1
RNA編集機構を利用した 部位特異的RNA変異導入法
福岡大学理学部化学科
助教 福田 将虎
2
本発明の概要
RNA編集酵素(ADAR)を目的RNAに誘導し、標的アデノシンをイノシンに変異する
※編集ガイドRNA
編集ガイドRNAを用いた新しいRNA変異導入技術
3
発表内容
1. 研究背景 2. RNA変異導入とRNA編集機構 3. 編集ガイドRNA 4. 実施例 5. 問題点と今後の展望
4
研究背景(タンパク質の合成経路 -セントラルドグマ-)
DNA
RNA タンパク質
設計図 生命現象の担い手
DNA情報を運ぶ
遺伝情報はDNA→RNA→タンパク質の順に流れる。 タンパク質の様々な機能により生命現象が支えられている
5
DNA
RNA タンパク質
多くの病気はタンパク質の機能異常により生じる
作られる量や機能が変わる
研究背景 (タンパク質機能の異常は病気の原因)
設計図 生命現象の担い手
DNA情報を運ぶ
6
DNA
RNA タンパク質
設計図 生命現象の担い手
DNA情報を運ぶ
タンパク質機能を自在に操ることができるようになれば、 生命現象を制御できる。
=病気の予防、治療ができる
機能制御
研究背景(タンパク質機能制御の位置づけ)
7
DNA RNA タンパク質
生体内標的タンパク質機能制御方法
情報 機能
情報のレベルで標的タンパク質の機能を制御
標的タンパク質の機能を直接制御する
(一般的な薬剤) (siRNAやゲノム編集技術)
RNA変異導入技術は確立されていない
8
DNA変異導入とRNA変異導入の違い
DNA変異 RNA変異
恒常的 一過的 (細胞が死ぬまで続く)
一度変異を導入すると元に戻らない
標的を容易に変更可能
RNA変異導入技術はDNA変異とは異なる効果が得られる
効果
標的
リスク
用途 DNA遺伝子治療 未開発
DNA RNA
9
本技術開発の目的
● siRNA, miRNAによる標的タンパク質発現抑制
細胞内在性の機構を利用するため、RNAを細胞に導入するだけ (外来のタンパク質を必要としない)
○ 標的RNAと相補的な配列を設計
(従来のRNAを標的としたタンパク質機能制御技術)
○
従来技術に匹敵する「RNA変異導入技術」を開発する
10
RNA編集機構
DNA
RNA タンパク質
N
NN
N
NH2
O
OH
OPO-
O
OPO O-
NH
NN
N
O
O
OH
OPO-
O
OPO O-
adenosine inosine
A-to-I RNA 編集
11
Prior to editing After A-to-I editing
AGU/C IGU/C
UAU/C UIU/C
ACA/C/G/U IGA/C/G/U
AUU/A/C IUU/C/A
AUG IUG
UAA UIA, UAI
CAU/C
CIU/C
AAA/G IGA/G
AAU/C IAU/C
CAA/G CIA/G
GAU/C GIU/C
GAA/G GIA/G
IAA/G
AIU/C
Ser
Tyr
Thr
Ile
Start/Met
Stop
His
Lys
Asn
Gln
Asp
Glu
Gly
Cys
Ala
Val
Val
Trp
Arg
Gly Glu
Asp Ser
Arg
Gly
Gly
UAG, UGA
UIG Stop Trp
A-to-I RNA編集によるコドン変換
N
NN
N
NH2
O
OH
OPO-
O
OPO O-
NH
NN
N
O
O
OH
OPO-
O
OPO O-
IはGとして翻訳される
A I
-AGU- -IGU- -GGU- Ser Gly
RNA編集によるコドン変換
タンパク質機能、リン酸化の制御
=
(例)
細胞内シグナル伝達を始め、多くの生体内プロセスの制御が可能
12
Adenosine deaminase acting on RNA (ADAR)
● ADARノックアウトマウスは、
ADAR1: 胚性致死
ADAR2: 生後2〜3週間で致死
RNA編集酵素
● 二本鎖構造中のアデノシンを編集する
Higuchi, M. et al., Nature, 406, 78. (2000)
Wang, Q. et al., Science, 290, 1765. (2000) dsRBD2 dsRBD1
Deaminase domain
Macbeth, M.R. et al. Science 309, 1534 (2005) Stefl, R et al. Cell, 143, 225. (2010)
hADAR2の構造 ● miRNAのプロセシング及びRNAサイレンシングを制御 Nishikura, K. et al. Cell, 153, 575. (2013)
N
NN
N
NH2
O
OH
OPO-
O
OPO O-
NH
NN
N
O
O
OH
OPO-
O
OPO O-
A I
● ほとんどの細胞種で発現(特に神経細胞で高発現)
13
A-to-I RNA編集機構を利用したRNA変異導入
dsRBD2
標的RNA
A I
hADAR2 標的RNAにADARを誘導し、 部位特異的にA-to-I変異を導入する
RNA変異導入法
標的アデノシン
14
標的部位の設定(相補配列)
標的RNA
標的アデノシン
相補配列
U�
15
従来のRNA変異導入法の特徴
U�
Stafforst, T., Schneider, M. F. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 11166. (2012)
(従来の方法は修飾したADARを用いる)
・煩雑な操作が必要
・内在のRNA編集に干渉する可能性
標的RNA
相補配列
16
編集ガイドRNA(AD-gRNA)コンセプト
標的RNA
A I
hADAR2
ADARを目的部位に誘導するガイドRNA
ADAR-guide RNA (AD-gRNA)
AD-gRNAによるRNA変異導入 ・内在のRNA編集機構を利用 ・相補配列で標的を設定
標的アデノシン
17
CAUUA GGUGGGUGG AUA UAUAACAAUAU
GUAGU CCAUCCACC UAU AUAUUGUUGUA
A G G C U A
A G C C
A
dsRBDsとGluR2 RNAの複合体
(Stefl, R et al. Cell, 143, 225. (2010))
hADAR2
dsRBD1 dsRBD2
Deaminase domain
GluR2 RNA (生体内の編集基質RNA)
編集ガイドRNA(AD-gRNA)設計コンセプト
18
GGGUGG AUA UAUAACAAUAU
XXXXX XXXUCCACC UAU AUAUUGUUGUA
A G G C U A
A G C C
A NNNNN NNN
編集ガイドRNA(AD-gRNA)設計コンセプト
標的RNA
AD-gRNA
相補領域 ADAR結合領域
● 天然型ADARを誘導 (内在のRNA編集機構を利用) ● 相補領域の配列で標的部位を設定
19
実施例 1 (AD-gRNAの設計と機能評価)
200
複合体形成確認(Gel shift assay)
(Annealing reaction condition) 300 nM GFPs RNA (160 nt) 900 nM AD-guide GFP_A200 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl 80 ºC 3 min, slope 25 ºC for 15 min
8% Native PAGE (EtBr staining)
Lane 1: GFPs RNA (160 nt) Lane 2: AD-guide GFP_A200 Lane 3: Annealed sample
1 2 3
hADAR2 A
+
in vitro editing reaction
RT-PCR
Direct sequencing
In vitro 編集解析
5’
ACUGGUGGGACUCGA
A GFP mRNA
UGACCACCCUGAGCU CGGCGUGCAGUGCUU
GCC
3’
AD-guide GFP_A200
3’ C
配列設計
20
(reaction condition) 12.5 nM recombinat ADAR2, 5 nM guide RNA -target RNA complex, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.5),2 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 0.01% TritonX-100, 5% glycerol reaction duration: 2 h
A GG GC T A C GG G C
hADAR2
A
Antisense RNA
A GG GC T G C GA G C
hADAR2
A
AD-guide RNA
A GG GC T A C G G C
A
hADAR2
No guide-RNA
GFP RNA
200
0
20
40
60
80
100
guide (-) antisense AD-guide GFP_A200
% e
ditin
g�
編集率(反応時間1時間) ※ ピーク高の比(G/(A+G))から算出
実施例 1 (AD-gRNAの設計と機能評価)
標的部位特異的な 変異導入に成功 (変異導入効率:約80%)
21
改変型ADg-RNA(ADg-rRNA)の設計
3’-antisense
GCCGCACGUCAUGAA C 5’ CGA
5’-antisense
200
5’
ACUGGUGGGACUCGA
A GFP mRNA
UGACCACCCUGAGCU CGGCGUGCAGUGCUU
GCC
3’
ADg-GFP_A200
3’ C
200
5’ A GFP mRNA
UGACCACCCUGAGCU CGGCGUGCAGUGCUU
3’
ADg-rGFP_A200
22
(reaction condition) 12.5 nM recombinat ADAR2, 5 nM guide RNA -target RNA complex, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.5),2 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 0.01% TritonX-100, 5% glycerol
編集率(経時変化)
guide RNA (-)
ADg-rGFP _A200
実施例 2 (ADg-rGFP_A200の設計と機能評価)
A200
変異導入効率の向上に成功 (変異導入効率:約100%)
23
新技術の特徴・従来技術との比較
• タンパク質因子を必要とする従来技術と比べ、本技術は編集ガイドRNAのみで目的変異導入を達成できる(使いやすい、低コスト)
• 標的部位の設定は単純な相補配列で設定できる (汎用性が高い、カセットベクター等の構築も可能)
• 本RNA変異導入法は、タンパク質機能制御に応用できるため、多くの生体内プロセスの制御に適用できる(創薬基盤技術への展開)
24
想定される用途
• 本技術(RNA変異導入)の特徴は、ゲノム情報を改変することなく、遺伝情報(タンパク質機能情報)を変換できることにある。
○ 新たな創薬基盤技術
核酸創薬(タンパク質リン酸化阻害剤、など)
○ 遺伝子変異導入ツール(基礎研究用)
25
実用化に向けた課題 • 現在、in vitro (培養細胞内)における変異導入が可
能。しかし、実細胞及び生物個体での実施が課題。
• 今後、初代神経細胞内及びマウス個体での編集ガイドRNAの機能性について実験データを取得し、条件設定を行っていく。
• アプタマー、siRNA等を用いた核酸創薬と同様の問題(コスト、薬効、ドラッグデリバリーなど)に直面する。逆に、これら技術に適用されている化学修飾や導入方法を応用し、実用化に向けて、編集ガイドRNAの最小化及び高機能化する必要がある。
26
企業への期待
• RNA変異導入技術の確立及びその応用研究に興味を持って頂ける企業。特に、核酸創薬及び生物個体における機能評価技術を持つ、企業との共同研究を希望。
• また、核酸医薬品を開発中の企業、遺伝子治療への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。
「RNA変異導入技術」を用いた創薬は未だ例が無い
27
本技術に関する知的財産権
出願番号 :特願2015-140894 出願人 :福岡大学 発明者 :福田 将虎
(発明の名称)
部位特異的RNA変異導入方法およびそれに使用する標的編集ガイドRNAならびに標的RNA-標的編集ガイドRNA複合体
28
問い合わせ先
福岡大学
研究推進部 産学官連携センター
担当コーディネーター 芳賀 慶一郎
TEL 092-871-6631(内線2809)
FAX 092-866-2308
e-mail [email protected]