UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Nikola Mladenović
SPOSOBNOST PRODUKCIJE BIOFILMA OD STRANE
ODABRANIH SOJEVA MIKROORGANIZAMA
Master rad
Niš, 2015.
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
SPOSOBNOST PRODUKCIJE BIOFILMA OD STRANE
ODABRANIH SOJEVA MIKROORGANIZAMA
Master rad
Kandidat: Mentor:
Nikola Mladenović 88 dr Zorica Stojanović-Radić
Niš, 2015.
UNIVERSITY OF NIŠ
FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS
DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
BIOFILM-FORMING ABILITY OF SELECTED MICROBIAL
STRAINS
Master thesis
Candidate: Mentor:
Nikola Mladenović 88 PhD Zorica Stojanović-Radić
Niš, 2015.
ZAHVALNICA
Najsrdačnije se zahvaljujem svojoj mentorki dr Zorici Stojanović-Radić
prvenstveno na ugodnoj saradanji i
pomoći tokom laboratorisjkih istraživanja, kao i na ukazanoj pomoći, razumevanju
i strpljenju tokom izrade ovog rada.
Beskrajnu zahvalnost dugujem svojim roditeljima, na neizmernoj
ljubavi, moralnoj podršci i razumevanju tokom studiranja.
Hvala.
Biografija
Nikola Mladenović, rođen je 13.01.1989. godine u Vranju, gde 2004. godine
završava osnovnu školu ”Radoje Domanović”. Iste godine upisuje srednju Poljoprivredno
- veterinarsku školu ”Stevan Sinđelić”, smer veterinarski tehničar, koju završava 2008.
godine. Prirodno-matematički fakultet Univerziteta u Nišu, upisao je školske 2008/2009
godine na Odseku za biologiju i ekologiju. Osnovne akademske studije završava 2012.
godine sa zvanjem “biolog”. Iste godine upisuje master akademske studije, smer
Biologija na istom fakultetu.
Sažetak
Biofilm je zaštićena, sesilna zajednica mikroorganizama u kojoj oni pokazuju
drugačije fenotipske osobine u odnosu na istu vrstu, koja raste u uslovima van
biofilma. Sposobnost adhezije mikroorganizama na abiotičke i biotičke površine,
međusobna komunikacija ćelija i posledično funkcionisanje kao celina su od velike
važnosti u nastanku i preživljavanju biofilmova. Značaj biofilmova za čoveka je veliki,
što je posebno istaknuto u medicini, jer je utvrđeno da su biofilmovi uzročnici velikog
procenta hroničnih infektivnih bolesti.
Cilj master rada je bio da se ispita sposobnost produkcije biofilma odabranih
sojeva mikroorganizama u odnosu na tip podloge i koncentraciju dodatog šećera glukoze.
Testirani sojevi su deo kolekcije Mikrobiološke laboratorije Prirodno-matematičkog
fakulteta u Nišu, pri čemu je testirano više sojeva nekoliko vrsta patogenih
mikroogranizama i to: Staphylococcus aureus, Esherichia coli i Candida albicans.
Koncentracije šećera korišćene u eksperimentu iznosile su 0%, 0.25%, 0.5% i 1%.
Utvrđeno je da bakterije ostvaruju najveću produkciju biofilma u tripton soja bujonu
(TSB), dok je kvasac produkovao najveći biofilm kada je gajen u podlozi RPMI 1640.
Rezultati su pokazali odsustvo direktno proporcionalne veze između produkcije biofilma
i koncentracije dodatog šećera, osim u slučaju vrste Staphyloccocus aureus.
Ključne reči: biofilm, glukoza, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida
albicans.
Abstract
A biofilm is a protected, sessile community of microorganisms where the cells
show different phenotypic characteristics in comparison to the same species that grows
outside the biofilm. The adhesion of microorganisms to abiotic and biotic substrates, the
communication between cells and the consequently co-functioning are of the great
importance in the formation and survival of biofilms. Biofilms are very important to
humans, especially considering medicinal significance, because it was found that the
biofilms cause a large percentage of chronic infectious diseases.
The aim of the master thesis was to examine the ability of the selected strains of
microorganisms to produce the biofilm in relation to the type of substrate and
concentration of added glucose. The tested strains are part of a collection of the
Laboratory of Microbiology of the Faculty of Sciences and Mathematics in Niš, where
multiple strains of several species of pathogenic microorganisms were tested:
Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Candida albicans. The concentrations of the
glucose used in the experiment were 0%, 0.25%. 0.5% and 1%. It has been found that the
bacteria produce the highest amount of biofilm in tryptic soy broth (TSB), whereas the
yeast has produced the largest biofilm when grown in RPMI 1640 medium. The results
showed the absence of directly proportional connection between the production of a
biofilm and the concentration of the added sugar, except in the case of Staphylococcus
aureus species.
Keywords: biofilm, glucose, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida
albicans.
Sadržaj:
1. UVOD .......................................................................................................................... 1
1.1. Fizičke i hemijske osobine biofilma ....................................................................... 3
1.2. Značaj adhezije u formiranju biofilma .................................................................... 5
1.2.1. Faze formiranja biofilma .................................................................................... 5
1.3. Rezistencija (otpornost) biofilma ............................................................................ 7
1.4. Uloga biofilma u nastanku hroničnih infekcija kod ljudi ....................................... 8
1.5. Značaj i stanište biofilma ........................................................................................ 9
1.6. Opis i značaj istraživanih vrsta mikroorganizama ................................................ 11
1.6.1. Opšte karakteristike vrste Staphylococcus aureus ........................................... 11
1.6.2. Opšte karakteristike vrste Escherichia coli ...................................................... 13
1.6.3. Opšte karakteristike vrste Candida albicans ................................................... 15
2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA ........................................................................................ 17
3. MATERIJAL I METODE.......................................................................................... 18
3.1. Rastvori, podloge i reagensi .................................................................................. 18
3.2. Sojevi mikroorganizama ....................................................................................... 20
3.3. Određivanje sposobnosti produkcije biofilma različitih vrsta mikroorganizama . 22
3.4. Statistička analiza dobijenih rezultata ................................................................... 23
4. REZULTATI I DISKUSIJA ...................................................................................... 24
4.1. Ispitivanje sposobnosti produkcije biofilma različitih sojeva vrste Staphylococcus
aureus ............................................................................................................................. 25
4.2. Ispitivanje sposobnosti produkcije biofilma različitih sojeva vrste Escherichia
coli .................................................................................................................................. 30
4.3. Ispitivanje sposobnosti produkcije biofilma različitih sojeva vrste Candida
albicans .......................................................................................................................... 34
5. ZAKLJUČAK ............................................................................................................ 37
6. LITERATURA ........................................................................................................... 38
Master rad Nikola Mladenović
1
1. UVOD
U prirodi se mikroorganizmi mogu naći u individualnoj, slobodnoživećoj
planktonskoj formi ili u obliku sesilnih formi koje se nazivaju biofilmovi. U
biofilmovima su mikroorganizmi pričvršćeni za živi ili neživi supstrat i formiraju
zajednice u kompleksnom polimernom matriksu. Biofilm je rasprostranjen način života
mikroorganizama koji se može naći u svim sredinama (O'Toole et al., 2000), a razvija se
u cilju povećanja otpornosti i sposobnosti preživljavanja u specifičnom staništu.
Biofilm je prvi put opisan 1978. godine od strane J. Williams Costertona, koji je
utvrdio da zreo biofilm sačinjava zajednica mikroorganizama u kojoj su ćelije
međusobno povezane i uklopljene u vanćelijski matriks koga su same stvorile.
Mikroorganizmi koji grade biofilm imaju izmenjen fenotip usled promenjene brzine
razmnožavanja i drugačije transkripcije gena, što su osobine koje nisu uočene kod
planktonskih organizama iste vrste (Donlan & Costerton, 2002). Biofilm može činiti
samo jedna vrsta, ali je ipak u prirodi sastav mnogo kompleksniji (bakterije, kvasci,
virusi, amebe, plesni, alge, protozoe i njihovi produkti mogu činiti biofilm). Održavanje
formirane zajednice biofilma bilo bi nemoguće da ne postoji razvijena međusobna
komunikacija ćelija unutar biofilma, koja se vrši uz pomoć signalnih molekula (Hentzer
& Givskov, 2003). Unutar biofilma, mikroorganizmi su skriveni i zaštićeni od uticaja
faktora spoljašnje sredine. Sposobnost formiranja biofilma je najbitnija osobina
mikroorganizama i razvila se zbog toga što pruža ekološku prednost u preživljavanju
istih.
Biofilmovi se mogu formirati na živim (tkiva) i neživim površinama (plastika,
staklo, metal, drvo, kamen, hrana, čestice zemlje, medicinski implantati), a za njihov
razvoj neophodno je prisustvo biofilm formirajućih mikroorganizama, dostupnost
hranljivih materija, adekvatna podloga i vlažnost (Costerton et al., 1999). Adhezija
mikroorganizama, a samim tim i formiranje biofilma u velikoj meri zavisi od fizičko
Master rad Nikola Mladenović
2
hemijskog svojstva podloge. Utvrđeno je da mikroorganizmi lakše formiraju biofilmove
na hrapavim površinama, kao i da se bolje vezuju za nepolarne hidrofobne površine
(plastika), nego za hidrofilne materijale (metal, staklo). Vlažnost je od izuzetnog značaja
imajući u vidu činjenicu da se biofilmovi najbolje razvijaju na čvrstim površinama koje
su potopljene u vodu (Donlan, 2001).
Najveći značaj na ljudsku populaciju imaju biofilm produkujući mikroorganizmi
koji se javljaju u industriji za preradu i distribuciju vode, prehrambenoj industriji, i u
medicini kao izazivači infekcija (Donlan, 2001). Smatra se da je čak 65% humanih
infekcija izazvano biofilm produkujućim mikroorganizmima.
Zbog navedenog medicinskog značaja i činjenice da su za većinu humanih
infekcija odgovorni biofilmovi a ne planktonske ćelije, istraživanja kontrole ovih
mikroorganizama (efekta antimikrobnih supstanci) bi trebalo vršiti na biofilmovima, a ne
na planktonskim ćelijama. Metodologija koja se koristi pri istraživanjima biofilmova
uključuje nekoliko često korišćenih podloga, kao i dodatak šećera koji se razlikuje u
različitim literaturnim izvorima. Zbog toga je neophodno ispitivanje koja je metodologija
u smislu podloge i dodatka šećera najadekvatnija za datu vrstu mikroorganizma. U ovom
master radu je vršeno ispitivanje sposobnosti produkcije biofilma sojeva koji postoje u
kolekciji Mikrobiološke laboratorije Prirodno-matematičkog fakulteta, kao i njihova
zavisnost od vrste podloge i koncentracije dodate glukoze.
Master rad Nikola Mladenović
3
1.1. Fizičke i hemijske osobine biofilma
Mikroorganizmi koji žive unutar biofilma imaju značajno drugačije osobine od
slobodnoživećih formi iste vrste, jer im gusta i zaštićena sredina biofilma omogućava da
komuniciraju na različite načine (Stewart & Costerton, 2001).
Najvažniji deo biofilma je matriks, produkt samih bakterija i čini 50-90% mase
biofilma. Najvećim delom se sastoji od vode (95-99%), ekstracelularnih polisaharidnih
polimera (EPS, 2%) i mikroorganizama (2-5%). Kroz sam matriks prolaze mnogobrojni
vodeni kanali koji povezuju celokupni kompleks biofilma i služe za prenos hranljivih
materija i kiseonika do svih delova biofilma. Različite bakterijske vrste formiraju matriks
različitog hemijskog sastava, koji se vremenom povećava. Matriksni polimeri mogu
vezati jone metala, dvovalentne katjone (kalcijum ili magnezijum) i makromolekule
(lipide, DNK, proteine) koji pojačavaju vezu između komponenti matriksa (Dorlan,
2002). Hiperprodukcija ekstracelularnih polimera se javlja u uslovima povećane
koncentracije ugljenika i smanjene koncentracije fosfata, azota i kalijuma, kao i tokom
faze usporenog rasta bakterija i razmnožavanja unutar biofilma (Sutherland, 2001).
Ekstracelularni polisaharidni polimer (EPS) je visoko hidrirani biopolimer sličan gelu.
Odgovoran je za adheziju, stabilizaciju matriksa i za dostupnost hranljivih materija svim
delovima biofilma. Biofilm može delovati poput filtera i koncentrisati čestice sredine u
kojoj se nalazi, te zbog toga može biti različitog sastava (fibrin, eritrociti, trombociti,
DNK, RNK, lipidi, proteini, enzimi), što zavisi od površine na kojoj je formiran (Durack,
1975).
Zavisno od vrste mikroorganizama, količine dostupne hrane, kao i fizičkih faktora
sredine, postoje tri različita strukturna tipa biofilma: heterogeni mozaični tip, porozni
tip ispresecan vodenim kanalima i gusti konfluentni tip. Za sva tri tipa je zajedničko
to da sadrže mikroorganizme, ekstracelularne polisaharidne polimere (EPS) i delove sa
manjom gustinom koji im služe kao transportni kanali.
Master rad Nikola Mladenović
4
Heterogeni mozaični tip biofilma se može naći u sredinama sa nedovoljnom
količinom hranljivih materija, pri čemu se na supstratu stvara tanak i gust bakterijski sloj
od kojeg u okolinu polaze mikrokolonije u vidu stubića. Porozni tip, u obliku gljive,
građen je od većih mikrokolonija, koje su povezane sa supstratom preko tanjih traka
ekstracelularnih polimera. Između mikrokolonija i traka se nalaze vodeni kanali koji
dopremaju materije i nutritijente iz okoline do pojedinačnih bakterija. Ovaj tip se javlja u
prirodi i sadrži ne samo različite vrste bakterija, nego i gljive i protozoe. Treći,
konfluentni tip biofilma se može naći na dentalnom plaku. Građen je od različitih
bakterijskih vrsta koje međusobno razmenjuju hranljive materije. Iako se čini da u ovom
tipu postoje ograničenja rasta zbog nutritijenata, ovakav tip biofilma može da dostigne
najveću gustinu i debljinu (Durack, 1975).
Unutar biofilma, različite bakterijske vrste su u međusobnim mutualističkim
odnosima i imaju sposobnost komunikacije putem signalnih molekula, koja se naziva
‘quorum sensing’ (osećaj grupe). To je primitivan oblik komunikacije, koji je vrlo
značajan kada je u pitanju preživljavanje bakterija u ovoj zajednici. Bakterije tako jedna
drugoj mogu preneti informaciju o nekim promenama u okolini, nakon čega dolazi do
prilagođavanja metabolizma samih bakterija uslovima spoljašnje sredine (Greenberg,
2003). Zajednicu biofilma karakterišu pozitivna homeostaza i primitivni cirkulatorni
sistem (Costerton et al., 1995).
Biofilm može biti jako male visine, kada raste u vidu samo jednog sloja ćelija. Sa
druge strane, njegova debljina može biti i više centimetara, što zavisi od uslova rasta, ali i
od kvalitativnog i kvantitativnog sastava vrsta mikroorganizama koji ga sačinjavaju.
Rasejavanje biofilma je korisno za biofilm, jer obezbeđuju nove zajednice i širenje
biofilma. Neki od faktora koji utiču na rasejavanje su debljina biofilma, brzina i tok
tečnosti, prisustvo nutritijenata, kao i fizičke sile stresa (Lappin Scot & Costerton, 1992).
Master rad Nikola Mladenović
5
1.2. Značaj adhezije u formiranju biofilma
Najznačajniji korak u formiranju biofilma je adhezija planktonskih ćelija za
podlogu. Podrazumeva pripajanje ovih ćelija za ćelije domaćina, kao i prelazak na
kolektivni način života putem signala, pri čemu bakterije dobijaju zaštitni matriksni
omotač. Prve bakterije se vežu za podlogu van der Walls-ovim silama koje su jako slabe.
Najvažniji faktori koji utiču na adheziju su karakteristika bakterija i sredine, kao i
podloga na kojoj se biofilm formira. Što je podloga hrapavija, adhezija za podlogu je
bolja (Dorlan, 2002). Biofilm najčešće nastaje na granici dva agregatna stanja, nejčešće
čvrstog i tečnog. Njega najčešće formiraju bakterije, ali mogu i svi ostali
mikroorganizmi. Formiranje biofilma se odvija u nekoliko faza. Prvo se stvara mladi
biofilm koji vremenom sazreva, dobija nove karakteristike i postaje stabilan. Jedna od
značajnih osobina zrelog biofilma je odvajanje njegovih delova i otpuštanje (rasipanje)
bakterija u okolinu. U slučaju patogenih vrsta ovim procesom se delovi biofilma raznose
putem krvi u druge delove organizma, omogućavajući širenje postojeće i eventualni
nastanak sistemske infekcije.
1.2.1. Faze formiranja biofilma
Formiranje biofilma predstavlja složeni proces koji od bakterija iziskuje
kolektivno ponašanje. U okviru niše, bakterije će biti privučene ka određenim
površinama, što zavisi od količine nutritijenata, pH sredine, jonskih sila i temperature.
Podobnost površine u ovim parametrima, kao i karakteristike površine ćelija su od
izuzetnog značaja za to da li će ćelije imati afinitet za neku površinu. Ukoliko je površina
bogata organskim materijama i ima odgovarajuće naelektrisanje, ona će elektrostatičkim
silama privući bakterije i formirati vezu sa njima (Kostakioti et al., 2013). Ova veza je
slaba i u ovoj fazi procesa, bakterije se lako mogu otkačiti sa površine i neće doći do
formiranja biofilma. Pokretne bakterije imaju kompetitivnu prednost nad nepokretnim
Master rad Nikola Mladenović
6
bakterijama, jer brže i lakše dolaze do ovakvog supstrata pošto ne moraju da savladavaju
hidrodinamičke i odbojne sile. U drugoj fazi se stvaraju ireverzibilne veze sa supstratom
pomoću adhezina (pili, fimbrije, flagele, površinski protein poput Antigena 43). U trećoj
fazi bakterije rastu, razmnožavaju se prostom deobom i stvaraju mikrokolonije uronjene u
polimerni matriks. U četvrtoj fazi se količina i masa biofilma maksimalno povećavaju,
dok u petoj fazi dolazi do otkidanja i odvajanja pojedinih delova mikrokolonija i
kolonizacije novih, udaljenih površina i supstrata. Odvajanje delova biofilma nastaje
zbog promene strukture biofilma tokom vremena; samim tim bakterije mogu opet postati
pokretne i preći iz jedne mikrokolonije u drugu, zbog čega dolazi do slabljenja veza
između mikrokolonija i do disperzije biofilma (Tolker-Nielsen et al., 2000). To je faza u
kojoj je biofilm stvoren i mogu se menjati samo njegov oblik i veličina.
Slika 1. Formiranje biofilma
(preuzeto sa https://en.wikipedia.org/wiki/Biofilm)
Master rad Nikola Mladenović
7
1.3. Rezistencija (otpornost) biofilma
Dobro je poznato da su bakterije unutar biofilma čak do 1000 puta otpornije na
dejstvo antimikrobnih jedinjenja nego kada se nalaze u planktonskoj formi (Costerton et
al.,1995). Razlika između planktonskih i biofilm bakterija je u tome što planktonske
bakterije ne poseduju zaštitni matriksni sloj, nemaju komunikaciju sa drugim ćelijama,
kao ni usporeni metabolizam. Zbog svega navedenog su osetljivije na imuni sistem
domaćina, kao i na antibiotike. Unutar biofilma mikroorganizmi su zaštićeni od imunog
sistema domaćina (antitela, leukocita), kao i od dejstva antibiotika (Suci et al., 1994).
Matriks biofilma najvećim delom se sastoji od vode, što onemogućava brzo isušivanje
biofilma. Pored navedene funkcije, matriks štiti bakterije od promene pH i UV zračenja
(Flemming, 1991). Značajna osobina patogenih bakterija u biofilmu je pojačana aktivnost
efluks pumpi za izbacivanje antibiotika. Najveća aktivnost ovih pumpi je zabeležena u
dubljim slojevima biofilma, gde su metabolizam i razmnožavanje ćelija najsporiji (Maira-
Litran et al., 2000).
Međućelijska komunikacija koju vrše bakterije je još jedan faktor odgovoran za
rezistenciju biofilmova, jer bakterije mogu ‘upozoriti’ jedna drugu na delovanje
antibiotika. Bakterije koje prve dođu u kontakt sa antibiotikom pošalju informacije u
dublje slojeve biofilma, što dovodi do promene u ekspresiji gena (a samim tim i
metabolizma i fenotipa) ćelija koje su dobile te signale. Na taj način se modifikuju
membranski receptori i onemogućava antibiotiku da se veže za površinu ćelija.
Ipak, ne pokazuju svi biofilmovi visoku otpornost na antibiotike. Primer za to je
biofilm forma vrste Pseudomonas aeruginosa koja ne pokazuje veću otpornost na
antimikrobne lekove od planktonskih ćelija iste vrste (Spoering & Lewis, 2001).
Master rad Nikola Mladenović
8
1.4. Uloga biofilma u nastanku hroničnih infekcija kod ljudi
Akutne infekcije uzrokovane bakterijama vekovima su odnosile ljudske živote.
Razvojem medicine i farmaceutske industrije napravljeni su različiti lekovi i vakcine, što
je omogućilo kontrolu ovih akutnih infektivnih bolesti (Costerton et al., 2003). Uzročnici
biofilm infekcija su najčešće bakterijske vrste koje se nalaze u okolini, ali i one koje se
nalaze u organizmu kao komensali. Biofilm se u organizmu razvija na vitalnom i
nekrotičkom tkivu. Najvažnija karakteristika koja čini biofilm jedinstvenim u procesu
nastanka infekcije je mogućnost disperzije, što dovodi do nastanka embolije, infekcija
mokraćnog i krvnog sistema (Prakash et al., 2003), kao i izbegavanja imunog odgovora
domaćina. Danas su biofilmovi često izazivači hroničnih i teško izlečivih infekcija, pa se
iz tog razloga sve češće efikasnost antimikrobnih jedinjenja testira na biofilmu nego na
planktonskim ćelijama (Mah & O'Toole, 2001). Imuni sistem organizma uništava i
uklanja planktonske ćelije, ali je nemoćan protiv ćelija biofilma. Nakon što se smanji
koncentracija leka u organizmu ili prekine terapija usled poboljšanja zdravstvenog stanja,
biofilm se obnavlja i vraćaju se simptomi bolesti. Zbog toga je jako važno terapiju
ispoštovati do kraja kako bi antibiotici delovali u dubinu biofilma (Stewart & Costerton,
2001).
Biofilmovi nastali na medicinskim uređajima (kateteri ili implantati) i uzrokuju
hronične infekcije koje se jako teško leče (Donlan, 2008). Urinarni kateteri često sadrže
biofilm sačinjen od bakterija koje produkuju ureazu i razlažu ureu do amonijaka, pri
čemu se povećava pH sredine i stvaraju precipitati kalcijum i magnezijum fosfata koji
dovode do začepljenja katetera (Tunney et al., 1999).
Najčešće hronične infekcije uzrokovane biofilmovima su:
- cistična fibroza koju uzrokuje Pseudomonas aeruginosa
- mišićno-koštane infekcije koje uzrokuju Gram-pozitivne aerobne koke
Master rad Nikola Mladenović
9
- hronične rane, čiji su uzročnici različite aerobne i anaerobne bakterijske vrste
- infekcije urinarnog trakta i katetera
- upala srednjeg uva
1.5. Značaj i stanište biofilma
Biofilmovi se koriste u sistemima za prečišćavanje vode, kao i pri uklanjanju
opasnih materija koje su kontaminirale zemlju i podzemne vode. Poznato je da ove
sesilne zajednice mogu učestvovati u razgradnji brojnih zagadjivača životne sredine,
stvaranju i razgradnji organske materije, kao i kruženju azota. Međutim, štetno dejstvo
koje uzrokuje ogromne gubitke u industriji, kao i velike probleme u medicini uveliko
nadmašuje korisne aspekte upotrebe biofilmova. U medicini se biofilmovi povezuju sa
velikim brojem hroničnih infekcija, koje nastaju kao posledica infekcija biomaterijala
poput katetera, proteza, implantata i drugih medicinskih pomagala. Učestalost kao i
rezistencija na antimikrobnu terapiju su samo neke od bitnijih karakteristika biofilm
infekcija, koje predstavljaju jedan od najvećih izazova medicine danas (Beech et al.,
2004).
Biofilm možemo naći svuda oko nas. Formiraju se bukvalno na svakoj nesterilnoj
površini, kao i u veoma vlažnim sredinama.
- biofilmovi se mogu naći u najekstremnijim životnim uslovima, izuzetno toplim i
slanim vodama, veoma kiselim i alkalnim vodama, kao i u zamrznutim glečerima.
- važne su komponente lanaca ishrane u rekama i potocima, i predstavljaju hranu
ribama. Često se formiraju na površinama basena stajaćih voda.
- u ljudskom okruženju mogu da rastu u kupatilima, a posebno na slavinama i
tuševima jer oni predstavljaju toplo i vlažno stanište za njihov razvoj. Uzročnici su
korozije i začepljenja na cevima.
- nalaze se na površini i u unutrašnjosti biljaka, jako su štetni jer su uzročnici
različitih bolesti useva.
Master rad Nikola Mladenović
10
- biofilmovi u industriji nafte i gasa mogu da dovedu do ozbiljnih korozija
(Schwermer et al., 2008).
- biofilmovi se mogu naći na zubima većine životinja i mogu da izazovu karijes i
bolesti desni. Čovek ih korišćenjem četkice i paste delimično eliminiše.
- nedavne studije su otkrile da imuni sistem čoveka podržava razvoj biofilma u
debelom i slepom crevu. Ovo otkriće objašnjava moguće funkcije slepog creva i ideje da
slepo crevo može pomoći dobroj crevnoj flori.
Master rad Nikola Mladenović
11
1.6. Opis i značaj istraživanih vrsta mikroorganizama
1.6.1. Opšte karakteristike vrste Staphylococcus aureus
Gram-pozitivne koke
Raspoređene u grozdovima
Nepokretne
Fakultativno anaerobne
Nisu nutritivni probirači
Katalaza +
Striktni patogeni
Slika 2. Staphylococcus aureus
(preuzeto sa http://cit.vfu.cz/alimentarni-onemocneni/xsa/xsa01.jpg)
U rodu Staphylococcus se nalazi više vrsta. Sve vrste stafilokoka su široko
rasprostranjene. Za medicinu je značajno da se patogene vrste često nalaze na koži i u
nosu čoveka kao deo normalne flore malog procenta zdrave populacije ljudi. Mogu se
naći u vazduhu zatvorenih prostorija, u prašini, mleku i drugim životnim namirnicama.
Stafilokoke su Gram-pozitivne bakterije loptastog oblika (koke), koje su grupisane
u vidu grozdova. Postoji tridesetak vrsta stafilokoka, od kojih je najpoznatija
Staphylococcus aureus. Ova vrsta je najvažnija zbog svoje patogenosti. Određeni
patogeni sojevi ove vrste su razvili otpornost na veliki broj antibiotika, što je posledica
njihove prekomerne upotrebe.
Staphylococcus aureus ili zlatni stafilokok je bakterija iz grupe stafilokoka. Ime je
dobila po zlatno žutoj boji njegovih kolonija. Stafilokoke ove vrste kao i ostalih vrsta su
loptastog ili jajolikog oblika. Prečnik im iznosi 0,8 do 1 µm, ali im veličina varira od soja
Master rad Nikola Mladenović
12
do soja. Pri razmnožavanju stvaraju grozdolike nakupine, jer im se ćelije dele u tri i više
ravni. Stafilokoke formiraju ovakve nakupine uglavnom samo na površini čvrstih
podloga. Kada se razmnožavaju u tečnim podlogama, naročito u hranljivom bujonu često
obrazuju parove, ponekad i kratke lance. Kolonije Staphylococcus aureus su obično
zlatno žute boje, ali mogu biti i svetlo žute boje, krem pa čak i potpuno bele.
Kulturalne osobine. Većina sojeva stafilokoka se obilno razmnožava na mnogim
tečnim i čvrstim podlogama. Na hranljivom agaru obrazuju okrugle, konveksne, glatke
sjajne i žućkaste kolonije. Na krvnom agaru obrazuju kolonije koje su slične onima u
hranljivom. U hranljivom bujonu većina sojeva stafilokoka uzrokuje osrednje zamućenje,
a na dnu prašinasti talog. U tečnim podlogama ne proizvodi pigmente. Staphylococcus
aureus se razmnožava u želatinu i vrši njegovu razgradnju.
Otpornost. Spadaju u jako otporne bakterije. Većina ugine na temperaturi od
60°C tek posle jednog časa. Njihova važna osobina je znatna otpornost prema natrijum
hloridu (NaCl) i šećeru. Zbog toga se sojevi ove bakterije u slanim i slatkim namirnicama
ne samo vrlo brzo i obilno razmnožavaju, nego u njemu produkuju i znatne količine
svojih toksina.
Toksičnost. Ova vrsta je najvažnija zbog svoje patogenosti i izaziva mnoštvo
različitih infekcija i intoksikacija, počev od manjih infekcija kože (furunkul, karbunkul,
infekcija rane, itd.) do teških bolesti poput sepse, zapaljenja pluća, apscesa, sindroma
toksičnog šoka. Spada u fakultativno anaerobne bakterije, potreban joj je kiseonik za
dobijanje energije, ali može opstati i bez njega (Karakašević, 1987).
Važan je patogen koji uzrokuje biofilm infekcije kod ljudi, najčešće hroničnih
infekcija kože (hroničnih rana). Brojni sojevi stafilokoka produkuju biofilm. Koža i
sluzokoža su odlične barijere protiv ove bakterije, ali njihovo oštećenje može uzrokovati
stvaranje apscesa. Ako stafilokok prodre do krvi izaziva sepsu. Otpornost ove bakterije
prema antibioticima je kodirana genima u plazmidima što uzrokuje rezistentnost bakterije
na antibiotik (Marris et al., 1998). Biofilm stafilokoka se sastoji od polisaharidnog
intracelularnog adhezina (Gatz, 2002). Uloga ovog adhezina je u odbrani bakterija od
imunog sistema domaćina.
Master rad Nikola Mladenović
13
1.6.2. Opšte karakteristike vrste Escherichia coli
Gram-negativni bacili
Pokretni (peritrihe)
Fakultativno anaerobni
Asporogeni
Inkapsulirani
Laktoza +
Deo su fiziološke mikroflore
Uslovni patogeni
Slika 3. Escherichia coli
(https://www.studyblue.com/notes/note/n/test-1-bacteria-and-fungus/deck/5692531)
U rodu Escherichia nalazi se nekoliko vrsta. Medicinski značaj ima samo jedna
vrsta Escherichia coli, koja predstavlja jednu od najčešće izolovanih bakterija do sada.
Escherichia coli je Gram-negativan, kratak štapić dužine 2 do 6 µm, a debljine 1.0 do 1.5
µm. Ćelije mogu biti pojedinačne, u parovima ili nepravilnim nakupinama, a raspolažu
peritrihalnim flagelama i jako su pokretne.
Kulturalne osobine. Escherichia coli je aerobna i fakultativno anaerobna
bakterija. Uspeva dobro na svim podlogama. Kolonije ove bakterije na površini čvrstih
podloga mogu biti okrugle, glatke, sjajne, bezbojne. Neki sojevi ponekad imaju tanku
kapsulu. Fermentiše mnoge šećere uz produkciju kiseline i gasa.
Otpornost. Bakterije ove vrste su veoma otporne, mogu živeti mesecima u vodi i
zemlji. U različitim vrstama hrane se lako i brzo razmnožavaju. Otporne su prema niskim
temperaturama, a toplota od 60 °C ih ubija nakon 15 minuta. Kao i sve enterobakterije i
Escherichia coli je jako osetljiva na hlor i hlorna jedinjenja. Relativno lako i brzo postaje
Master rad Nikola Mladenović
14
otporna na antibiotike i hemioterapeutike prema kojima je bila osetljiva. Optimalna
temperatura za njhovo razmnožavanje iznosi od 30 do 42 °C.
Toksičnost. Među sojevima ove bakterije ima onih koje luče ili sadrže razne
otrovne supstance (enterotoksine, adhezine). Pojedini sojevi izazivaju kod ljudi niz
različitih oboljenja (infekcije urogenitalnih organa, koli-sepsu, crevna oboljenja,
diarealna oboljenja) (Karakašević, 1987). Iako Escherichia coli čini deo ljudske crevne
flore, njeno prisustvo u hrani može biti znak nehigijenske upotrebe hrane i može poslužiti
kao pokazatelj fekalne kontaminacije (Norazah et al., 1998). Pasterizacijom i kuvanjem
hrane se može obezbediti eliminacija ćelija bakterije Escherichia coli, ali termička obrada
nije poželjna za sve vrste hrane i kontaminacija se ne može uvek sprečiti (Mead &
Griffin, 1998). Doza od 106-107 ćelija/gramu je potrebno da izazove infekciju (Norazah et
al., 1998). Najčešće od ove bakterije oboljevaju mala deca i starije osobe sa
kompromitovanim imunim odgovorom, što govori da odrasli ljudi imaju određene
mehanizme specifične otpornosti prema patogenim sojevima ove bakterije.
Master rad Nikola Mladenović
15
1.6.3. Opšte karakteristike vrste Candida albicans
Jednoćelijska gljiva koja pripada
grupi kvasaca
Loptastog ili elipsoidnog oblika,
glatkih zidova
Bojenje po Gramu pozitivno ili
gram varijabilno
Najčešća vrsta koja izaziva
gljivične infekcije kod ljudi
(preuzeto od https://en.wikipedia.org/wiki/Candida_albicans)
Kvascima se nazivaju jednoćelijske gljive koje se razmnožavaju pupljenjem, mada
ima kvasaca koji se razmnožavaju prostom deobom kao bakterije. Najčešći i najvažniji
patogeni kvasci se nalaze u rodu Candida. Mnoge vrste su komensali
ili endosimbionti domaćina i mogu se naći u digestivnom ili genitalnom sistemu. Od svih
vrsta kandida, za medicinu je najvažnija Candida albicans koja predstavlja
oportunističkog patogena. Na podlogama se najčešće vide pojedinačne ili grupisane
blastospore, loptastog ili jajolikog oblika, prečnika 2 do 4 µm, glatkih zidova.
Kulturalne osobine. Candida albicans raste na sabouraud dekstroznoj podlozi sa
4% maltoze ili glukoze, a dobro uspeva i na krvnom agaru. Najbolja podloga za
kultivaciju ove vrste je RPMI 1640. Posle inkubacije od 24 h do 48 h na temperaturi od
37°C porastu okrugle, glatke, bele kolonije. Kultura miriše na kvasac. Boji se po gramu
pozitivno ili varijabilno.
Toksičnost. Candida albicans može da uzrokuje infekcije (kandidijaze) kod ljudi i
životinja, posebno kod imunokompromitovanih pacijenata. Kandidijaza je relativno česta
Slika 4. Candida albicans
Master rad Nikola Mladenović
16
gljivična infekcija koja se sreće u oba pola i obično je lokalizovana, ali se u nekim
slučajevima sreću i sistemske infekcije izazvane ovom vrstom gljive. Candida albicans je
sve češći izazivač gljivičnih oboljena kože, sluzokože noktiju i unutrašnjih organa. Kod
čoveka može se pojaviti u svakom životnom dobu, ali se najčešće javlja kod dece i
starijih osoba. Normalni je stanovnik čovekovih organa za varenje, ali se nikada ne nalazi
kao slobodna u prirodi. Kod zdravih osoba može da se nađe u ustima ili vaginalnoj
sluzokoži, a do bolesti dolazi u slučaju slabljenja imuniteta i/ili narušavanja ravnoteže
normalne flore. Smatra se da glavni razlog leži u opadanju moći imunog sistema koji je
zadužen da drži populaciju na normalnom nivou. Gljivica ima veliku sposobnost adhezije
za ćelije sluzokože, što je posebno izraženo u prisustvu šećera, ugljen dioksida i niže pH
vrednosti (kisela sredina) (Karakašević, 1987).
Ramage et al. (2001) su u svojim studijama otkrili da patogene gljivice iz ovog
roda mogu izazvati površinske, kao i ozbiljne sistemske bolesti. Mnoge infekcije koje
izaziva ova vrsta su uključene u stvaranju biofilma na kateterima i implantatima.
Master rad Nikola Mladenović
17
2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA
Selekcija sojeva iz kolekcije Mikrobiološke laboratorije PMF-a u Nišu koje su
potencijalni producenti biofilma na osnovu literaturnih podataka
Ispitivanje produkcije biofilma odabranih sojeva mikroorganizama u odnosu na tip
korišćene podloge
Ispitivanje produkcije biofilma odabranih sojeva mikroorganizama u odnosu na
koncentraciju šećera u podlozi
Utvrđivanje zavisnosti produkcije biofilma od tipa podloge i koncentracije šećera i
utvrđivanje najproduktivnijeg soja
Master rad Nikola Mladenović
18
3. MATERIJAL I METODE
3.1. Rastvori, podloge i reagensi
Fiziološki rastvor je 0.85% (m/V) rastvor natrijum hlorida (NaCl) u destilovanoj
sterilisanoj vodi. Dobija se rastvaranjem 0.85 g natrijum hlorida (NaCl) u 100 ml
destilovane vode.
Hranljivi agar (HA) je podloga čija je namena kultivisanje širokog sprektra
mikroorganizama. Sastav ove podloge na 1000 ml je sledeći: pepton 15.00 g, mesni
ekstrakt 3.00 g, natrijum hlorid (NaCl) 5.00 g, kalijum fosfat 0.30 g, agar-agar 18.00 g
(konačna pH vrednost 7.3 na 25 °C). Priprema ove podloge je vršena suspendovanjem
38.00 g suve podloge u 1000 ml destilovane vode. Nakon stajanja od 15 minuta i
inicijalnog zagrevanja na rešou do potpunog rastvaranja, vršeno je razlivanje podloge i
autoklaviranje u trajanju od 20 minuta na 121 °C. Pre upotrebe podlogu ostaviti na
radnom mestu dok ne dostigne temperaturu okoline.
Sabouraud dekstrozni agar (SDA). Podloga koja sadrži 4% dekstroze, za
izolovanje i kultivaciju gljivica i kvasaca. Sastav ove podloge na 1000 ml je sledeći:
pepsin 10.0 g, dekstroza 40.0 g i agar 15.0 g. Odmeriti 65 g praha podloge i dodati 1000
ml hladne destilovane vode. Ostavi da stoji 15 minuta. Podlogu zatim pažljivo i uz
mešanje zagrevati do ključanja, da se potpuno rastvori i sterilisati u autoklavu 15 minuta
na 121 °C. Podlogu ohladiti na 50 °C, promešati i sterilno razliti u Petri ploče. Razlivenu
podlogu u pločama ostaviti da se ohladi i očvrsne.
Tripton soja bujon (TSB) je podloga za kultivaciju velikog broja
mikroorganizama. Sastav ove podloge na 1000 ml je sledeći: pepsin od kazeina 17.0 g,
soja pepsin 3.00 g, dekstroza 2.50 g, natrijum hlorid (NaCl) 5.00 g i kalijum-
hidrogenfosfat 2.50 g. Odmerti 30 g praha podloge i dodati 1000 ml hladne destilovane
vode. Podlogu pažljivo i uz mešanje zagrevati do ključanja, da se potpuno rastvori.
Master rad Nikola Mladenović
19
Rastvorenu podlogu razliti u epruvete i sterilisati u autoklavu 15 minuta na 121 °C.
Podlogu u epruvetama posle sterilizacije ostaviti da se ohladi i koristiti , ili do upotrebe
čuvati na temperaturi od 2 °C do 8 °C. Pre upotrebe podlogu ostaviti na radnom mestu
dok ne dostigne temperaturu okoline.
Hranljivi bujon (HB) je podloga za kultivaciju velikog broja mikroorganizama.
Sastav ove podloge na 1000 ml je sledeći: pepton 15.00 g, mesni ekstrakt 3.00 g, natrijum
hlorid (NaCl) 5.00 g, kalijum-hidrogenfosfat 0.30 g. Odmeriti 27.3 g praha podloge i
dodati 1000 ml hladne destilovane vode. Nakon stajanja od 15 minuta i inicijalnog
zagrevanja na rešou do potpunog rastvaranja, vršeno je razlivanje podloge i
autoklaviranje u trajanju od 20 minuta na 121 °C. Podlogu u epruvetama posle
sterilizacije ostaviti da se ohladi i koristiti, ili do upotrebe čuvati na temperaturi od 2 °C
do 8 °C. Pre upotrebe podlogu ostaviti na radnom mestu dok ne dostigne temperaturu
okoline.
Laktozni bujon (LB) je podloga čija je namena kultivisanje širokog spektra
mikroorganizama. Sastav ove podloge na 1000 ml je sledeći: tripsin 10.00 g, natrijum
hlorid (NaCl) 5.00 g i ekstrakt kvasca 5.00 g. Nakon stajanja od 15 minuta i inicijalnog
zagrevanja na rešou do potpunog rastvaranja, vršeno je razlivanje podloge i
autoklaviranje u trajanju od 20 minuta na 121 °C. Pre upotrebe podlogu ostaviti na
radnom mestu dok ne dostigne temperaturu okoline.
Kristal violet 1%. Osnova trifenilmetilenskog bojenja, koristi se u Gram bojenju
bakterija. Dobija se rastvaranjem 1.00 g NaCl u 1000 ml destilovane vode.
Fosfatni pufer (PBS-Phosphate Buffer Saline). Sastav ove podloge na 1000 ml
je sledeći: natrijum hlorid (NaCl) 8.00 g, kalijum hlorid (KCl) 0,20 g, Na2HPO4 1.44 g i
KH2PO4 0.24 g.
Sabouraud dekstrozni bujon (SDB) je podloga koja sadrži 2% dekstroze čija je
namena kultivisanje gljivica i kvasaca, kao i za njihovu detekciju pri kontroli sterilnosti
materijala. Sastav ove podloge na 1000 ml je sledeći: pepsin 10.00 g i dekstroza 20.00 g.
Koncentracija dekstroze od 2% i kisela sredina podloge favorizuju rast gljivica. Rast
mikroorganizama se vidi kao zamućenje podloge.
Master rad Nikola Mladenović
20
RPMI 1640 medium je namenjen za gajenje humanih i drugih ćelija u kulturi koje
rastu u suspenziji. RPMI 1640 podloga je proizvod istraživača Moore et al., sa instituta
"Roswell Park Memorial lnstitute", ро čemu је i dat naziv RPMI. Osnovni sadržaj
podloge je fosfatni pufer (PBS-Phosphate Buffer Saline), u koji se dodaju amino-kiseline
i vitamini. Hemijski sastav RPMI 1640 podloge je izuzetno kompleksan i sačinjavaju ga
veći broj neorganskih soli, aminokiselina, vitamina i ostalih komponenti (D-glukoza,
HEPES, fenol crveno i drugi).
3.2. Sojevi mikroorganizama
Za testiranje sposobnosti produkcije biofilma korišćene su 2 vrste bakterija i 1
vrsta kvasca. U eksperimentalnom delu korišćeno je 5 sojeva Staphyloccocus aureus, 8
sojeva Escherichia coli i 10 sojeva Candida albicans. U tabeli 1 su prikazani sojevi
mikroorganizama i poreklo izabranih sojeva.
Sojevi mikroorganizama Poreklo izabranih sojeva Šifra soja
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus ATCC 25923 S1
Staphylococcus aureus izolat iz rane S2
Staphylococcus aureus humani izolat S3
Staphylococcus aureus humani izolat S4
Staphylococcus aureus ATCC 6538 S5
Escherichia coli
Escherichia coli ATCC 8739 E1
Escherichia coli ATCC 11775 E2
Escherichia coli izolat iz rane E3
Escherichia coli izolat iz hrane E4
Master rad Nikola Mladenović
21
Escherichia coli ATCC 8739 E5
Escherichia coli izolat iz fecesa E6
Escherichia coli izolat iz urina E7
Escherichia coli ATCC 25822 E8
Candida albicans
Candida albicans izolat iz krvi C1
Candida albicans izolat iz krvi C2
Candida albicans izolat iz krvi C3
Candida albicans izolat iz krvi C4
Candida albicans izolat iz krvi C5
Candida albicans izolat iz krvi C6
Candida albicans izolat iz krvi C7
Candida albicans ATCC 24433 C8
Candida albicans izolat iz krvi C9
Candida albicans izolat iz krvi C10
Tabela 1. Sojevi mikroorganizama korišćenih u eksperimentu
Master rad Nikola Mladenović
22
3.3. Određivanje sposobnosti produkcije biofilma različitih vrsta
mikroorganizama
Ispitivanje sposobnosti produkcije biofilma je rađeno u plastičnim mikrotitar
pločama sa 96 bunarčića. Od prekonoćnih kultura bakterija i kvasca koje su uzgajane na
hranljivom agaru (bakterije) i Sabouraud dekstroznom agaru (kvasci), napravljene su
suspenzije u sterilnom fiziološkom rastvoru. Podešavanje turbiditeta suspenzija vršeno je
tako da odgovara turbiditetu 0.5 McFarland-a, koji odgovara koncentraciji bakterija 1-5 x
108 CFU/ml (Colony Forming Unit-jedinica za formiranje kolonija) na McFarland
densitometru (DEN-1, Biosan).
Slika 5. Suspenzije ispitivanih sojeva vrste Candida albicans podešenih na turbiditet od 0.5
McFarland jedinica
Bujoni koji su korišćeni za bakterije su tripton soja bujon (TSB), laktozni bujon
(LB) i hranljivi bujon (HB), dok je za kvasce korišćen RPMI 1640 i Sabouraud
dekstrozni bujon (SDB). U eksperimentu je testiran čist bujon bez dodate glukoze (0%
glukoze), kao i isti bujon sa tri različite koncentracije šećera. U bujone je nakon
autoklaviranja dodat šećer glukoza u odgovarajućim koncentracijama (0.25%, 0.5% i
Master rad Nikola Mladenović
23
1.0%), a zatim je rastvor sterilisan filtriranjem kroz filter sa porama prečnika 0.45 μm.
Finalna koncentracija ćelija (106 ćelija/ml) podešavana je dodavanjem određenog
volumena McFarland suspenzije u adekvatnu podlogu, nakon čega je zasejan bujon sipan
u bunačiće mikrotitar ploče u volumenu od po 100 μl. Ovako pripremljene mikrotitar
ploče stavljene su na inkubaciju, za bakterije 24 h, a kvasce 48 h.
Nakon inkubacije uklonjene su ćelije pipetom i vršeno je ispiranje 2 puta sa po 300
μl PBS-a, nakon čega su mikrotitar ploče stavljene na sušenje u sterilizatoru na 60 °C (20
minuta). U svaki bunarčić nakon sušenja je dodato po 200 μl 1% kristal violeta (CV) (20
minuta), nakon čega su mikrotitar ploče isprane 4 puta fiziološkim rastvorom i dodato po
250 μl 95% EtOH (30 minuta). Na kraju je prebačeno po 200 μl EtOH u druge mikrotitar
ploče i vršeno merenje na ELISA čitaču (A595), na Medicinskom fakultetu u Nišu.
Slika 6. Mikrotitar ploča nakon bojenja kristal violetom
3.4. Statistička analiza dobijenih rezultata
Dobijeni rezultati su obrađeni analizom varijanse (ANOVA) i tom prilikom je
rađeno poređenje srednjih vrednosti i računanje standardnih devijacija.
Master rad Nikola Mladenović
24
4. REZULTATI I DISKUSIJA
Na osnovu dobijenih rezultata izračunate su srednje vrednosti sa standardnim
devijacijama što je prikazano u vidu grafika u ovom radu. Dobijene vrednosti su
poređene sa kontrolnim vrednostima za svaku podlogu, koje su predstavljale apsorbancu
izmerenu za bunariće u kojima je bila određena podloga bez dodatih ćelija (apsorbanca
same podloge). Rezultati su predstavljeni u Tabeli 2.
Bujon Srednje vrednosti Standardne devijacije
Tripton soja bujon (TSB) 0.35 0.03
Laktozni bujon (LB) 0.27 0.06
Hranljivi bujon (HB) 0.24 0.09
Sabouraud dekstrozni bujon (SDB) 0.28 0.08
RPMI 1640 0.37 0.07
Tabela 2. Apsorbance podloga bez dodatih ćelija (kontrolne vrednosti)
Master rad Nikola Mladenović
25
4.1. Ispitivanje sposobnosti produkcije biofilma različitih sojeva
vrste Staphylococcus aureus
Rezultati o sposobnosti vrste S. aureus da formira biofilm u tripton soja bujonu
(TSB) predstavljeni su na grafiku 1. Rezultati pokazuju da najveću produkciju biofilma
ima soj S5- S. aureus (ATCC 6538), dok je najmanja produktivnost zabeležena kod soja
S4- S. aureus (humani izolat). Ukupan opseg apsorbanci u ovom bujonu je iznosio od 0.15
- 4.08, pri čemu je najveća vrednost zabeležena kod soja S5- S. aureus (ATCC 6538) sa
1% glukozom, a najmanja kod soja S2- S. aureus (izolat iz rane) bez glukoze.
Koncentracije šećera u ovom bujonu koje izazivaju najveću produkciju biofilma su 0.5%
i 1%, a najmanje vrednosti su zabeležene bez dodavanja šećera, što je i očekivano.
Grafik 1. Sposobnost produkcije biofilma različitih sojeva vrste Staphylococcus aureus
pri različitim koncentracijama šećera u TSB-u. S1- Staphylococcus aureus (ATCC 25923); S2- S.
aureus ( izolat iz rane); S3- S. aureus (humani izolat); S4- S. aureus (humani izolat); S5- S. aureus
(ATCC 6538).
Master rad Nikola Mladenović
26
Na grafiku 2 se vidi sposobnost formiranja biofilma vrste S. aureus u laktoznom
bujonu (LB). Ukupan opseg apsorbanci u ovom bujonu je iznosio od 0.19 - 1.65.
Analizom rezultata je dobijeno da najveću produkciju biofilma ima soj S3- S. aureus
(humani izolat), dok su najmanje produktivni sojevi S1- S. aureus (ATCC 25923) i S5- S.
aureus (ATCC 6538). Najveća vrednost apsorbance je zabeležena kod soja S3- S. aureus
(humani izolat) sa 1% glukozom, a najniža kod soja S2- S. aureus (izolat iz rane) bez
glukoze. Koncentracija šećera koja je u ovoj podlozi izazvala najveću produkciju
biofilma je 1%, dok najmanje vrednosti, kao i u TSB-u, imamo sa 0% šećera.
Grafik 2. Sposobnost produkcije biofilma različitih sojeva vrste Staphylococcus aureus
pri različitim koncentracijama šećera u LB-u. S1- Staphylococcus aureus (ATCC 25923); S2- S.
aureus ( izolat iz rane); S3- S. aureus (humani izolat); S4- S. aureus (humani izolat); S5- S. aureus
(ATCC 6538).
Master rad Nikola Mladenović
27
Formiranje biofilma stafilokoke u hranljivom bujonu (HB) je predstavljeno na
grafiku 3. Rezultati pokazuju da je najveću produkciju biofilma imao soj S4- S. aureus
(humani izolat), dok je najmanja produktivnost zabeležena kod sojeva S1- S. aureus
(ATCC 25923) i S5- S. aureus (ATCC 6538). Ukupan opseg apsorbanci u hranljivom
bujonu iznosio je od 0.09 – 0.69. Najviša vrednost je zabeležena kod soja S4- S. aureus
(humani izolat) sa 1% glukozom, a najniža kod soja S3- S. aureus (humani izolat) bez
glukoze. Koncentracije šećera koje su izazvale najveću produktivnost bakterija bile su
0.5% i 1%. Kao i u predhodne dve podloge, najmanje vrednosti apsorbance
(proporcionalna produkciji biofilma) su zabeležene bez dodatka šećera.
Grafik 3. Sposobnost produkcije biofilma različitih sojeva vrste Staphylococcus aureus
pri različitim koncentracijama šećera u HB-u. S1- Staphylococcus aureus (ATCC 25923); S2- S.
aureus (izolat iz rane); S3- S. aureus (humani izolat); S4- S. aureus (humani izolat); S5- S. aureus
(ATCC 6538).
Master rad Nikola Mladenović
28
Kada se uporede produkcije biofilma u sve tri podloge, najveću produktivnost od
testiranih pet sojeva imao je referentni soj S5- S. aureus (ATCC 6538) u TSB-u sa
vrednošću apsorbance od 4.08, a najmanju od 0.09 referentni soj S1- S. aureus (ATCC
25923) u HB-u. Soj S1- S. aureus (ATCC 25923) je pokazao najmanju sposobnost
formiranja biofilma u svim podlogama. Kod soja S2- S. aureus (izolat iz rane) i S3- S.
aureus (humani izolat) je utvrđeno da dodavanje šećera pozitivno utiče na razvoj biofilma
u svim podlogama. S4- S. aureus (humani izolat) je imao bolju produkciju u LB-u, nego u
TSB-u, što je potpuno obratno kod soja S5- S. aureus (ATCC 6538) koji je imao najbolju
produkciju u TSB-u.
Do sada je nekoliko istraživanja vršilo testiranja uticaja različitih koncentracija
glukoze na produkciju biofilmova ove vrste bakterije. U studiji Sarah et al.(1999) je
testirano koji su faktori značajni za produkciju biofilma ove bakterijske vrste, kao i utiče
li povećanje koncentracije glukoze na ovaj proces. Pri tome su testirani čist tripton soja
bujon i tripton soja bujon sa dodatkom 0.25% glukoze. Pored utvrđivanja činjenice da je
adhezija od osnovnog značaja za nastanak biofilma, istraživači su utvrdili da neki sojevi
stafilokoke formiraju jake biofilmove, neki slabe, a neki uopšte nisu biofilm produkujući.
Dodavanje glukoze kod većine ispitanih sojeva pospešuje produkciju biofilma u ovom
bujonu.
Yong Lim i saradnici (2003) su u svom istraživanju ispitivali sposobnost vrste
Staphyloccocus aureus da produkuje biofilm u odnosu na određene količine dodate
glukoze u TSB-u. Koncentracije šećera koje su koristili bile su 0.10%, 0.30%, 0.90% i
2.7%. Ukupan opseg apsorbanci im se kretao od 0.2 sa 0.10%, do 2.1 sa 2.7% glukoze.
Zaključili su da dodavanje šećera pospešuje produkciju biofilma. Takođe su utvrdili da
svi sojevi nisu isti producenti biofilma.
Sander Croes et al. (2009) su u svom istraživanju hteli da utvrde sposobnost vrste
Staphyloccocus aureus da formira biofilm. Zasejavali su sojeve ove vrste u TSB-u bez
dodatka glukoze, sa 0.1%, 0.25% i 0.5% glokoze. Na osnovu dobijenih rezultata su
utvrdili da je čak 60% sojeva ove vrste sposobno da formira biofilm pri minimalnoj
koncentraciji šećera od 0.1%. Apsorbance formiranih biofilmova su se kretale u opsegu
Master rad Nikola Mladenović
29
od 0.4 bez glukoze, do 2.3 sa dodatkom 0.5% glukoze. Ustanovili su da većina sojeva sa
povećanjem koncentracije šećera povećava produkciju biofilma.
U našem istraživanju, utvrđeno je da u svim podlogama postoji varijabilnost
sojeva u produkciji biofilma, ali da je ta produkcija najveća u TSB-u. Pored ovoga,
postoji direktna proporcionalnost između koncentracije šećera i produkovanog biofilma,
što se uočava kao pravilnost u svim podlogama i uklapa se sa prethodnim rezultatima
istraživanja na ovu temu. Referentni soj stafilokoke ATCC 6538 je u TSB pri svim
testiranim koncentracijama pokazao veću sposobnost produkcije biofilmova od kultura u
prethodnim studijama, koje su kao maksimalne vrednosti imale apsorbancu od 2.1 i 2.3
pri najvišim koncentracijama šećera. Zbog svega navedenog, može se zaključiti da je
najbolja podloga za produkciju biofilma vrste Staphylococcus aureus tripton soja bujon
(TSB), koja se i smatra optimalnom za rast stafilokoka. Utvrđeno je da dodavanje šećera
glukoze pospešuje produkciju biofilma kod ove bakterije.
Master rad Nikola Mladenović
30
4.2. Ispitivanje sposobnosti produkcije biofilma različitih sojeva
vrste Escherichia coli
Proučavanje sposobnosti produkcije biofilma vrste E. coli eksperimentalno je
rađeno na isti način kao kod vrste S. aureus. Korišćene su iste podloge i iste
koncentracije šećera.
Na grafiku 4 predstavljena je sposobnost produkcije biofilma vrste E. coli u tripton
soja bujonu (TSB). Kod soja E1- E. coli (ATCC 8739) i E3- E. coli (izolat iz rane)
uočavamo malu sposobnost formiranja biofilma sa dodatkom šećera. Ostalih šest sojeva
nisu pokazali produktivnost u TSB-u., jer su vrednosti apsorbanci bile jako niske.
Grafik 4. Sposobnost produkcije biofilma različitih sojeva vrste Escherichia coli pri
različitim koncentracijama šećera u TSB-u. E1- Escherichia coli (ATCC 8739); E2- E. coli
(ATCC 11775); E3- E. coli (izolat iz rane); E4- E. coli (izolat iz hrane); E5- E. coli (ATCC
8739); E6- E. coli (izolat iz fecesa); E7- E. coli (izolat iz urina); E8- E. coli (ATCC 25822).
Master rad Nikola Mladenović
31
Rezultati u laktoznom bujonu (LB), kao i u prethodnom bujonu, pokazuju da
testirani sojevi E. Coli ne produkuju biofilm, što možemo videti na grafiku 5. Soj E5- E.
coli (ATCC 8739) je imao povećanu apsorbancu u odnosu na ostale sojeve, što se desilo
u bujonu bez dodatka šećera (A595=0.37).
Grafik 5. Sposobnost produkcije biofilma različitih sojeva vrste Escherichia coli pri
različitim koncentracijama šećera u LB-u. E1- Escherichia coli (ATCC 8739); E2- E. coli (ATCC
11775); E3- E. coli (izolat iz rane); E4- E. coli (izolat iz hrane); E5- E. coli (ATCC 8739); E6- E.
coli (izolat iz fecesa); E7- E. coli (izolat iz urina); E8- E. coli (ATCC 25822).
Master rad Nikola Mladenović
32
Jako zanimljivi rezultati prikazani na grafiku 6 dobijeni su u hranljivom bujonu
(HB). Kod sojeva E2, E3, E4 i E5 javila se produkcija biofilma u bujonu bez dodatka
šećera, gde su se vrednosti kretale od 0.41 kod soja E4, do 0.67 kod soja E2. U ovom
bujonu, soj E8 je produkovao biofilm pri koncentraciji dodatog šećera od 0.5% i
vrednošću apsorbance od 1.20. Soj E1 i E7 nisu pokazali sposobnost da produkuju biofilm
u HB-u.
Grafik 6. Sposobnost produkcije biofilma različitih sojeva vrste Escherichia coli pri
različitim koncentracijama šećera u HB-u. E1- Escherichia coli (ATCC 8739); E2- E. coli (ATCC
11775); E3- E. coli (izolat iz rane); E4- E. coli (izolat iz hrane); E5- E. coli (ATCC 8739); E6- E.
coli (izolat iz fecesa); E7- E. coli (izolat iz urina); E8- E. coli (ATCC 25822).
Demba W. Jockson i saradnici (2002) su hteli da utvrde sposobnost E. coli da
formira biofilm sa i bez dodatka 0.2% glukoze. Testirani su klinički izolati ove bakterije.
Eksperiment je rađen na mikrotitar pločama, u LB medijumu, a ćelije biofilma su bojene
kristal violetom. Rezultati su pokazali da je dodavanje glukoze dovelo do smanjenja
Master rad Nikola Mladenović
33
produkcije biofilma, sa maksimalnim vrednostima od 0.6 bez šećera, i manjim od 0.1 sa
dodatkom 0.2% glukoze.
Moreira et al. (2013) su u svom istraživanju ispitivali sposobnost produkcije
biofilma vrste Escherichia coli sa dodatkom 0.25% i 1% glukoze u TSB medijumu. Rast
biofilma je praćen u vremenskom intervalu od 60 h (inkubacioni period). Najviše
vrednosti su izmerene nakon 24 h, gde je ukupan prosek apsorbanci sa dodatkom 0.25%
glukoze iznosio 0.14, a 0.26 sa 1% šećera. Nakon tog perioda vrednosti su lagano padale.
Za razliku od stafilokoka, ova vrsta pokazuje znatno manju sposobnost formiranja
biofilma, a mnoge sojeve ne možemo smatrati producentima biofilma. Vrednosti
apsorbance bile su u proseku 10 i više puta niže od onih koje su izmerene kod
stafilokoka. Utvrđeno je da glukoza nema značajan efekat na formiranje biofilma kod
svih sojeva i u svim podlogama. Jedini izuzetak od navedenog su pet sojeva u hranljivom
bujonu koji su najveću apsorbancu imali nakon inkubacije u bujonu bez dodatog šećera.
Master rad Nikola Mladenović
34
4.3. Ispitivanje sposobnosti produkcije biofilma različitih sojeva
vrste Candida albicans
Sposobnost produkcije biofilma kod kvasaca je eksperimentalno rađena na isti
način kao i kod bakterija. Razlika je bila jedino u tome što je inkubacija kod kvasaca
trajala 48 h. Bujoni korišćeni kod kvasca bili su RPMI 1640 i Sabouraud dekstrozni
bujon (SDB).
Sposobnost formiranja biofilma sojeva vrste Candida albicans u RPMI 1640 je
prikazana na grafiku 7. Prema dobijenim rezultatima najbolju produkciju biofilma imali
su sojevi C7 i C9 sa dodatkom šećera glukoze, dok je najmanja produktivnost zabeležena
kod sojeva C2 i C5. Ukupan opseg apsorbanci u ovom bujonu iznosio je 0.09 – 2.27, pri
čemu je najveća vrednost zabeležena kod soja C7 sa 1% glukozom, a najmanja kod soja
C5 sa 0.5% glukozom. Kod sojeva ove vrste produkcija biofilma nije bila direktno
proporcionalna sa koncentracijom šećera, jer je uočeno da povećanje koncentracije šećera
nije u svim slučajevima dovelo do povećanja apsorbance (produkcije većeg biofilma).
Grafik 7. Sposobnost produkcije biofilma različitih sojeva vrste Candida spp. pri
različitim koncentracijama šećera u RPMI 1640. C1- Candida albicans (izolat iz krvi); C2- C.
Master rad Nikola Mladenović
35
albicans (izolat iz krvi); C3- C. albicans (izolat iz krvi); C4- C. albicans (izolat iz krvi); C5- C.
albicans (izolat iz krvi); C6- C. albicans (izolat iz krvi); C7- C. albicans (izolat iz krvi); C8- C.
albicans (ATCC 24433); C9- C. albicans (izolat iz krvi); C10- C. albicans (izolat iz krvi).
Na osnovu dobijenih rezultata možemo zaključiti da vrsta Candida albicans ne
produkuje biofilm u Sabouraud dekstroznom bujonu (SDB), kao što se vidi na grafiku 8.
Vrednosti kod svih sojeva u ovom bujonu se kreću od 0.08 – 0.16, što je veoma slično
vrednostima koje su izmerene u kontrolnim bunarićima u kojima nije bilo bakterija ni
kvasca.
Grafik 8. Sposobnost produkcije biofilma različitih sojeva vrste Candida albicas pri
različitim koncentracijama šećera u SDB-u. C1- Candida albicans (izolat iz krvi); C2- C.
albicans (izolat iz krvi); C3- C. albicans (izolat iz krvi); C4- C. albicans (izolat iz krvi); C5- C.
albicans (izolat iz krvi); C6- C. albicans (izolat iz krvi); C7- C. albicans (izolat iz krvi); C8- C.
albicans (ATCC 24433); C9- C. albicans (izolat iz krvi); C10- C. albicans (izolat iz krvi).
Master rad Nikola Mladenović
36
Tomas H. i saradnici (2004) su ispitivali sposobnost produkcije biofilma kod vrste
Candida albicans u RPMI 1640 sa dodatkom 1% glukoze tokom vremenskog perioda od
3 do 48 h. Srednja vrednost apsorbanci nakon 3 h je iznosila 0.7, nakon 24 h je bila 2.4, a
nakon 48 h je pala na 1.3.
Rezultati našeg istraživanja su potvrdili opravdanost upotrebe podloge RPMI 1640
za produkciju biofilma vrste Candida albicans, jer se pokazala kao značajno bolja u
poređenju sa SDB podlogom. Opšta preporuka i zaključak bili bi da se u slučaju vrste C.
albicans preporučuje preliminarno testiranje koja koncentracija dodate glukoze najviše
doprinosi produkciji biofilma konkretnog soja, a tek onda treba pristupiti daljim
istraživanjima na biofilmu tog soja.
Master rad Nikola Mladenović
37
5. ZAKLJUČAK
Na osnovu rezultata prezentovanih u ovom radu mogu se doneti sledeći zaključci:
1. Najveću sposobnost produkcije biofilma od ispitanih vrsta je pokazala bakterija
Staphyloccocus aureus. Podloga u kojoj su sojevi ove vrste najviše produkovali
biofilm je tripton soja bujon (TSB). Kod ove vrste je potvrđeno da dodavanje
glukoze pospešuje produkciju biofilma.
2. Sojevi vrste Escherichia coli nisu pokazali sposobnost produkcije biofilma u
ispitivanim podlogama. Dodavanje šećera nije uticalo na produkciju biofilma kod
ove vrste.
3. Ispitivanje sposobnosti produkcije biofilma kod vrste Candida albicans je pokazalo
da je za ovu svrhu podloga RPMI 1640 bolja od SDB. Sposobnost produkcije
biofilma kod kvasca nije bila proporcionalna količini dodate glukoze.
4. Za kultivaciju biofilma stafilokoke preporučuje se dodavanje glukoze i korišćenje
TSB kao podloge, dok se za kvasce preporučuje upotreba RPMI 1640 i
preliminarno ispitivanje optimalnih koncentracija šećera za pojedinačne sojeve (sa
kojima se u datom trenutku radi produkcija biofilma).
Master rad Nikola Mladenović
38
6. LITERATURA
Beech, I.B., Sunner, J.A., Arciola, C.R., Cristiani, P., 2004: Microbially-influenced
corrosion: damage to prostheses, delight for bacteria. -Int J Artif Organs 29: 443-52.
Costerton, J.W., Lewandowski, Z., Caldwell, D.E., Korber, D.R., Lappin-Scott,
H.M., 1995: Microbial biofilms.- Annual Review of Microbiology 49: 711–745.
Costerton, J.W., Stewart, P.S., Greenberg, E.P., 1999: Bacterial biofilms: a common
cause of persistent infections. – Science 1999 284: 318-322.
Costerton, J.W., Veeh, R., Shirtliff, M., Pasmore, M., Post, C., Ehrlich, G., 2003: The
application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections.
-J Clin Invest 112: 1466-77.
Debra, W. J., Jerry, W. S., Tony, R., 2002: Catabolite Repression of Escherichia
coli Biofilm Formation. -Journal of Bacteriology 12: 3406-3410.
Donlan, R. M., 2008: "Biofilms on central venous catheters: is eradication possible?"
- Current Topics in Microbiology and Immunology 322: 133-161.
Donlan, R.M., 2001: Biofilms and device associated infections. - Emerging Infectious
Diseases journal 7 :2777–2781.
Donlan, R.M., 2001: Biofilms microbial life on surfaces. -Emerging Infectious
Diseases journal 8: 881–890.
Master rad Nikola Mladenović
39
Donlan, R.M., 2002: Biofilms: Microbial Life on Surfaces. -Emerg Infect Dis 8(9):
881-90.
Donlan, RM., Costerton, J.W., 2002: Biofilms: survival mechanisms of clinically
relevant microorganisms. - Clin Microbial Rev 15: 167-93.
Durack, D.T., 1975: Experimental bacterial endocarditis. - IV Structure and evolution
of very early lesions. J Pathol 115: 81–89.
Flemming, H.C., 1991: Biofilms as particular forms of microbial life. -Biofouling and
Biocorrosion in Industrial water Systems (Eds: Flemming HC, Geesey GG),
Springer, Heidelber: 5-11.
Gotz, F., 2002: Staphylococcus and biofilms. -Mol Microbiol 43(6): 1367-78.
Greenberg, EP., 2003: Bacterial communication and group behavior. -J Clin Invest
112: 1288-90.
Hall-Stoodley, L., Costerton, J.W. and Stoodley, P., 2004: "Bacterial biofilms: from
the natural environment to infectious diseases. -Nature Reviews Microbiology 2: 95-
108.
Hentzer, M., Givskov, M., 2003: Pharmacological inhibition of quorum sensing for
the treatment of chronic bacterial infections. - J Clin Invest 112: 1300-7.
Joana, M., Luciana, G., Joan, M., Luis, F.M., 2013: The effect of glucose
concentration and shaking conditions on Escherichia coli biofilm formation in
microtiter plates. – Chemical enginnering science 94: 192-199.
Master rad Nikola Mladenović
40
Karakačević, B., 1987: Mikrobiologija i parazitologija.- Medicinska knjiga, str. 767-
780, Beograd-Zagreb.
Kostakioti, M., Hadjifrangiskou, M., Hultgren, S.J., 2013: Bacteriali biofilm:
development, dispersal and therapeutic stratedies in the dawn of the postantibiotic
era. –Cold Spring Harb Perspect Med. 2013.
Lappin- Scott H. M., and J. W. Costerton., 1992: Ultramicrobacterial and their
biotehnological applications. – Curr. Onin. Biotechnol. 3: 283-285.
Mah, T.F., O'Toole, G.A., 2001: Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial
agents. -Trends Microbiol 9: 34-9.
Maira-Litran, T., Allison, D.G., and Gilbert, P., 2000: An evolution of potential role
of multiple antibiotic resistance operon (mar) and multi-drug efflux pump acrAB in
the resistance of E.coli biofilms towards ciprofloxacin. -J Antimicrob Chemother
45:789-795.
Morris, A., J.D. Kellner., and D.E. Low., 1998: The superbugs: evolution,
dissemination and fitness. -Curr Opin Microbiol 1(5): 524-9.
O’Toole, G., Kaplan, H.B., Kolter, R., 2000: Biofilm formation as microbial
development. Annual Review of Microbiology 54: 49-79.
Prakash, B., Veeregowda, B.M., Krishnappa, G., 2003: Biofilms: a survival strategy
of bacteria. -Curr Sci 85: 1299-307.
Ramage, G., Vande-Walle, K., Wickes, B.L., Lopez-Ribot, J.L., 2001: Standardized
method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. -
Antimicrobial Agents and Chemotherapy 45: 2475–2479.
Master rad Nikola Mladenović
41
Ramage, G., Vande-Walle, K., Wickes, B.L., Lopez-Ribot, J.L., 2001: Characteristics
of biofilm formation by Candida albicans. - Annual Review of Microbiology 18:
163–170.
Sarah, E. C., Christiane, G., Norbert, F. S., Wright, W. N., Friedrich, G., 1999: The
Intercellular Adhesion (ica) Locus Is Present in Staphylococcus aureus and Is
Required for Biofilm Formation. – Infection and Immunity: 5427-5433.
Sarden, C., Ruud, H. D., Marie-Louise, L. B., Patrick, S. B., Cees, N., Ellen, E. S.,
2009: Staphylococcus aureus biofilm formation at the physiologic glucose
concentration depends on the S. aureus lineage. – BMC Microbiology 9: 229.
Schwermer, C.U., Lavik, G., Abed, R.M., et al., 2008: "Impact of nitrate on the
structure and function of bacterial biofilm communities in pipelines used for injection
of seawater into oil fields". -Applied and Environmental Microbiology 74 (9): 2841–
51.
Spoering, A.L., Lewis, K., 2001: Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas
aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials -Journal of
Bacteriology 183: 6746-51.
Stewart, P.S., Costerton, J.W., 2001: Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. -
Lancet 358:135-8.
Suci, P.A., Mittelman, M.W., Yu, F.P., and Geesey, G.G., 1994: Investigation of
ciprofloxacin penetration into Pseudomonas aeruginosa biofilms. -Antimicrob Agents
Chemothe 38: 2125–2133.
Sutherland, I.W., 2001: Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework.
–Microbiology 147: 3–9.
Master rad Nikola Mladenović
42
Tolker-Nielsen, T., Brinch, U.C., Ragas, P.C., Andersen, J.B., Jacobsen, C.S., Molin,
S., 2000: Development and dynamics of Pseudomonas sp. biofilms. -J Bacteriol 182:
6482–6489.
Tunney, M.M., Jones, D.S., Gorman, S.P., 1999: Biofilm and biofilm-related
encrustations of urinary tract devices. In: Doyle RJ, editor. Methods in enzymology,
vol. 310. Biofilms. -San Diego: Academic Press: 558–566.
Yong, L., Malabendu, J., Thang, T. L., Chia, Y. L., 2003: Control of Glucose- and
NaCl-Induced Biofilm Formation by rbf in Staphylococcus aureus. - Journal of
bacteriology 186: 722-729.
http://cit.vfu.cz/alimentarni-onemocneni/xsa/xsa01.jpg
https://en.wikipedia.org/wiki/Biofilm
https://en.wikipedia.org/wiki/Candida_albicans
https://www.studyblue.com/notes/note/n/bio222-lab-study-guide-2012-
13brofife/deck/9714210
ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Редни број, РБР:
Идентификациони број, ИБР:
Тип документације, ТД: Монографска
Тип записа, ТЗ: текстуални / графички
Врста рада, ВР: Мастер рад
Аутор, АУ: Никола Младеновић
Ментор, МН: Зорица Стојановић Радић
Наслов рада, НР: Способност продукције биофилма од стране одабраних сојева
микроорганизама
Језик публикације, ЈП: Српски
Језик извода, ЈИ: Енглески
Земља публиковања, ЗП: Р. Србија
Уже географско подручје, УГП: Р. Србија
Година, ГО: 2015.
Издавач, ИЗ: ауторски репринт
Место и адреса, МА: Ниш Вишеградска 33.
Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)
42 страна, 2 табелe, 6 слика, 8 графика
Научна област, НО: Биологија
Научна дисциплина, НД: Микробиологија
Предметна одредница/Кључне речи, ПО: биофилм, глукоза, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans
УДК 579.222
Чува се, ЧУ: Библиотека
Важна напомена, ВН:
Извод, ИЗ: Циљ мастер рада је био да се испита способност продукције биофилма
одабраних сојева микроорганизама у односу на тип подлоге и
концентрацију додатог шећера глукозе. Тестирани сојеви су део колекције
Микробиолошке лабораторије Природно-математичког факултета, при
чему је тестирано више сојева неколико врста патогених микроорганизама
и то: Staphylococcus aureus, Esherichia coli i Candida albicans.
Концентрације шећера коришћене у експерименту износиле су 0%, 0.25%,
0.5% i 1%.
Датум прихватања теме, ДП: 23.09.2015.
Датум одбране, ДО:
Чланови комисије, КО: Председник: др Татјана Михаjилов-Крстев, ванредни професор ПМФ-а у Нишу
Члан: др Наташа Јоковић, доцент ПМФ-а у Нишу
Члан, ментор: др Зорица Стојановић-Радић, доцент ПМФ-а у Нишу
Образац Q4.09.13 – Издање 1
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO:
Identification number, INO:
Document type, DT: Monograph
Type of record, TR: Textual/graphic
Contents code, CC: Master thesis
Author, AU: Nikola Mladenović
Mentor, MN: Zorica Stojanović Radić
Title, TI: Biofilm-forming ability of selected microbial strains
Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: Engish
Country of publication, CP: Republic of Serbia
Locality of publication, LP: Serbia
Publication year, PY: 2015.
Publisher, PB: Autor’s reprint
Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.
Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)
42 pages, 2 tables, 6 pictures, 8 graph
Scientific field, SF: Biology
Scientific discipline, SD: Microbiology
Subject/Key words, S/KW: biofilm, glucose, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans
UC 579.222
Holding data, HD: Library
Note, N:
Abstract, AB: The aim of the master thesis was to examine the ability of the selected
strains of microorganisms to produce the biofilm in relation to the type of
substrate and concentration of added glucose. The tested strains are part of
a collection of the Laboratory of Microbiology of the Faculty of Sciences and
Mathematics in Niš, where multiple strains of several species of pathogenic
microorganisms were tested: Staphylococcus aureus, Escherichia coli and
Candida albicans. The concentrations of the glucose used in the experiment
were 0%, 0.25%. 0.5% and 1%.
Accepted by the Scientific Board on, ASB: 23.09.2015.
Defended on, DE:
Defended Board, DB: President: PhD Tatjana Mihajilov-Krstev, Associate Professor, Faculty of Science in Nis
Member: PhD Nataša Joković, Assistant Professor of Science in Nis
Member, Mentor: PhD Zorica Stojanović-Radić, Assistant Professor of Science in Nis
Образац Q4.09.13 - Издање 1