Syngene Transplantation regenerativer Fettgewebszellen nach experimentellem Schlaganfall in der spontanhypertensiven Ratte
Syngene Transplantation regenerativer Fettgewebszellen nach experimentellem Schlaganfall in der spontanhypertensiven Ratte
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Medizin (Dr. med.)
an der Medizinischen Fakultt
der Universitt Leipzig
eingereicht von: Sapida Safdari
Geboren am: 12.12.1983 in Kabul
angefertigt am: Institut fr klinische Immunologie, Universitt Leipzig
in Zusammenarbeit mit dem Fraunhofer Institut fr Zelltherapie und
Immunologie, Leipzig
Betreuer: Prof. Dr. med. Frank Emmrich
Beschluss ber die Verleihung des Doktorgrades vom: 23.09.2014
Fr meinen Vater Anwar
Inhaltsverzeichnis
Bibliografische BeschreibungI
AbbildungsverzeichnisII
TabellenverzeichnisIII
AbkrzungsverzeichnisIV
1. Einleitung1
1.1. Der Schlaganfall1
1.2. Stammzellen9
1.3. Adipose Tissue Derived Cells (ADC)13
1.4. STAIR-Kriterien14
1.5. Fragestellung der Dissertation15
2. Material und Methoden17
2.1. Materialliste17
2.2. Studiendesign20
2.3. Ein- und Ausschlusskriterien21
2.4. Versuchsablauf22
2.5. Versuchstiere22
2.6. Fettgewebsentnahme23
2.7. Isolation23
2.8. Schlaganfall27
2.9. Transplantation29
2.10.Verhaltenstests30
2.11. Magnetresonanztomographie33
2.12. Ttung und Perfusion36
2.13. Statistik36
3. Ergebnisse37
3.1. Pilotversuch der Zellisolierung37
3.2. Ausschlusskriterien und Auswirkungen auf die Versuchstierzahl39
3.3. Ergebnisse des experimentellen Schlaganfalles40
3.4. Zellisolierung41
3.5. Ergebnis der Transplantation42
3.6. Ergebnisse der Verhaltenstests43
3.7. Ergebnisse der MRT-Messungen46
4. Diskussion49
4.1. Methodendiskussion49
4.2. Therapeutische Wirksamkeit von ADC53
4.3. Studienqualitt57
4.4. Beantwortung der Fragen an die Arbeit58
4.5. Ausblick59
ZusammenfassungVI
LiteraturverzeichnisVIII
Erklrung auf die eigenstndige Abfassung der ArbeitXIII
LebenslaufXIV
DanksagungenXVI
Bibliografische Beschreibung
Safdari, Sapida
Syngene Transplantation regenerativer Fettgewebszellen nach experimentellem Schlaganfall in der spontanhypertensiven Ratte.
Universitt Leipzig, Dissertation zur Erlangung des Titels Doktor der Medizin
60 Seiten, 123 Literaturverweise, 19 Abbildungen, 14 Tabellen
Der Schlaganfall gehrt weltweit zu den hufigsten Todesursachen und ist die Hauptursache von Langzeitbehinderungen im Erwachsenenalter. Die derzeitige Behandlung des Apoplex besteht aus der Lysetherapie mit Alteplase. Diese ist jedoch nur zeitlich beschrnkt einsetzbar und birgt Risiken. Neue Behandlungsanstze zur Heilung des Schlaganfalles, wie zum Bespiel medikamentse Neuroprotektiva oder Zelltherapien, zeigten vielversprechende Ergebnisse in diversen, prklinischen Studien. Dennoch konnte sich bisher keines dieser Therapieverfahren in der Klinik durchsetzen. Die vorliegende Studie berprft die Wirksamkeit einer heterogenen Zellpopulation aus dem Fettgewebe spontanhypertensiver Ratten nach syngener Transplantation. Aufgrund der einfachen Zellgewinnung stellt das Fettgewebe eine neue, vielsprechende Alternative fr die Schlaganfalltherapie dar. In der aktuellen Studie wurden 64 spontanhypertensive Ratten in den Versuch eingeschlossen, von denen 32 Tiere einem experimentell ausgelsten Schlaganfall durch Okklusion der mittleren Zerebralarterie unterzogen worden sind. Zur funktionellen berwachung neurologischer Defizite wurden verschiedene Verhaltenstests durchgefhrt und die Tiere in einem Zeitraum von 86 Tagen beobachtet. Als bildgebende Diagnostik wurde die Magnetresonanztomographie eingesetzt. Sowohl in den Verhaltenstests als auch im MRT zeigte die heterogene Fettgewebspopulation keinen therapeutischen Effekt. Die Arbeit diskutiert mgliche Ursachen dieses Ergebnisses und geht dabei auf wesentliche pathophysiologische Aspekte des Schlaganfalls, auf die angewandte Methodik, sowie die Zellpopulation an sich detailliert ein.
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Pathophysiologische Vorgnge nach einem Schlaganfall3
Abbildung 2: Zeitlicher Verlauf der pathophysiologischen Vorgnge nach einem Apoplex6
Abbildung 3: Prinzip einer Stammzelle10
Abbildung 4: Pluripotente Stammzelle11
Abbildung 5: Versuchsablauf22
Abbildung 6: CFU-F-Kolonie26
Abbildung 7: Prinzip der MCAO29
Abbildung 8: Der Ladder Rung mit einer SHR33
Abbildung 9: MRT-Untersuchungen34
Abbildung 10: Auswertung der MRT-Befunde35
Abbildung 11: Ergebnisse der Zellzahl und Zellvitalitt im Pilotversuch37
Abbildung 12: CFU-F Anteil im Pilotversuch fr n=1038
Abbildung 13: Ergebnisse der ersten FACS- Analysen fr n=1039
Abbildung 14: Anteil der untersuchten Oberflchenmarker im Hauptversuch fr n=342
Abbildung 15: Ergebnisse des Beamwalks44
Abbildung 16: Ergebnisse des mNSS45
Abbildung 17: Ergebnisse des Ladder Rung-Tests46
Abbildung 18: Infarktorganisation im Zeitverlauf47
Abbildung 19: Hirndem (eSOE) und das dem-korrigierte Lsionsvolumen (eVLsion)47
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Ergebnisse der Interstroke-Studie aus dem Jahr 20101
Tabelle 2: Bisher eingesetzte Stammzellpopulationen13
Tabelle 3: bersicht der Materialien17
Tabelle 4: Oberflchenmarker26
Tabelle 5: Beamwalk-Test Kategorien30
Tabelle 6: Auswertungskriterien des mNSS31
Tabelle 7: Auswertungskriterien des Foot Fault Score32
Tabelle 8: Auswertungskriterien des Forepaw Digit Score33
Tabelle 9: Ergebnisse der FACS-Analysen im Pilotversuch38
Tabelle 10: Ausschlusskriterien fr den Versuch39
Tabelle 11: Zusammenfassung der physiologischen Parameter whrend der OP40
Tabelle 12: Ergebnisse der Zellzhlung bei der Isolierung im Hauptversuch41
Tabelle 13: Transplantationsdosis42
Tabelle 14: Infarktvolumina der Kontroll- und Therapietiere in mm47
Abkrzungsverzeichnis
Grad
CGrad Celsius
ADCAdipose Tissue-Derived Cells
ADRCAdipose Tissue-Derived Stem and Regenerative Cells
ASCAdult Stem Cells
AUC Area under the curve
BM MNCBone Marrow Derived Mononuclear Cells
BSA Bovines Serumalbumin
CBFCerebral Blood Flow
CD Cluster of Differentiation
CFU-FColony Forming Units for Fibroblasts
cmZentimeter
cm Quadratzentimeter
CO2 Kohlenstoffdioxid
DMEM Dulbeccos Modified Eagle Medium
DWIdiffusionsgewichtete Sequenz im MRT
EEGElektroenzephalografie
engl.englische Bezeichnung
ESCEmbryonic Stem Cells
FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
FKS Fetales Klberserum
FSCFetal Stem Cells
G-CSFGranulocyte-Colony Stimulating Factor
g Gramm
x g mittlere Erdschwerebeschleunigung
HGF Hepatocyte Growth Factor
HUCB MNC Human Umbilical Cord Blood Mononuclear Cells
i.v. intravenous
iPSCinduced Pluripotent Stem Cells
IGF1 Insulin-like Growth Factor 1
IL-1/-6 Interleukin 1/6
KG Krpergewicht
kg Kilogramm
MMPMatrixmetalloproteasen
MCAO Middle Cerebral Artery Occlusion
min Minute
ml Milliliter
mmMillimeter
mmKubikmillimeter
mMikrometer
mNSS modified Neurological Severity Score
MRT Magnetresonanztomographie
MSC Mesenchymal Stromal Cells
MW Mittelwert
PPilotversuch
PAR population attributable risk
PBS Phosphate Buffered Saline
PLA cellsProcessed Lipoaspirate Cells
rt-PA recombinant tissue-Plasminogen Activator
sSekunden
SHR spontanhypertensive Ratten
STAIR Stroke Treatment Academic and Industry Roundtable
T Tesla
TxTransplantation
T2 Bildgebungsmodus im MRT
TNF Tumornekrosefaktor
VVergleich aus anderen Rattenstmmen/Vorversuche
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
V
1. Einleitung1.1. Der Schlaganfall1.1.1 Ursache und Risikofaktoren des Schlaganfalls
Der Schlaganfall gehrt zu den weltweit hufigsten Todesursachen und ist die Hauptursache fr dauerhafte Behinderung im Erwachsenenalter. Die Inzidenz des Schlaganfalles nimmt mit hherem Lebensalter zu. Schtzungsweise 25% der ber 85-jhrigen erleiden einen ischmischen Insult. In 85% der Flle wird die Ischmie durch eine Unterversorgung des Gehirns mit Blut hervorgerufen (1-3). In 15% der Flle tritt eine zerebrale Blutung auf (4). Als Ursachen des ischmischen Schlaganfalls gelten zerebrale Makro- und Mikroangiopathien sowie kardiale und hmodynamische Erkrankungen. Der wichtigste Faktor ist hierbei die Arteriosklerose der hirnversorgenden Gefe. Sie fhrt durch die Ausbildung von Plaques zu Stenosen und Okklusionen. Hierbei ist meistens die Karotisgabel betroffen (4). Die Thrombembolie ist eine weitere Ursache des zerebrovaskulren Verschlusses. Sie kann unter anderem kardialen Ursprungs sein. Kardiale Hirnembolien treten hufig im Rahmen von Herzrhythmusstrungen oder Herzvitien auf. Weiterhin kann sich ein Schlaganfall als Komplikation von entzndlichen Erkrankungen, Autoimmunprozessen, wie zum Beispiel entzndlichen Darmerkrankungen, Vaskulitiden, Rheumatoider Arthritis oder einem Antiphospholipidsyndrom manifestieren (3). Zu den Risikofaktoren des Schlaganfalls zhlen unter anderem die arterielle Hypertonie, der Diabetes mellitus, das Rauchen und die a