Seqüenciamento de DNA via Phred-Phrap-Consed
Carlos André C. Pessoa
Algoritmos para Processamento de Cadeias CIn - UFPE - Mestrado/2001.1
RoteiroIntroduçãoProblemasIntegração Phred-Phrap-ConsedPhred Exemplos
Phrap Exemplos
ConsedReferências
IntroduçãoO seqüênciamento de DNA possui várias etapas distintas (algumas vezes isoladas), mas com um único objetivo global.
Gel Electrophroresis, Chromatograms, Base Calling, Sequence Assembly, etc.
ProblemasA realização isolada de atividades gera alguns problemas Perda de informações Duplicação de trabalho
Para compensar informações perdidas! Queda de performance Incompatibilidade de dados Lentidão no processo
DesafiosComo integrar a cadeia de processos necessária para o seqüenciamento de DNA ?
?
Solução: Phred-Phrap-Consed
Coordenado pelo Dr. Phil Green, Universidade de Washington, Seattle desde 1993.Sucesso mundial em projetos acadêmicos e comerciais.
Mais de 900 projetos e 36 países utilizam.Abrange desde a análise em laboratório de um organismo até a montagem de seus fragmentos de DNA em computador.
Phred-Phrap-ConsedTrês ferramentas destinadas a trabalhar em conjunto (pipeline) e explorar os benefícios dessa integração
Podem ser usadas isoladamente, mas os resultados são melhores quando usadas em conjunto
Exemplo: Phred gera dados extras que podem ser utilizados pelo Phrap como dados opcionais para melhorar seu desempenho. O mesmo ocorre entre Phrap e Consed.
Phred-Phrap-Consed - Pipeline
Cromatogramas
Phred
SeqüênciasCACATCCCCCTTTCGCCAG
40 52 55 47 19 10 34 ...Qualidade
PhrapContigs
+Informações úteis
Consed
Visualização dos contigs
PhredRealiza a transformação de cromatogramas (traces), provenientes das máquinas de seqüenciamento, em seqüências de DNA.
Baseado na análise do cromatograma, também associa um fator de qualidade para cada base da seqüência gerada.
Phred – Iterface via arquivos
Formatos:•SCF•ABI 737/377•MegaBACE ESD
Cromatograma
Phred
Formatos:•FASTA•XBAP•PHD•SCF
SeqüênciaCACATCCCCCTTT 12 23 20 56 50 53 ...
Qualidade
Phred – Fator de qualidadeA qualidade de cada base varia entre 4 e 60. Indica a chance da base estar correta
Quanto maior melhor É determinado pela análise do cromatograma
Q Pe Segurança10 1 em 10 90%20 1 em 100 99%30 1 em 1.000 99,9%40 1 em 10.000 99,99%50 1 em
100.00099,999%
Q = -10 * log10(Pe)
Pe = Probabilidade da base estar errada
Phred - ExemploEntrada:
Arquivo de cromatograma: LCP5AGGEU!LIKAA05.g Formato ABI 377
Saída:
Seqüência (formato FASTA):
>LCP5AGGEU!LIKAA05.g ...tgagtggnnnnnnntttgaacactgtg... ...cagtggcggggccggggcaacggtgtt......aaaccagctcttcttatatagg
Qualidade (formato FASTA):
>LCP5AGGEU!LIKAA05.g ... 6 8 8 8 6 6 4 0 0 0 0 0 0 0 4... ...15 11 9 8 8 8 8 8 9 9 9 9 9 11......8 7 7 7 7 7
Phred –Exemplo (visualização)
•Bases: 105-128
• Visualização via applet TraceViewer
•Qualidade ótima
Phred –Exemplo (visualização)
•Bases: 658-690
•Qualidade ruim
•Definição inferior
Phred – ParâmetrosAo executar o Phred, 50 parâmetros podem ser especificados de acordo com a necessidade do usuário. Exemplos:
Diretório dos arquivos de entrada/saída; Tipo do formato de saída; Rejeitar bases cuja qualidade seja inferior
a um limite especificado;
Phrap – Phragment Assembly Program
Realiza a montagem de seqüências de DNA em contigs.
Se as informações sobre a qualidade das seqüências lidas existir, estas são usadas para melhorar o desempenho.
Produz diversas informações sobre os contigs gerados
Úteis para ajudar na visualização do resultado e no processo de finalização da montagem de fragmentos.
Phrap – Interface via arquivos
Formato:•FASTA
Seqüências de DNA
Phrap
Formato:•FASTA
ContigsCCCCTTTCGCCAGACACAC
CCCCTTTCGCCAGTCGCCAGACACACTTTTTAAACC
Qualidade das seqüências10 12 10 20 30 23 12 ...13 35 23 43 34 33 34 ...10 23 12 23 34 23 23 ...
opcional
TTTTTAAACC
Informações Extras•Informações para Consed (.ace)•Lista de seqüências em cada contig•Qualidade das bases em cada contig•...
Phrap – Definição de contigs
1. Realiza um pre-processamento da entrada;
2. Determina regiões de overlap entre todos os pares de seqüências;
3. Cria um grafo direcionado baseado no passo 2;
4. Produz contigs baseado no grafo definido em 3;– Utiliza o algoritmo guloso para selecionar as arestas
em ordem decrescente
Phrap – Pre-processamento
1. Constrói os complementos das seqüências lidas (do arquivo “nome.fasta”) e adiciona ao conjunto de seqüências;
2. Elimina do conjunto as seqüências duplicadas;I. A similaridade entre todos os pares já é calculada
aqui;3. Faz um vector screening no conjunto;4. Salva o resultado num arquivo FASTA;
I. Esse novo arquivo (nomeado “nome.fasta.screen”) será o arquivo utilizado pelo phrap;
II. Um novo arquivo de qualidade, nomeado “nome.fasta.screen.qual” é também criado;
Phrap – Vector ScreeningI. Encontra no conjunto seqüências de bases que
correspondem a vectors. Tais bases são modificadas para ´X´ e não serão utilizadas pelo phrap;
II. Essas bases foram introduzidas em laboratório para a geração dos cromatogramas, portanto não fazem parte do organismo em estudo;
III. Os vectors a serem procurados, que são seqüências normais (acgt...), devem estar em um arquivo no formato FASTA;
IV. Caso este arquivo não seja informado, o phrap utiliza um arquivo padrão que contém todos os possíveis vectors usados normalmente;
Phrap – Exemplo Abordagem: Partir de uma seqüência conhecida,
dividir em partes, processar e observar a qualidade do resultado;
Explorar seqüências com repetições; Não foram utilizados arquivos de
qualidade, uma vez que as seqüências foram editadas manualmente;
Phrap – ExemploSeqüência original:
Entrada criada:
Resultado: Reconstrução total
1 2 3X X X 4
1 2
3
X
X2
3 X 4
X X
1 2 3X X X 4
Phrap – ParâmetrosAo executar o Phrap, 53 parâmetros podem ser especificados de acordo com a necessidade do usuário. Exemplos:
Qualidade padrão para cada base (caso não haja arquivo de qualidade);
Scores usados no alinhamento de seqüências (mismatch, insertion, deletion, etc);
Tamanho mínimo de overlap entre seqüências para que haja alinhamento;
Consed – The Contig Editor for Phred-Phrap
Ferramenta de visualização do resultado produzido pelo Phrap
Permite edição visual dos dados Inserção, remoção e alteração de (blocos de) bases
Fortemente integrada com o Phrap Permite que o Phrap perceba as alterações realizadas
em seu resultado e automaticamente tome as mesmas decisões em futuras montagens realizadas no mesmo projeto.
Consed – Iterface
ConsedFormato:•FASTA
ContigsCCCCTTTCGCCAGACACTTTTTAAACC
Informações•Informações para Consed (.ace)•Lista de seqüências em cada contig•Qualidade das bases em cada contig•...
Considerações FinaisEmbora os três programas sejam bastante parametrizáveis ...
Phred, 50 parâmetros; Phrap, 53 parâmetros
... se eles forem utilizados em conjunto, apenas um comando, PhredPhrap, é necessário para executar os programas e poder visualizar o resultado.
Considerações FinaisA utilização separada dos programas só é recomendada se o projeto não possuir os cromatogramas
Caso contrário, ou seja, se a entrada tiver origem de máquinas de seqüenciamento, o ideal é utilizar o Phred para gerar as seqüências.
Para que os arquivos de qualidade a serem usados pelo Phrap sejam produzidos.
Considerações FinaisA visualização do cromatograma pelo TraceViewer mostra que a não utilização dos arquivos de qualidade é uma grande desvantagem e é muito perigosa
Pois um fator de qualidade padrão tanto prejudica a montagem de partes boas quanto ruins da seqüência.
Considerações FinaisAo executar o phrap, observar se os vectors utilizados no seqüenciamento em laboratório estão sendo corretamente mascarados nas seqüências. Observando se no arquivo “.fasta.screen” os
vectors foram substituídos por seqüências de ‘X’; Se não, definir um novo arquivo com as
seqüências para cada vector.
ReferênciasThe Phred - Phrap Package: A brief description, http://www.phrap.com/background.htm
Phred, http://www.phrap.com/phred/index.htm
Consed - The Contig Editor for Phred-Phrap, http://www.phrap.com/consed/index.htm
The Phred/Phrap/Consed System Home Page, http://www.phrap.org/
Interpretation of Sequencing Chromatograms, http://seqcore.brcf.med.umich.edu/doc/dnaseq/interp.html
Trace Viewer, http://bcf.arl.arizona.edu/tools/TraceViewerApplet/phred-upload.php3