada a desidratação em série acetílica,
permanecendo as amostras por 10 minutos em cada uma das concentrações de 30-50-70 e
90%, e três vezes por 10 minutos em acetona 100%. O material foi colocado para iniciar a
infiltração em acetona 100% e resina spurr puro, na proporção de 1:1 por 5 horas e, em
seguida, foi colocado em resina spurr puro por uma noite. Seguindo os procedimentos, as
amostras foram colocadas em formas apropriadas e cobertas com resina spurr puro a 600C
por
três dias, finalizando-se, deste modo, o preparo das amostras, de acordo com a metodologia
descrita por Kitajima e Nome (1999).
Os blocos contendo as amostras foram cortados em ultramicrótomo Leika
Ultracut UCt. Os cortes ultrafinos, de aproximadamente 70 nm de espessura, foram feitos com
auxílio de uma navalha de diamante, sendo estes cortes depositados em telas de cobre e
contrastados com acetado de uranila e citrato de chumbo. As telas foram visualizadas em
microscópio Zeis Em 9000. Todo preparo das amostras, bem como a sua visualização
microscópica foram realizados no Núcleo de Apoio à Pesquisa em Microscopia Eletrônica
Aplicada à Agricultura (NAP/MEPA) da ESALQ/USP.
2.2.8 Análise filogenética
Uma árvore filogenética foi construída com base nas sequências nucleotídicas
componentes do fragmento genômico correspondente à região do gene secY de fitoplasmas
representantes do grupo 16SrIII depositadas no “GenBank” e do fitoplasma identificado neste
estudo nas plantas de melão-de-São-Caetano. Para tanto, foi usado o programa MEGA 5.0
(TAMURA et al., 2011) através de múltiplos alinhamentos obtidos com o programa Clustal
W (THOMPSON et al., 1994). Para a construção da árvore filogenética também foram usadas
as sequências dos procariotos Acholeplasma laidlawii e Acholeplasma palmae como raiz,
sendo utilizado o método de agrupamento Neighbour-Joining. O teste “Bootstrapping foi
processado 1.000 vezes, para garantir a confiabilidade da posição dos ramos na árvore.
2.2.9 Fitoplasmas que foram utilizados neste trabalho
As sequências nucleotídicas dos fitoplasmas utilizados no presente estudo, seus
respectivos grupos e subgrupos, bem como seus números de acesso no GenBank estão
listados na Tabela 2.
33
Tabela 2. - Sequências de nucleotídeos correspondentes ao gene secY de fitoplasmas utilizados para a
construção da árvore filogenética, seus respectivos grupos e subgrupos, com números de acesso ao
Genbank
Fitoplasma Doença associada Origem Classificação com base no
gene 16S rRNA
Número de acesso
no GenBank
CX Peach X-disease Canada 16SrIII-A GU004327
CYE Clover yellow edge Lithuania 16SrIII-B GU004332
PBT Pecan bunchy top USA 16SrIII-C GU004361
GR1 Goldenrod yellows USA 16SrIII-D GU004364
SP1 Spirea stunt USA 16SrIII-E GU004326
MW1 Milkweed yellows USA 16SrIII-F GU004340
WWB Walnut witches’-broom USA 16SrIII-G GU004325
JR1Ph (PoiBI) Poinsettia branch inducing USA 16SrIII-H GU004328
ChWBIII Chayote witches’- broom Brazil 16SrIII-J *
MWB Momordica witches’-broom Brazil 16SrIII-J *
MT117 Potato purple top-MT USA 16SrIII-M GU004333
AKpot6 Potato purple top-AK USA 16SrIII-N GU004359
* As sequências foram determinadas neste trabalho, porém não foram depositadas no GenBank. Estas sequências
estão apresentadas no apêndice localizado no final do texto da dissertação.
2.3 Resultados e Discussão
2.3.1 Detecção de fitoplasmas por PCR
Os sintomas observados nas plantas de melão-de-São-Caetano coletadas no campo
foram similares àqueles anteriormente descritos nos trabalhos de Montano et al. (2000),
Ribeiro et al. (2004) e Nilda e Montano (2010). As plantas exibiam sintomas caracterizados
por nanismo ou enfezamento generalizado da parte aérea, clorose acentuada nas folhas,
proliferação ou superbrotamento de ramos, encurtamento de entrenós, folhas e frutos de
tamanho bastante reduzido.
Fragmentos genômicos de aproximadamente 1,2 Kb foram amplificados pelos
iniciadores P1/P7 e R16F2n/R2, a partir da região 16S rDNA, confirmando a presença de
fitoplasmas em todas as plantas doentes amostradas, sendo cinco representativas da
“variedade silvestre” e sete pertencentes à “variedade cultivada”. Reações de duplo PCR
conduzidas com iniciadores L15-F1A(III)/Map-R1A(III) e SecY-F1(III)/SecY-R1(III)
amplificaram fragmentos de DNA esperados de 1,6 Kb, correspondentes à região do gene
secY, revelando a ocorrência de fitoplasmas nos tecidos de todas as doze plantas de melão-de-
São-Caetano que exibiam sintomas da doença (tabela3). Ambos os tipos de fragmentos foram
visualizados na forma de bandas, após a eletroforese dos produtos de PCR conduzida em gel
de agarose, como ilustrado nas fotos documentadas (figuras 3 e 4). Como controle positivo
das reações de PCR baseadas no gene 16S rRNA foi utilizado o DNA de plantas de vinca
(Catharanthus roseus) sabidamente infectadas com fitoplasmas, o qual gerou um fragmento
34
esperado de 1,2Kb; o padrão positivo para as reações baseadas gene secY foi representado
pelo DNA extraído de plantas de chuchu portadoras do fitoplasma do superbrotamento, a
partir do qual foram amplificados fragmentos genômicos da ordem de 1,6 Kb. A água foi
utilizada nos testes de PCR como forma de demonstrar a ausência de contaminação das
misturas de reação. Nestes casos, nenhuma amplificação foi detectada, garantindo a
confiabilidade dos resultados.
Tabela 3 - Detecção de fitoplasmas em plantas de melão-de-São-Caetano utilizadas no presente estudo, por meio
de duplo PCR conduzido com os iniciadores específicos da região 16S rDNA e secY
Amostra Variedade 16S rDNA secY
Diluição Resultado Diluição Resultado
P1 Silvestre 1:5 + 1:30 +
P2 Silvestre 1:5 + 1:30 +
P3 Silvestre 1:5 + 1:30 +
P4 Silvestre 1:5 + 1:30 +
P5 Silvestre 1:5 + 1:30 +
P6 Cultivado 1:5 + 1:30 +
P7 Cultivado 1:5 + 1:30 +
P8 Cultivado 1:5 + 1:30 +
P9 Cultivado 1:5 + 1:30 +
P10 Cultivado 1:5 + 1:30 +
P11 Cultivado 1:5 + 1:30 +
P12 Cultivado 1:5 + 1:30 +
35
Figura 3 – Detecção de fitoplasmas em amostras de plantas de melão-de-São-Caetano por meio da amplificação
de fragmentos de DNA de 1,2 Kb, em reações de duplo PCR conduzidas com os iniciadores P1/ P7 e
R16F2n/R2. M = Marcador (1 Kb Ladder); P1 a P5= amostras de DNA extraído de plantas de melão-
de-São-Caetano do tipo silvestre; P6 a P12= amostras de DNA extraído de plantas de melão-de-São-
Caetano do tipo cultivado; C+= padrão positivo da reação (vinca); C-= padrão negativo (mix da
reação+ água)
Figura 4 – Detecção de fitoplasmas em amostras de plantas de melão-de-São-Caetano por meio da amplificação
de fragmentos de DNA de 1,6 Kb, em reações de duplo PCR conduzidas com os iniciadores L15-
F1A(III)/Map-R1A(III), e SecY-F1(III)/SecY-R1(III). M = Marcador (1 Kb Ladder); P1 a P5=
amostras de DNA extraído de plantas de melão-de-São-Caetano do tipo silvestre. P6 a P12= amostras
de DNA extraído de plantas de melão-de-São-Caetano do tipo cultivado. C+= padrão positivo da
reação (chuchu); C-= padrão negativo (mix da reação+água)
36
2.3.2 Identificação do fitoplasma por PCR
Em todas as doze amostras submetidas ao duplo PCR conduzido com o par de
iniciadores R16(III)F2/R16(III)R1, específico para a identificação de fitoplasmas do grupo
16SrIII, ocorreu a amplificação de fragmentos de DNA de, aproximadamente, 0,8 Kb, os
quais são típicos para fitoplasmas do grupo 16SrIII (figura 5). Assim, ficou comprovado que
um fitoplasma deste grupo estava associado às plantas de melão-de-São-Caetano que exibiam
sintomas de superbrotamento. Fragmentos de 0,8 Kb também foram produzidos nos testes de
PCR, quando o DNA extraído de plantas de chuchu, comprovadamente portadoras de
fitoplasma do grupo 16SRIII, foi usado como modelo nas reações de amplificação.
Ensaios de duplo PCR com o emprego dos iniciadores R16(I)F1/R16(I)R1, específicos
para a identificação de fitoplasmas do grupo 16SrI, mostraram resultados negativos,
evidenciando a ausência de fitoplasmas deste grupo nas plantas sintomáticas de melão-de-
São-Caetano. No entanto, o DNA total obtido a partir de plantas de milho infectadas pelo
fitoplasma do enfezamento vermelho, um representante do grupo 16SrI, foi amplificado,
gerando um fragmento genômico esperado de 1,1 Kb e confirmando a validade do teste de
PCR (Figura 6).
A presença de fitoplasmas do grupo 16SrIII nas plantas da “variedade silvestre” já era
prevista, pois trabalhos anteriormente feitos com melão-de-São-Caetano demonstraram de
maneira consistente a associação entre um fitoplasma deste grupo e plantas doentes desta
espécie. A primeira descrição deste fitoplasma foi feita, no início da década passada, em
plantas de chuchu comercialmente cultivadas no estado do Rio de Janeiro (MONTANO et al.,
2000). Simultaneamente, neste mesmo trabalho, o fitoplasma foi identificado em plantas de
melão-de-São-Caetano que cresciam nas adjacências de culturas de chuchuzeiro. Na época,
foi proposto que por se tratar de mesmo fitoplasma, as plantas silvestres poderiam atuar como
reservatório e/ou fonte de inóculo deste patógeno. O mesmo fitoplasma foi identificado,
alguns anos mais tarde, em plantas silvestres de melão-de-São-Caetano que se desenvolviam
em cercas utilizadas em áreas de pastagens, no estado de São Paulo.
A identificação de fitoplasma do grupo 16SrIII em todas as plantas da “variedade
cultivada” se constitui em nova informação, pois os relatos anteriores se referem somente a
plantas da “variedade silvestre”. É interessante comentar que os sintomas presentes nestas
plantas são idênticos àqueles observados nas plantas do tipo silvestre. Assim, foi verificado,
em condições de campo, uma grande redução no porte da planta, severa clorose foliar,
diminuição acentuada no tamanho das folhas e redução drástica nas dimensões dos frutos. As
plantas sadias de ambas as “variedades” podem ser distinguidas à distância, porém as plantas
37
doentes da “variedade cultivada” podem se confundir com aquelas da “variedade silvestre”,
tal é o efeito negativo da doença sobre as mesmas.
Fitoplasmas do grupo 16SrIII são encontrados com muita frequência em associação
com diversas doenças observadas em uma série de espécies cultivadas e não cultivadas nas
diversas regiões brasileiras. Representantes do grupo 16SrIII já foram relatados diversas ervas
daninhas como mentrasto, serralha, falsa-serralha, mentruz, carrapateira, buva, rubim,
guanxuma, erva de rato, joá-de-capote (ECKSTEIN, 2010) e em espécies de interesse
agronômico tais como cinamomo (DUARTE et al., 2009), videira (NERONI, 2009),
abobrinha (MELO et al., 2009), maracujá (RIBEIRO, 2008), macieira (RIBEIRO et al.,
2007), bucha-vegetal (MONTANO et al., 2007), couve-flor (RAPUSSI-DA-SILVA;
BEDENDO, 2008), bico-de-papagaio (PEREIRA et al., 2006), begonia (RIBEIRO et al.,
2006), abóbora (MONTANO et al., 2006), tomate (AMARAL MELLO, 2003), chuchu
(MONTANO et al., 2000), mandioca (BARROS et al., 1998; FLÔRES, 2010), crotalária
(BARROS et al., 1998) e berinjela (BARROS et al., 1998).
Assim, o melão-de-São-Caetano, “variedade cultivada”, embora da mesma espécie que
aquele da “variedade silvestre”, pode ser relacionado como mais um hospedeiro deste
importante grupo de fitoplasmas.
Figura 5 – Identificação de fitoplasmas em amostras de plantas de melão-de-São-Caetano por meio da
amplificação de fragmentos de DNA de 0,8 Kb, em reações de duplo PCR conduzidas com os
primers P1/P7 e R16(III)F2/ R16(III)R1. M = Marcador (1 Kb Ladder); P1 a P5= amostras de
DNA extraído de plantas de melão-de-São-Caetano do tipo silvestre. P6 a P12= amostras de DNA
extraído de plantas de melão-de-São-Caetano do tipo cultivado. C+= padrão positivo da reação
(chuchu); C-= padrão negativo (mix da reação+água)
38
Figura 6 – Identificação de fitoplasmas em amostras de plantas de melão-de-São-Caetano por meio da
amplificação de fragmentos de DNA de 1,1Kb, em reações de duplo PCR conduzidas com os
primers P1/P7 e R16(I)F1/R16(I)R1. M = Marcador (1 Kb Ladder); P1 a P5= amostras de DNA
extraído de plantas de melão-de-São-Caetano do tipo silvestre. P6 a P12= amostras de DNA
extraído de plantas de melão-de-São-Caetano do tipo cultivado. C+= padrão positivo da reação
(milho); C-= padrão negativo (mix da reação+água)
2.3.3 Detecção por microscopia eletrônica
As secções ultrafinas de pecíolo visualizadas ao microscópio eletrônico de transmissão
evidenciaram a presença de corpúsculos pleomórficos de tamanho variável, no lúmen dos
elementos de vasos do floema (figura 7). Estas células sem forma definida são típicas de
fitoplasmas, pelo fato de não apresentarem a parede celular que confere um formato constante
às mesmas. Corpúsculos desta natureza são frequentemente observados em plantas infectadas
por fitoplasmas, desde que sua concentração nos tecidos seja relativamente elevada. A
importância da microscopia eletrônica de transmissão no estudo dos fitoplasmas, data da
descoberta destes procariotos há mais de quarenta anos (DOI et al., 1967). Esta técnica tem
permitido confirmar diagnósticos baseados nos sintomas exibidos pelas plantas suspeitas de
infecção. No Brasil, a microscopia eletrônica tem contribuído sobremaneira para o
conhecimento das doenças de etiologia fitoplasmástica, possibilitando listar numerosas
doenças deste tipo que ocorrem em diversas espécies botânicas (BEDENDO, 2012). Embora
fitoplasmas tenham sido relatados em plantas de melão-de-São-Caetano ao longo dos anos,
salvo melhor conhecimento, nenhum registro microscópico foi publicado. No presente
trabalho, foi possível visualizar e fotografar as células de fitoplasmas nos vasos de plantas
sintomáticas, complementando os resultados obtidos através do uso de técnica molecular para
evidenciar a presença de fitoplasmas em plantas doentes.
39
Figura 7 – Corpúsculos pleomórficos, observados ao microscópio eletrônico de transmissão, presentes no lúmen
de elemento de floema de planta sintomática de melão-de-São-Caetano
2.3.4 Análise das sequências nucleotídicas
2.3.4.1 Análise das sequências do gene 16S rRNA
O alinhamento e análise das sequências amplificadas pelos iniciadores P1/P7 e
16F2n/16R2 em PCR duplo revelaram perfeita identidade entre estas sequências e aquelas
pertencentes ao fitoplasma associado ao superbrotamento do chuchu, um típico representante
do subgrupo 16SrIII-J (MONTANO et al., 2000). Este resultado, de certa forma, era previsto,
pois um fitoplasma deste mesmo subgrupo já havia sido identificado em plantas de melão-de-
São-Caetano (“variedade silvestre”) naturalmente infectadas (MONTANO et al., 2000;
RIBEIRO et al., 2004) e que apresentavam sintomatologia idêntica àquela observada nas
plantas da “variedade cultivada” amostradas para este estudo. Assim, ficou claramente
evidenciado que um fitoplasma do subgrupo 16SrIII-J está associado aos sintomas exibidos
pelas plantas da “variedade cultivada” da espécie M. charantia. Portanto, a chamada
“variedade cultivada” é hospedeira de um fitoplasma do subgrupo 16SrIII-J.
Este fitoplasma parece estar restrito à área geográfica da América do Sul, uma vez que
os relatos até agora existentes foram feitos em países pertencentes a este continente. Embora
descrito pela primeira vez em plantas de chuchu e melão-de-São-Caetano (MONTANO et al.,
2000), nos anos posteriores foi descrito, no Brasil, em plantas das famílias Amaranthaceae
(ECKSTEIN, 2008), Ampelidaceae (NERONI, 2009), Brassicaceae (RAPUSSI-DA-SILVA,
2010) e Solanaceae (ECKSTEIN, 2010; AMARAL MELLO et al., 2011).
40
2.3.4.2 Análise de RFLP in silico das sequências do gene secY
Após o alinhamento das doze sequências correspondentes aos doze isolados de
fitoplasmas encontrados nas plantas de melão-de-São-Caetano, foi observada a ausência de
polimorfismo entre as sequências amplificadas a partir do gene secY (dados não mostrados).
Com base nestes resultados, foi selecionada uma sequência como representativa das demais
sequências determinadas para estes isolados. Por outro lado, polimorfismo foi identificado
quando foram analisadas, por comparação, as sequências da região do gene secY pertencentes
a alguns fitoplasmas do grupo 16SrIII, as quais estavam disponíveis no Genbank, e a
sequência representativa do fitoplasma identificado nas plantas de melão-de-São-Caetano.
Neste caso, a comparação foi feita pela análise dos padrões de restrição gerados pela digestão
in silico destas sequências, com o uso de 18 enzimas de restrição previamente estabelecidas
(LEE et al., 2010), sendo os resultados ilustrados nas figuras 8 e 9. A construção de mapas
putativos de restrição com estas mesmas enzimas também serviram para evidenciar os
resultados previamente obtidos nas análises dos padrões de restrição virtuais. Isto permitiu
identificar os distintos sítios de restrição nas sequências do gene secY dos diversos
fitoplasmas membros de subgrupos afiliados ao grupo 16SrIII, incluindo o fitoplasma
presente nas plantas de melão-de-São-Caetano (Figuras 10, 11 e 12). Tanto os resultados
visualizados através dos modelos coletivos dos padrões de restrição como no conjunto dos
sítios putativos de restrição evidenciados nos mapas revelaram que a sequência nucleotídica
presente no fitoplasma encontrado nas plantas de melão-de-São-Caetano é idêntica àquela
presente no fitoplasma representante do grupo 16SrIII subgrupo J, associado ao enfezamento
do chuchuzeiro, confirmando a colocação do fitoplasma encontrado no presente estudo dentro
do subgrupo 16SrIII- J.
Os parâmetros analisados neste estudo revelaram que a sequência do gene secY
apresenta variabilidade genética, considerando-se alguns dos subgrupos componentes do
16SrIII aqui avaliados. Assim, os valores do coeficiente de similaridade entre as sequências
variaram de 0.41 a 1.00 (tabela 4), indicando a diversidade genética entre o fitoplasma
presente no melão-de-São-Caetano e aqueles representantes de outros subgrupos aqui
considerados. No entanto, este coeficiente revelou a completa identidade existente entre este
fitoplasma e o representante do subgrupo 16SrIII-J. Com base no gene 16S rRNA os
fitoplasmas estudados neste trabalho são classificados em 11 subgrupos, porém a
determinação dos valores dos coeficientes de similaridade calculados para estes mesmo
fitoplasmas com base no gene secY mostrou que os mesmos representam 10 subgrupos. Isto é
justificável, pois os representantes dos subgrupos 16SrIII-D e 16SrIII-M mostraram
41
identidade completa, uma vez que o valor do coeficiente de similaridade entre estes
fitoplasma foi igual a 1.0 (tabela 4). As enzimas AluI, BfaI, DraI, HinfI, MseI e RsaI foram
aquelas que permitiram detectar as maiores variações nas análises dos padrões coletivos de
restrição gerados pelas digestões in silico, como pode ser observado nos diferentes tipos de
padrões apresentados pelos diversos representantes dos grupos 16SrIII, caracterizados com
base no gene 16S rRNA (Tabela 5). Estudos complementares poderão fornecer maiores
subsídios confirmando estas enzimas como possíveis enzimas chaves para diferenciação de
grupos ou subgrupos de fitoplasmas. Os resultados aqui obtidos são plenamente concordantes
com o trabalho publicado por Lee e colaboradores (2010), o qual pode ser considerado como
um dos pioneiros dentre aqueles que buscaram demonstrar a validade do emprego do gene
secY como um marcador para estudos de diferenciação de fitoplasmas. A utilização de
múltiplos genes com diferentes graus de variabilidade genética realmente representa uma
ferramenta necessária e útil para a identificação de variabilidade genética e seu uso na
classificação de fitoplasmas.
42
Figura 8 - Padrões de restrição de RFLP gerados pela digestão in silico de fragmentos de DNA correspondentes
à região do gene secY de fitoplasmas representantes do grupo 16SrIII. Enzimas de restricão: AluI,
BamHI, BfaI,BstUI, DraI, EcoRI, HaeIII, HhaI, HinfI, HpaI,HpaII, KpnI, MboI, MseI, RsaI, SspI,
TaqI, Tsp509I. M=marcador φX174-DNA HaeIII digest. Fitoplasmas: CX (16SrIII-A), CYE (16SrIII-
B), PTB (16SrIII-C), GR1 (16SrIII-D), SP1 (16SrIII-E), MW1 (16SrIII-F), WWB (16SrIII-G), JR1Ph
(PoiBI)
43
Figura 9 - Padrões de restrição de RFLP gerados pela digestão in silico de fragmentos de DNA correspondentes
à região do gene secY de fitoplasmas representantes do grupo 16SrIII e do fitoplasma encontrado nas
plantas de melão-de-São-Caetano. Enzimas de restricão: AluI, BamHI, BfaI,BstUI, DraI, EcoRI,
HaeIII, HhaI, HinfI, HpaI,HpaII, KpnI, MboI, MseI, RsaI, SspI, TaqI, Tsp509I. M=marcador φX174-
DNA HaeIII digest. Fitoplasmas: MWB (16SrIII-J), MT117 (16SrIII-M), AKpot6 (16SrIII-N), ChWB
(16SrIII-J)
44
New DNA entry1262 bp
GC% in 3 bp blocks
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
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New DNA entry1271 bp
GC% in 3 bp blocks
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
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GR1
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Figura 10 – Mapas putativos de sítios de restrição envolvendo a região do gene secY de fitoplasmas pertencentes
ao grupo 16SrIII. Enzimas de restricao: AluI, BamHI, BfaI,BstUI, DraI, EcoRI, HaeIII, HhaI, HinfI,
HpaI,HpaII, KpnI, MboI, MseI, RsaI, SspI, TaqI, Tsp509I. Fitoplasmas: CX (16SrIII-A), CYE
(16SrIII-B), PTB (16SrIII-C), GR1 (16SrIII-D), SP1 (16SrIII-E)
45
New DNA entry1271 bp
GC% in 3 bp blocks
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MT117
Figura 11 – Mapas putativos de sítios de restrição envolvendo a região do gene secY de fitoplasmas pertencentes
ao grupo 16SrIII e do fitoplasma identificado em plantas de melão-de-São-Caetano. Enzimas de
restricao: AluI, BamHI, BfaI,BstUI, DraI, EcoRI, HaeIII, HhaI, HinfI, HpaI,HpaII, KpnI, MboI,
MseI, RsaI, SspI, TaqI, Tsp509I. Fitoplasmas: MW1 (16SrIII-F), WWB (16SrIII-G), JR1Ph (PoiBI)
(16SrIII-H), MWB (16SrIII-J), MT117 (16SrIII-M)
46
New DNA entry1271 bp
GC% in 3 bp blocks
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
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AKpot6
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ChWB
Figura 12 – Mapas putativos de sítios de restrição envolvendo a região do gene secY de fitoplasmas pertencentes
ao grupo 16SrIII. Enzimas de restricao: AluI, BamHI, BfaI,BstUI, DraI, EcoRI, HaeIII, HhaI, HinfI,
HpaI,HpaII, KpnI, MboI, MseI, RsaI, SspI, TaqI, Tsp509I. Fitoplasmas: AKpot6 (16SrIII-N), ChWB
(16SrIII-J)
Tabela 4 - Coeficientes de similaridade (F) calculados entre pares de fitoplasmas representantes de diversos
subgrupos do grupo 16SrIII e o fitoplasma identificado em plantas de melão-de-São-Caetano
(MWB)
SUBGRUPO A B C D E F G H J M N MWB
CX (16SrIII-A) 1
CYE (16SrIII-B) 0,495 1
PTB (16SrIII-C) 0,547 0,718 1
GR1 (16SrIII-D) 0,524 0,760 0,871 1
SP1 (16SrIII-E) 0,862 0,433 0,411 0,442 1
MW1 (16SrIII-F) 0,543 0,860 0,851 0,938 0,519 1
WWB (16SrIII-G) 0,924 0,427 0,423 0,415 0,878 0,435 1
JR1Ph (16SrIII-H) 0,981 0,495 0,471 0,485 0,880 0,485 0,924 1
ChWB (16SrIII-J) 0,477 0,584 0,504 0,576 0,472 0,576 0,467 0,495 1
MT117 (16SrIII-M) 0,524 0,780 0,851 1 0,500 0,938 0,475 0,524 0,673 1
AKpot6 (16SrIII-N) 0,524 0,820 0,851 0,979 0,480 0,938 0,455 0,504 0,634 0,979 1
MWB (16SrIII-J) 0,477 0,584 0,504 0,576 0,472 0,576 0,467 0,495 1 0,673 0,634 1
47
Tabela 5 – Tipos de padrões de restrição gerados por 10 das 18 enzimas usadas na digestão in silico do gene
secY, amplificado a partir de fitoplasmas pertencentes a diversos subgrupos do grupo 16SrIII,
incluindo o fitoplasma presente em melão-de-São-Caetano
FITOPLASMA ENZIMAS
AluI BfaI DraI HaeIII HhaI HinfI MseI Rsal TaqI Tsp509I
CX (16SrIII-A) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
CYE (16SrIII-B) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
PTB (16SrIII-C) 3 2 3 2 2 3 3 3 2 1
GR1 (16SrIII-D) 3 2 3 3 2 4 4 3 2 1
SP1 (16SrIII-E) 4 3 1 1 1 1 5 4 1 1
MW1 (16SrIII-F) 5 2 3 2 2 4 4 3 2 1
WWB (16SrIII-G) 1 2 1 1 1 1 6 1 1 1
JR1Ph (16SrIII-H) 6 2 1 1 1 1 1 1 1 1
ChWB (16SrIII-J) 7 4 4 3 3 5 7 2 3 3
MT117 (16SrIII-M) 3 2 3 3 2 4 4 3 2 1
AKpot6 (16SrIII-N) 3 2 3 3 2 4 4 3 2 2
MWB (16SrIII-J) 7 4 4 3 3 5 7 2 3 3
2.3.4.2 Analise filogenética
A árvore filogenética que ilustra a análise das relações filogenéticas entre fitoplasmas
representantes típicos de alguns subgrupos do grupo 16SrIII e o fitoplasma identificado em
melão-de-São-Caetano (figura 13) mostrou resultados que deram suporte àqueles revelados
nas análises de RFLP e similaridade de sequências. Na visualização da árvore pode ser notado
que os fitoplasmas do superbrotamento do chuchu e aquele do melão-de-São-Caetano
emergem do mesmo ramo com um valor de Bootstraping altamente confiável. Isto implica em
dizer que ambos pertencem ao mesmo subgrupo 16SrIII-J. Além disto, os fitoplasmas
pertencentes aos subgrupos 16SrIII-D e 16SrIII-M mostraram uma estreita relação
filogenética entre si, em perfeita concordância com os tipos de padrões de restrição gerados
pela digestão in silico da sequência do gene secY com diversas enzimas. As relações
filogenéticas entre os fitoplasmas componentes da presente árvore também acompanham as
mesmas tendências daquelas relatadas por Lee e colaboradores (2010), em relação aos
fitoplasmas componentes de distintos subgrupos do grupo 16SrIII.
48
Peach X-disease (GU004327) 16SrIII-A
Poinsettia branch inducing (GU004328) 16SrIII-H
Walnut witches-broom (GU004325) 16SrIII-G
Spirea stunt (GU004326) 16SrIII-E
Chayote witches broom (*) 16SrIII-J
Momordica witches-broom (*) 16SrIII-J
Clover yellow edge (GU004332) 16SrIII-B
Pecan bunchy top (GU004361) 16SrIII-C
Milkweed yellows (GU004340) 16SrIII-F
Goldenrod yellows (GU004364) 16SrIII-D
Potato purple top-MT (GU004333) 16SrIII-M
Potato purple top-AK (GU004359) 16SrIII-N
Acholeplasma palmae J233 (NR 029152.1)
Acholeplasma laidlawii JA1 (JN935888.1)100
100
80
43
82
44
38
83
89
71
43
Figura 13 - Árvore filogenética construída a partir de sequências do gene secY encontrado em fitoplasmas
afiliados a alguns subgrupos do grupo 16SrIII, fitoplasma identificado em melão-de-São-Caetano
(MWB) e os procariotos Acholeplasma laidlawi e Acholeplasma palmae. Os números nos ramos
indicam os valores de confiança baseados no “Bootstraping”. (*) As sequências foram determinadas
neste trabalho, porém não foram depositadas no GenBank. Estas sequências estão apresentadas no
apêndice localizado no final do texto da dissertação
49
3 CONCLUSÕES
Com base nos resultados do presente trabalho, as seguintes conclusões podem ser
apresentadas:
- O fitoplasma identificado nas plantas sintomáticas de melão-de-São-Caetano
“variedade cultivada”, tanto pela análise do gene 16S rRNA como do gene secY, mostrou ser
afiliado ao subgrupo 16SrIII-J.
- As análises das sequências nucleotídicas do gene secY não permitiram a
diferenciação genética dos isolados do fitoplasma pertencente ao subgrupo 16SrIII-J,
encontrados nas plantas de melão-de-São-Caetano.
50
51
REFERÊNCIAS
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APÊNDICES
62
63
APÊNDICE A
>Sequência do gene secY do fitoplasma presente nas plantas de meão-de-São-Caetano
(MWB).
ATGAAAATGGTAATAGATTTTCTTCGTGATAAAAGTAAAATAATTAAAAAAATTTTATTTACTTTAGTTATTTTA
TTTATCTTTGTTATCGGTAATAAATTAGTCATTCCTTATGTAACAGTTCAAGAAAAATTTCTTTTTGACATTAAAT
CGGCAATTTTTAAACTTTAAATGTCTGGTTTATTCGAAGCTAATGGTTCTATATATTTTTTATCTTTAGGGGTTTA
TCCTTATATTACTGCCTCTATTATTGTCCAGTTTGCGCAAAAATTATTTCCTTTTATGAAAGAATGGCAAGAACA
AGGCGAAAGAGGAAAATATAAAACCAATTTAGTGACTCGTTCTTTGACTTTGCTGTTTGCAGTAGGATTGGCTT
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>Sequência do gene secY do fitoplasma presente nas plantas de chuchu (ChWB)
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