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Separación de célulasy
fraccionamiento subcelular
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Métodos físicos de SEPARACION DE CELULAS
* Necesarios para estudiar: - Tejidos con diferentes tipos celulares- Células con diferente funcionalidad/ actividad biológica- Subpoblaciones celulares con diferentes marcadores moleculares- Alternativa a la clonación: + rápidos, + rendimiento, (- pureza)
* Los más empleados explotan diferencias en:
– Tamaño celular
– Densidad
– Carga/Química superficial
– Dispersión de la luz (light scatter)
– Emisión de Fluorescencia
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b
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Beckman J2-21M, centrífuga equipada con un rotor y sistema de elutriación
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Rotor de elutriación (Beckman)
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Cámara de separación del rotor de elutriación
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Apariencia de las células aisladas de una fraccion de elutriación de células sanguíneas de la médula ósea humana cultivadas durante 8 días (a, b). Las células predominantes son de tipo fibroblastoide con un núcleo central, citoplasma difuso y pseudopodos aderentes y células grandes, redondas con un estrecho citoplasma y un núcleo central redondo. (tinción con hematoxilina). (a) x200; (b) x400. (c) Apariencia de las células aisladas de la misma fracción de elutriación y cultivadas en DMEM+20% FCS suplementado con dexametasona, ácido ascorbico y -glicerofosfato durante 8 días. En esas condiciones, las celulas presentan una morfologia redondeada o cuboidal con un núcleo central, x200.
Separacion de células por elutriación
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Separación de células sanguíneas con Ficoll-Hypaque
Centrifugación
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Separación inmunomagnética
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Selecciónpositiva
Selecciónnegativa
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Absorción de luz por un e- y la subsiguienteemisión de E como calor y fluorescencia
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Esquema de un Citómetro de Flujo (FACS)
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Funcionamiento de la boquilla vibradora de un citómetro de flujo
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Green fluorescence
Representación de los datos en citometría de flujo
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Esquema de un Citómetrode Flujo clasificador (“sorter”)
Puede seleccionar 1/1000células y clasificar miles/s
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Microdisección con láser
Sperm Tail Removal Biopsy at the Single Cell Level
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Fraccionamiento de componentes subcelulares
• Diseñados inicialmente para comprender el papel bioquímico de cada orgánulo en la célula
• La lisis (rotura) celular se suele realizar por: Potter, homogeneizador mecánico de tejidos, sonicación, cavitación, soluciones hipotónicas
• La separación de los componentes subcelulares se realiza generalmente por centrifugación
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Homogeneizaciónde la muestra
Centrífuga de alta velocidad
Potter
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1000 x g, 10 min
20.000 x g, 20 min
80.000 x g, 1 h (ultracentrífuga)
150.000 x g, 3 h
Fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial
citosol
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Comparación dela sedimentaciónpor velocidad (A)y por equilibriode sedimentación(isopícnica, B)
5-20%
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Purificación de orgánulos por centrifugación en gradiente de densidad
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Núcleos Microsomas (RER)
Peroxisomas
Control de calidad del fraccionamiento: TEM