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Desarrollo de métodos analíticos multi‐residuo para el análisis de herbicidas en
agroecosistemasy su aplicación en muestras de campoy su aplicación en muestras de campo
M í V ó i C i L í G i L í
Farmacognosia y Productos Naturales Facultad de
María Verónica Cesio, Lucía Geis, Lucía Pareja, Silvina Niell, & Horacio Heinzen
Farmacognosia y Productos Naturales Facultad de Química Universidad de la República
Uruguay
Amadeo R. Fernández Alba
Universidad de Almería- EU-CRL for Fruits & Vegetables
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Los pequeños mundos que
interactúan en la innovación
Cómo acercarlos?
heinzen et al salto 21/7/2011
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Arroz en Uruguayg y
heinzen et al salto 21/7/2011
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Pesticidas más usados en Uruguayg y
Funguicidas Insecticidas HerbicidasCarbendazim +
TebuconazolCipermetrina Quinclorac + Clomazone +
Propanil
Kresoxim metil + Tebuconazole
Lambda cialotrina Clomazone+ Glifosato
Kresoxim metil + Epoxiconazol
Cipermetrina + Imidacloprid Quinclorac + Clomazone
Tebuconazol+ Trifloxistrobin Alfametrin + Imidacloprid Clomazone
Azoxistrobin Triflumurón Clomazone + Propanil
Tebuconazol clorpirifos Clomazone + Bispiribac-sodio
Pyraclostrobin + Epoxiconazol
deltametrina Bispiribac-sodio
Kresoxim metilTiametoxan+cialotina Bispiribac-sodio +
Quinclorac
heinzen et al salto 21/7/2011
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Clomazone Lambda-cyalotrina
Imazapic
Carbaril
ImazapicCarbendazim
Bentazone
Clorpirifós- metillCarbofuran
Quinclorac
Carbofuran
Metsulfurón-metil
Endosulfán Tebuconazol Propanil
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se gasta más energía para quitar las malezas de los cultivos del hombre que para
cualquier otra actividad humana" Holm, 1971
161 especies de malezas li t d
Ecosistemas 14 (2): 162-167. Mayo 2005V. H. Lallana
listadas
heinzen et al salto 21/7/2011
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heinzen et al salto 21/7/2011
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Pérdidas de pesticidas durante la aplicación
• Método de aplicación
25% volatilizacion, transporte, lixiviacionaplicación
• Frecuencia30% fuera del area de Frecuencia
• Lugar 40% sobre el cultivo
aplicacion
• Lugar
55% d l ti id li d55% del pesticida aplicado cae fuera del cultivo
heinzen et al salto 21/7/2011
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Ocurrencia de muestras con residuos ( )(EEUU)
heinzen et al salto 21/7/2011
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Porque residuos de herbicidas en suelos?
• Actividad herbicida residual entre cosechasActividad herbicida residual entre cosechas
P li d i ió di l• Peligro de contaminación por sedimentos al inundar
heinzen et al salto 21/7/2011
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Porque estudiar residuos de herbicidas en aguas de campo?
heinzen et al salto 21/7/2011
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Modelo ConceptualModelo Conceptual
heinzen et al salto 21/7/2011
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El i 2007 2009El comienzo 2007‐2009
NO EXISTIA EN LA LITERATURA METODO PARA ANALISIS SIMULTANEO DE HERBICIDAS DE
DISTINTAS CLASES QUIMICAS
6 HERBICIDAS X USD75= 450 USD/MUESTRA
heinzen et al salto 21/7/2011
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• Análisis de residuos de pesticidas o encontrar la aguja en un pajar
heinzen et al salto 21/7/2011
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METODO MULTIRRESIDUOMETODO MULTIRRESIDUO
DETECCION SIMULTANEA DE NUMEROSOS ANALITOS EN UN SOLO PASO ANALITICO
RESIDUOS DE 6 HERBICIDAS / MUESTRA 150 USD
heinzen et al salto 21/7/2011
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heinzen et al salto 21/7/2011
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Estrategia de trabajoEstrategia de trabajoMétodo analítico instrumentalComún a las distintas matrices
suelosComún a las distintas matrices
ANALISIS
granoaguas
heinzen et al salto 21/7/2011
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LC-UV-DAD analisis de herbicidas en muestras de arroz
6 herbicidas en una sola determinacion!!!
3 M t lf ó th3-Metsulfurón-methy
2-Bentazone,
1-Bensulfurón-methyly
4-Bispiribac sodium,
5-Pyrazosulfurón-ethyl,
6-Cyhalofop-butyl,
1 2 3 4 56LC-DAD
Analisis
Niell et al EPRW 2008heinzen et al salto 21/7/2011
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heinzen et al salto 21/7/2011
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1-Bensulfurón-metil
2-Bentazone
Condiciones del HPLC
2-Bentazone
3-Metsulfurón-metil
4-Bispiribac sodio
• Volumen de inyección: 20 µL
• Fase móvil MeCN:H20 pH 3 gradiente
5-Pirazosulfurón-etil
6-Cyhalofop-butil
7 Cl• Tiempo de análisis: 20 min.
• Columna: C18 (4.6 x 150mm, tamaño de
7-Clomazone
8-Propanil
9-Quincloracpartícula 5.0 µm).
• λ seleccionadas 220, 235, 240 y 247 nm.
9 Quinclorac
Roehrs et al JAOAC 2009heinzen et al salto 21/7/2011
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PaddyPaddy fieldfield waterwater fortifiedfortified at 0.5at 0.5 µg/Lµg/L
220 nm220 nm
235 nm235 nm
240 nm
1. Metsulfuron methyl, 2. Bentazone, 3. Bensulfuron methyl, 4. Bispyribac sodium,
247 nm
y , , y , py ,5. Pirazosulfuron ethyl, 6. Cyhalofop butyl.
Roehrs et al., J. AOAC int. 92 (4) (2009) 1190‐1195. Lucía Pareja et al., FPRW, July 2011heinzen et al salto 21/7/2011
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220 nm
1
235nm2
235nm
247 nm3
1 Clomazone 2 Quinclorac 3 Propanil
Lucía Pareja et al., FPRW, July 2011
1. Clomazone , 2. Quinclorac, 3. Propanil.PaddyPaddy fieldfield waterwater fortifiedfortified at 0.5at 0.5 µg/Lµg/L
heinzen et al salto 21/7/2011
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Muestras ambientales
Agua y SueloAgua y Suelo
heinzen et al salto 21/7/2011
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Método de Extracción para aguasMétodo de Extracción para aguas
2x1 ml MeOH pH 3 2x1 ml MeCN250 mL paddy field
Elution I Elution II
paddy field water pH3
C‐18/HLB
1250‐fold concentration
Reconstitution:
0.2 mL MeCNLC-DAD0.45 µm PTFE syringe
filter
Analysis
Roehrs et al., J. AOAC int. 92 (4) (2009) 1190‐1195. Lucía Pareja et al., FPRW, July 2011heinzen et al salto 21/7/2011
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SPE SPE cartridgecartridge selectionselection
100
120
102 100.2
109104.2
96.391
1 µg/L 5 µg/L
1 µg/L 5 µg/L
80
10089.9
81.5
6773
80.9
89.6
72.968.2
78
87 90.9 89.3
7380
85.491
87.5
79.5
very
100
120
140 123.8
68.2ry1 µg/L 5 µg/L
40
6046.7
% Recov
40
60
80
10046.7 100.274.0 74.0
% Recove
0
20 0
20
C18 C18 C18
Q i l Cl P ilC18 HLB C18 HLB C18 HLB C18 HLB C18 HLB C18 HLB
Bensulfuron methyl Bentazone Bispyribac sodium Cyhalofop butyl Metsulfuron methyl Pyrazosulfuron ethyl
Quinclorac Clomazone Propanil
RSD in the range 0.3‐16%, metsulfuron methyl 27% LOQ 1‐5 µg/L
Roehrs et al., J. AOAC int. 92 (4) (2009) 1190‐1195. Lucía Pareja et al., FPRW, July 2011heinzen et al salto 21/7/2011
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LOD y LOQ de los compuestos estudiadosen aguasg
Agua potable Agua de campoPesticidas LOD μg/L LOQ μg/L LODμg/L LOQ μg/LPesticidas LOD μg/L LOQ μg/L LODμg/L LOQ μg/L,
Metsulfuron methyl 0.03 0.1 1.70 5.0
Bentazone 0.03 0.1 0. 03 11.0
Bensulfuron methyl 0.03 0.1 0.3 0 1.0
Bispyribac sodium 0.04 0.1 1.17 5.0
P lf th l 0 03 0 1 0 3 0 1 0Pyrazosulfuron ethyl 0.03 0.1 0.3 0 1.0
Cyhalofop butyl 0.03 0.1 0.3 0 1.0
heinzen et al salto 21/7/2011
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Real Real paddypaddy fieldfield waterwater
PropanilPropanil13/116
Clomazone2/116
13/116
Quinclorac
0 2 4 6 8 10
Concentration mean (µg/kg)24 % of positive
Lucía Pareja et al., FPRW, July 2011
24 % of positive samples
heinzen et al salto 21/7/2011
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Matrix effectQuEChERS
Citrate Buffered QuECheRS
Modified QuEChERS
LC Qt MS/MSLC- Qtrap MS/MS
58 pesticides in a single chromatographic run!!!!
heinzen et al salto 21/7/2011
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AnalyticalAnalytical methodmethodLucía Pareja, ISC 2010
AnalyticalAnalytical methodmethodA 5500A 5500--QTRAPQTRAP--MS/MS MS/MS systemsystem waswas usedused withwith thethe followingfollowing
parameters and ESI source settings :parameters and ESI source settings :parameters and ESI source settings :parameters and ESI source settings :
Ion Spray Voltaje (IS): 5500/-4500 V (+/-),Source Temperature (T): 500 ºC, Curtain Gas(CUR): 20 psi, Collision Gas (CAD): Medium(N2), Ion Source Gas (GS1, GS2): 50, 50 psi.
144 MRMs in ESI +
Scheduled mode
Standard mode: dwell time 5 msec
10 MRMs in ESI -
Standard mode: dwell time 5 msec.
heinzen et al salto 21/7/2011
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Standard vs Standard vs scheduledscheduled modemode
Lucía Pareja, ISC 2010
Standard Scheduled
C lCycleTime
Reduces the duty cycle.Allows the detection of more MRM
Higher sensitivityA decrease in the background noise
heinzen et al salto 21/7/2011
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DIRECTIVE 2008/105/EC onIsoproturon
Lucía Pareja, ISC 2010
DIRECTIVE 2008/105/EC onenvironmental quality standards in the field of water policy.
p
Diuron
2,4-D
Carbofuran
National Primary Drinking Water Regulations, EPA.
heinzen et al salto 21/7/2011
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AnalyticalAnalytical methodmethodLucía Pareja, ISC 2010
yyChromatographicChromatographic separationseparation HLPC HLPC systemsystem
•Analytical Column: C-8 analytical column 150 x 4.6 mm,
5 µm particle size (Agilent Zorbax Eclipse XDB).
l• Injection volume: 5 µL.
•Mobile phase in gradient:
A A t it il (M CN)Table 1 Gradient Program for the positive mode
Total time(min)
% A % B
0 0 10 0 90 0
A: Acetonitrile (MeCN).
B: Water-0.1% Formic acid.
•Flow: 0 6 mL/min
Table 1. Gradient Program for the positive mode
RunRun time 35 min /15 min time 35 min /15 min
0.0 10.0 90.0
1.0 10.0 90.0
15.0 100.0 0.0
25 0 100 0 0 0
•Flow: 0.6 mL/min
positive and positive and negativenegativemodemode..
25.0 100.0 0.0
25.1 10.0 90.0
35.0 10.0 90.0 heinzen et al salto 21/7/2011
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PaddyPaddy fieldfield waterwater analysisanalysis
Lucía Pareja, ISC 2010
yy yy
Water samples were collected frompaddy fields in Valencia, Spain and Salto, Uruguay.
heinzen et al salto 21/7/2011
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SummarySummary discriminateddiscriminated bybytt
Lucía Pareja, ISC 2010
country country
2659 real
samples33
59 real samples
26 Uruguay
p33 Spain
p
19/3310/33
Figure 3. Pesticide occurrence
59 real samples
28 positive samples
4/26
15/33
10 samples3 pesticides
8 samples2 pesticides
3/26
15/335/26
10 samples1 pesticide
heinzen et al salto 21/7/2011
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Concentration ranges (Concentration ranges (µµg/L) of theg/L) of the
Lucía Pareja, ISC 2010
Concentration ranges (Concentration ranges (µµg/L) of the g/L) of the detected pesticides in real samples.detected pesticides in real samples.
LOQ
Valencia Uruguay
Concentration ConcentrationLOQ (ng/L)
Concentrationrange(µg/L)
Concentrationrange(µg/L)Pesticides
Bensulfuronmethyl 6 0.20-1.97 N. D
Carbendazim 9 N. D 0.52-0.75
Imidacloprid 4 N. D 0.26-0.36
Tebuconazole 5 0.09-0.65 0.08-0.99
Tricyclazole 2 0.10-1.50 N. D
heinzen et al salto 21/7/2011
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LOD of LOD of CarbendazimCarbendazim at 0.1 at 0.1 µg/L µg/L Lucía Pareja, ISC 2010
µgµgStandard
modeScheduled
mode
-
TricyclazoleTricyclazole in a real sample and in a real sample and standard standard solution at 0.1 solution at 0.1 µg/L µg/L level.level.
Paddy fieldwater
Standard in matrix
190.1/163.1
190.1/136.1
R ti 0 8 Ratio 0 8Ratio 0.8 Ratio 0.8
-
TebuconazolTebuconazol in a real samplein a real sample
Cl
NN
N
HO
15.8 µg/kg of tebuconazolein a polished rice sample
SRM 308 125
SRM 308 70
Lucía Pareja et al., FPRW, July 2011heinzen et al salto 21/7/2011
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lsuelos
Los pasos previos
Textura?
Materia orgánica?
heinzen et al salto 21/7/2011
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Triángulo texturalTriángulo textural
heinzen et al salto 21/7/2011
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Soil composition
pH % OM % Sand % Silt % Clay
meq/100g
Texture H2O KCl P K+ Ca2+ Mg2+ Na+
CL↓OM 5.7 4.6 2.4 34 27 39 22 0.27 11.2 2.8 0.19
C↑OM 5.4 4.6 7.1 23 26 51 12 0.52 13.5 5.8 0.70
L↓OM 5.1 4.1 2.9 50 28 22 3 0.19 2.3 1.0 0.15
CL ↑OM 5.4 4.5 5.8 33 37 30 5 0.33 7.0 3.7 0.34
heinzen et al salto 21/7/2011
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Los sistemas suelo/ agua/ pesticida son muy complejosMuchas de las desviaciones del modelo se deben a simplificacionesMuchas de las desviaciones del modelo se deben a simplificaciones teóricas y a un no adecuado análisis de los datos experimentales
heinzen et al salto 21/7/2011
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SELECCIÓN DEL METODO DE EXTRACCION
Herbicide Method 1 Method 2 Method 3 Method 4
% rec %RSD % rec %RSD % rec %RSD % rec %RSD
Metsulfuron methyl 75 9 73 4 69 13 78 1
Bentazone 92 1 63 20 86.8 0.1 81 2Bentazone 92 1 63 20 86.8 0.1 81 2
Bensulfuron methyl 92 15 89 5 75 13 76 5
Bispyribac sodium 23 23 37.4 0.6 24 2 51 9
Pyrazosulfuron ethyl 74 4 99 6 98 7 79 3
Cyhalofop butyl 86.3 0.2 73 3 82 15 84 3
Quinclorac 38 5 17 7 28 6Quinclorac 38 5 17 7 - - 28 6
Clomazone 84 9 22 24 - - 87 6
Propanil 89 2 43 3 - - 81 3
heinzen et al salto 21/7/2011
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Extraccion y Clean up de herbicidas en suelos de arroz
Liofilizaciontamizadotamizado
Extraccion con solvente ( MeOH‐ AcOEt/MeOH 30:70)
SHAKER
Evaporacion solvente Reconstituir ACNEvaporacion solvente Reconstituir ACN
Análisis HPLC‐DAD
Niell et al JAOAC, 2009heinzen et al salto 21/7/2011
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Análisis HPLC de muestras de suelos francos
1 2
3
6
LOQ 3 /K5 3μg/Kg
4
1, metsulfuron methyl; 2, bentazone; 3, bensulfuron methyl; 4, bispyribac sodium; 5, pyrazosulfuron ethyl; 6, cyhalofop butyl
heinzen et al salto 21/7/2011
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Soil composition
pH % OM % Sand % Silt % Clay
meq/100g
Texture H2O KCl P K+ Ca2+ Mg2+ Na+
CL↓OM 5.7 4.6 2.4 34 27 39 22 0.27 11.2 2.8 0.19
C↑OM 5.4 4.6 7.1 23 26 51 12 0.52 13.5 5.8 0.70
L↓OM 5.1 4.1 2.9 50 28 22 3 0.19 2.3 1.0 0.15
CL ↑OM 5.4 4.5 5.8 33 37 30 5 0.33 7.0 3.7 0.34
heinzen et al salto 21/7/2011
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Influencia de la naturaleza del suelo en la recuperación de analitos
heinzen et al salto 21/7/2011
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Influencia de la naturaleza del suelo en la recuperación de analitos
heinzen et al salto 21/7/2011
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Influencia de la naturaleza del suelo en la recuperación de analitos
heinzen et al salto 21/7/2011
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Real soil samples
55,7 µg/kg
heinzen et al salto 21/7/2011
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Real soil samples.
Clomazone3/120
Metsulfuron methyl
Cyhalofop butyl
Quinclorac 6/120
8/120
4/120
Bentazone
Bensulfuron methyl
Metsulfuron methyl 4/120
4/120
1/120
0 50 100 150 200
Propanil 8/120
19 % of
Concentration mean (µg/kg)
Lucía Pareja et al., FPRW, July 2011
positive samples heinzen et al salto 21/7/2011
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Arroz molido
Herbicidas de Postemergencia
Recuperación 80 105%+H2O
MeCN
MgSO
Recuperación 80‐105%
MgSO4AcONa
Agitar
Agua de campo
Suelos
centrifugación OASIS HLB ExtracciónMeOH
Alícuota filtrada por Na2SO4 elución Cambio
dede solvente
AnálisisLC‐DADheinzen et al salto 21/7/2011
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Matrix effectQuEChERS
Citrate Buffered QuECheRS
Modified QuEChERS
LC Qt MS/MSLC- Qtrap MS/MS
58 pesticides in a single chromatographic run!!!!
heinzen et al salto 21/7/2011
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POLO AGROALIMENTARIO dePOLO AGROALIMENTARIO de Paysandú
heinzen et al salto 21/7/2011
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equipamientoequipamiento
• Espectrómetro de masas acoplado a LCEspectrómetro de masas acoplado a LC
Q 000 S 3 000Q‐Trap 4000 USD377.000.‐
heinzen et al salto 21/7/2011
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What we do and what we could do with MS…
WFD
Priority ContaminantsyEuropean Water Framework Directive
(Decision 2455/2001/CE)
E i C t i tEmerging Contaminants
heinzen et al salto 21/7/2011
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ConclusionesConclusiones• Se desarrollo un metodo multirresiduo porHPLC‐DAD para la determinación simultáneaHPLC DAD para la determinación simultáneade 9 herbicidas de postemergencia
• Se acoplo este metodo a tratamientos de• Se acoplo este metodo a tratamientos demuestra sencillos y rápidos para aplicarlo alanálisis de residuos de 9 herbicidas en losanálisis de residuos de 9 herbicidas en losdistintos componentes (grano, suelo, agua) delagroecosistema productivo del arrozagroecosistema productivo del arroz
• Método sensible y robusto, pero para und li b j dinumero de analitos bajo, que se expandio a 58
por LC‐MS/MS heinzen et al salto 21/7/2011
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ConclusionesConclusiones
• Se analizaron muestras reales encontrándose• Se analizaron muestras reales encontrándose residuos de pesticidas en aguas y suelos
heinzen et al salto 21/7/2011
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Muchas i !!!!gracias!!!!
heinzen et al salto 21/7/2011