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Ruolo dei linfociti T regolatori nella risposta immunitaria di cani affetti da Leishmaniosi Progetto/anno IZSAM 05/06 RC Auditorium del Parco della Scienza (TE) 9 Luglio 2012
Dr Michele Podaliri Vulpiani/ Dr Flavio Sacchini
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Ruolo dei linfociti T regolatori nella risposta immunitaria di cani affetti da Leishmaniosi
Le leishmaniosi canina è una zoonosi causata da un protozoo, Leishmania infantum, la cui trasmissione avviene mediante insetti vettori (flebotomi), è responsabile della leishmaniosi viscerale. .
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La conoscenza dei meccanismi immunopatogenetici nella specie canina è ancora oggi lacunosa. Importanti informazioni, sui meccanismi immunitari associati allo stato di progressione o di resistenza nelle infezioni sostenute da Leishmania spp, derivano da modelli sperimentali d’infezione su animali da laboratorio
In particolare è stato osservato che nel topo:
il controllo dell’infezione è associato a una risposta di tipo Th1
una risposta di tipo Th2 è invece associata a ipergammaglobulinemia e sintomatologia clinica
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Ruolo dei linfociti T regolatori nella risposta immunitaria di cani affetti da Leishmaniosi
Negli ultimi anni, l ’ immunologia ha focalizzato l ’ attenzione su una nuova popolazione di linfociti i linfociti T regolatori (Treg), caratterizzati da attività di tipo regolatrice e in grado di modificare e controllare il tipo di risposta immunitaria mediante interazioni dirette cellula-cellula o mediante il rilascio di mediatori quali le citochine anti-infiammatorie (IL-10)
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Valutare la risposta immunitaria nella sua componente umorale e cellulo mediata, in cani affetti da leishmaniosi e sottoposti a trattamento terapeutico;
Caratterizzare la popolazione di linfociti T regolatori nella specie canina e investigare il loro possibile coinvolgimento nella Leishmaniosi;.
Obiettivi del progetto
Valutare l’efficacia di due differenti protocolli terapeutici e l’evoluzione di alcuni parametri immunitari ed emato-biochimici a seguito del trattamento farmacologico.
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9 animali adulti, meticci, maschi e femmine, di peso compreso tra 11 e 33 kg, naturalmente infetti da Leishmania infantum. Un gruppo di 3 animali, trattato con Glucantime® ed Allopurinolo Teva® Un gruppo di 6 animali trattati con Milteforan ® ed Allopurinolo Teva®
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Durante il periodo di sperimentazione gli animali sono stati sottoposti:
ad esame clinico,
a prelievo di sangue intero e siero ogni 15 giorni per gli esami relativi a immunofenotipo linfocitario, esame emocromocitometrico, profilo biochimico-clinico, elettroforesi siero-proteica e valutazione del titolo anticorpale anti-leishmania mediante IFI.
Tutti gli animali sono stati sottoposti a trattamento periodico con Advantix® da Aprile ad Ottobre al fine di prevenire la diffusione della malattia ed eventuali re-infezioni.
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Materiali e Metodi
Identificazione dei linfociti Treg nel cane
Le attività di ricerca mirate all ’ identificazione e caratterizzazione morfologica e funzionale dei linfociti T regolatori nel cane, sono state svolte in collaborazione con il Regulatory T Cell Laboratory, Department of Veterinary Clinical Sciences, The Royal Veterinary College, London, UK. Questi studi sono stati condotti su una popolazione canina residente in Inghilterra (Pinheiro et al., 2011).
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Risultati
A seguito del trattamento è stata osservata una regressione della sintomatologia clinica e non sono state osservate differenze nei due gruppi di animali infetti trattati con due distinti protocolli terapeutici.
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Risultati Analisi di gruppo dei parametri immuno-ematici con
variazioni significative nel tempo e/o tra i due gruppi
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a b c d
e f g h
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Risultati
nel sangue e nei linfonodi periferici del cane è presente una popolazione di linfociti T regolatori caratterizzati dal fenotipo CD4+CD25highFOXP3highHelios+ sovrapponibile a quella osservata nel topo e nell’uomo
(c)
Caretterizzazione fenotipica dei Treg nel cane
Pinheiro et al. Phenotypic and functional characterization of a CD4(+) CD25(high) FOXP3(high) regulatory T-cell population in the dog. Immunology. 2011 Jan;132(1):111-22.
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Risultati
I linfociti T CD4+ CD25high sono in grado di inibire la proliferazione delle cellule T CD4+ attivate; al contrario, le cellule T CD4+ CD25- non hanno evidenziato attività soppressiva (a). Una soppressione della proliferazione pari a circa il 70% è stata osservata in un totale di 9 esperimenti eseguiti sia su cellule ottenute da sangue periferico che da linfonodi (b).
Caratterizzazione funzionale in vitro dei Treg nel cane
Pinheiro et al. Phenotypic and functional characterization of a CD4(+) CD25(high) FOXP3(high) regulatory T-cell population in the dog. Immunology. 2011 Jan;132(1):111-22.
Legenda: 1 Linfociti T CD4+ non stimolati 2 Linfociti T CD4+ coltivati con linfociti T CD4+ CD25 high 3 Linfociti T CD4+ coltivati con linfociti T CD4+ CD25 neg 4 Linfociti T CD4+ CD25 high coltivati da soli 5 Linfociti T CD4+ CD25 high coltivati in presenza di IL-2 6 Linfociti T CD4+ CD25 neg coltivati da soli 7 Linfociti T CD4+ CD25 neg coltivati in presenza di IL-2
(a) (b)
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Risultati
Le prove di stimolazione linfocitaria in vitro con Ag Leishmania non hanno evidenziato cellule CD4+ FOXP3high.
Le stesse prove hanno però dimostrato come l’Ag Leishmania sia in grado di promuovere la secrezione della citochina anti-infiammatoria IL-10 da parte dei linfociti (Treg?).
Studio del possibile ruolo dei Treg in corso di Leishmaniosi
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Conclusioni
Sulla base dei risultati ottenuti, possiamo quindi affermare che entrambi i protocolli terapeutici sono stati efficaci nel trattamento della leishmaniosi canina. Dal punto di vista pratico, l’impiego di due farmaci da
somministrare per via orale (miltefosina e allopurinolo) si presenta più agevole come modalità di somministrazione.
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Conclusioni
L’analisi dei parametri emato-biochimico impiegati
per monitorare l’evoluzione della malattia a seguito del trattamento, indica che i due protocolli terapeutici inducono variazioni di diverso grado ma con tendenze simili nel tempo, ad eccezione dei linfociti T nei quali si osservano andamenti opposti della sottopopolazione T CD3+CD8+ e del rapporto CD4/CD8 il cui significato richiede ulteriori studi.
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Conclusioni
Nel sangue e nei linfonodi periferici della specie canina sono presenti linfociti Treg CD4+CD25highFOXP3highHelios+ fenotipicamente e funzionalmente sovrapponibili a quelli osservati nel topo e nell’uomo.
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Conclusioni
In base ai risultati ottenuti non è possibile affermare
un coinvolgimento diretto dei linfociti Treg in corso di Leishmaniosi. Le prove in vitro su colture di linfociti, dimostrano che l’antigene Leishmania è in grado di promuovere l’attivazione di cellule con attività regolatoria, il rilascio di IL-10 e la modulazione in senso negativo della risposta immunitaria.
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Conclusioni
Le analisi del profilo citochinico in vitro hanno inoltre evidenziato, nei singoli individui, una capacità variabile dell’antigene di promuovere la produzione di IFN-γ. Nel complesso tali risultati lasciano ipotizzare il possibile ruolo di IFN-γ e IL-10 nell’evoluzione della risposta immunitaria e dell’eventuale eliminazione o sopravvivenza del parassita.
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Ruolo dei linfociti T regolatori nella risposta immunitaria di cani affetti da Leishmaniosi
GRAZIE PER L’ATTENZIONE