Synteza związków znakowanych i ich zastosowanie w chemii organicznej,
biochemii i medycynie
Część II
Prof. dr hab. Marianna Kańska
Metody syntezy związków znakowanych izotopami
1. Prosta synteza chemiczna.
2. Synteza na drodze wymiany izotopowej.
3. Synteza metodą atomów odrzutu.
4. Synteza w wyniku rozpadu β (beta).
5. Biosynteza.
6. Syntezy metodami enzymatycznymi.
W praktyce podstawowe znaczenie ma prosta synteza chemiczna, biosynteza, synteza metodą wymiany izotopowej i metody enzymatyczne.
Właściwości syntezy związków znakowanych
Synteza związków znakowanych ma swoje specyficzne właściwości.
1. Substancją wyjściową do syntezy nie jest dowolny, najbardziej odpowiedni związek, lecz związek otrzymywany w procesie produkcji izotopu.
2. Ilości substancji stosowane do syntezy są małe, ponieważ ilości izotopu promieniotwórczego jest ograniczona, a rozcieńczenie substancją nieaktywną jest niepożądane, gdyż prowadziłoby do zmniejszenia aktywności właściwej.
3. Ze względu na mikroskalę należy stosować specjalne techniki.
4. Podczas reakcji występują efekty radiacyjne.
5. Czas syntezy powinien być krótki.
Właściwości syntezy związków znakowanych (c. d.)
6. Nie powinno być reakcji ubocznych.
7. Syntezę należy prowadzić w warunkach odpowiadającym przepisom BHP.
8. Należy opracować warunki syntezy na związkach nieaktywnych tzn. przeprowadzić syntezę zimną.
a) W celu opracowania warunków syntezy.
b) W celu ustalenia totalnej wydajności:
- chemicznej,- radiochemicznej.
Jednostki
tradycyjne: 1 Ci = 3,7 x 1010 rozp./sec
1 mCi = 3,7 x 107 rozp./sec
1 µCi = 3,7 x 104 rozp./sec
w układzie SI: 1 Bq = rozp./sec i wielokr. np. MBq = 106 Bq, GBq = 109 Bq
W wyniku pomiaru w otrzymujemy wynik w CPM (count per minute) lub w DPM (decay per minute).
Aktywność właściwa
Aktywność na jednostkę masy np. mCi/mg, MBq/gAktywność molowa jest to aktywność przypadająca na jeden mol, milimol, mikromol. Np. mCi/mole, DPM/mmole, MBq/mmol
Okres połowicznego rozpadu - T1/2
Jest to czas po upływie którego aktywność próbki zmniejsza się o połowę.
Synteza metodą wymiany izotopowej
• Wymianę izotopową stosuje się do otrzymywania związków organicznych znakowanych izotopami wodoru, węgla, siarki i fluorowców.
• W celu przeprowadzenia syntezy należy zapewnić kontakt pomiędzy wymieniającymi się substancjami, a następnie je rozdzielić.
• Metodą wymiany izotopowej można otrzymać takie związki, które nie można zsyntezować na drodze klasycznej syntezy organicznej.
• Metodą wymiany izotopowej tylko w bardzo rzadkich przypadkach można znakować związek w ściśle określonym miejscu.
Nomenklatura związków znakowanych
Stosuje się nazewnictwo związków zgodnie z regułami Konwencji Genewskiej. Podaje się przy tym położenie danego izotopu w cząsteczce. Korzysta się przy tym z niepełnego symbol chemicznego izotopu (14C, 13C, 125I, 2H, 3H itd.). Dla izotopów wodoru jest dopuszczalne użycie zamiast
2H – D (deuter) i 3H – T (tryt)
Gdy pozycja izotopu jest nieokreślona używa się następujących oznaczeń, jak np.
Kwas 14C-propionowy
Kwas 3H-ascorbinowy
Nomenklatura związków znakowanych c.d.
W przypadku związków znakowanych izotopami wodoru lub węgla, gdzie atomy
danego izotopu są rozmieszczone w sposób przypadkowy po całym pierścieniu,
dopuszcza się jeszcze inny sposób zapisu.
COOH
NH2
[ring -14C]-L-fenyloalanina
COOH
NH2
[U- 14C]-L-fenyloalanina (U-uniformely)
Gdy atomy 14C są w przypadkowy sposób rozmieszczone w całej cząsteczce to:
Nomenklatura związków znakowanych c.d.
Podobnie dla związków znakowanych izotopami wodoru
COOH
NH23H
[ring-3H]-L-fenyloalanina
Związki równomiernie (niespecyficznie) 14C lub izotopami wodoru
otrzymuje się głównie metodami klasycznej syntezy chemicznej lub w
wyniku biosyntezy. Wówczas w pożywce dla bakterii lub glonów
znajduje się 14CO2 lub woda trytowana, HTO lub deuterowana - DHO
lub D2O.
Nazewnictwo specyficznie znakowanych związków
Rozpatrzymy to na przykładzie L-fenyloalaniny
COOH
NH2
[1-14C]-L-fenyloalanina – [114-C]-L-Phe
COOH
NH2 * = 14C
[3-14C]-L-Phe
COOH
NH2
3H
3H
[2’,6’-3H2]-L-Phe
Nazewnictwo specyficznie znakowanych związków c.d.
COOH
NH2
3H HCOOH
NH2
H 3H
[3R-3H]-L-Phe [3S-3H]-L-Phe
Związki znakowane podwójnie
3H14COOH
Kwas 3-fenylo-[3-3H, 1-14C]-prop-2-enowylub
Kwas [3-3H, 1-14C]-cynamonowy
Wymiana izotopowa
Metoda wymiany izotopowej jest szeroko stosowana do otrzymywania związków organicznych znakowanych izotopami stabilnymi lub radioaktywnymi. Polega ona na zapewnieniu kontaktu między dwoma wymieniającymi się substancjami. Stosuje się przy tym podwyższoną temperaturę, katalizatory itp. Tą metodą nie zawsze otrzymuje się związki znakowane selektywnie Głównie stosuje się wymianę izotopowa do otrzymania związków znakowanych izotopami fluorowców lub wodoru. Fluorowce (Cl2, Br2, I2), kwasy fluorowcowodorowe (HCl, HBr, HI) oraz ich sole alkaliczne łatwo wchodzą w reakcję wymiany z fluorowco-pochodnymi węglowodorów. Wymianę prowadzi się w roztworze lub w stanie stopionym. I tak np.
RX + X2 R X + XX
C2H5Br + Ag82Br → C2H582Br + AgBr
Wymiana izotopowa c. d.
Za pomocą Li36Cl otrzymuje się chlorki alkilowe (butylu, heksylu) oraz 36Cl-chlo-robenzen
Cl + Li36Cl∆
CuO36Cl + LiCl
Otrzymywanie związków znakowanych 14C
CH314COONa + CH3COCl → CH3COONa + CH3
14COCl
14CO2 + KCN → K14CN + CO2
Otrzymywanie związków znakowanych 35S
(NH4)2CS + 35S → (NH4)2C35S + Stiomocznik
C6H5SH + 35S → C6H5 35SH + S
Znakowanie izotopami wodoru
Otrzymanie związków organicznych znakowanych izotopami wodoru w miejscach labilnych (gdy atom wodoru jest związany z atomem azotu tlenu, siarki) nie stanowi problemu, gdyż wymiana następuje szybko podczas prostego kontaktu np. z wodą deuterowaną czy trytowaną. Jednak związki znakowane w miejscach labilnych nie przedstawiają większej wartości w badaniach chemicznych, ze względu na odwrotną wymianę izotopową i stratę atomów znaczonych.
Wymiana atomów trytu czy deuteru w pozycjach trwałych (tj. związanie go z atomem węgla w szkielecie cząsteczki) następuje w specyficznych warunkach. Wymiana może przebiegać w podwyższonej temperaturze, w warunkach katalizy kwaśnej lub zasadowej, często też stosuje się jako katalizator sole platynowców.
Metoda Wiltzbacha
Do wprowadzenia trytu w skład cząsteczki stosuje się pewien rodzaj wymiany izotopowej zwanej Wiltzbacha metodą. Związek organiczny poddawany znakowaniu, rozpylony jest w postaci cieńkiego filmu na ścianach naczynia, poddaje się działaniu gazowego 100% trytu. W wyniku rekcji rozpadu jednego atomu trytu w cząsteczce gazowej powstaje
bardzo reaktywne indywiduum: T T β −
Τ 3He
które wchodzi w reakcje ze związkiem poddawanym znakowaniu, RH wg reakcji:
Τ 3He
T + 3He
RX+ RT + 3He + H
Wadą tej metody jest jej niespecyficzność, otrzymuje się [U-3H]-RH. Ze względu na czas prowadzenia syntezy trzeba uwzględnić straty związane z radiolizą RH oraz opracować metody oczyszczenia RX od produktów radiolizy.
Synteza związków znakowych trytem
Tryt na skalę przemysłową otrzymuje się:- w postaci trytku uranu- w postaci wody trytowej- trytu
Tryt w trytku uranu nie zawiera protu (jest preparatem beznośnikowym).Woda trytowa jest rozcieńczana wodą zwykłą, aby uniknąć znacznego rozkładu wody trytowej pod wpływem własnego promieniowania (autoradioliza). Tryt wprowadza się w skład cząsteczek organicznych metodą prostej syntezy chemicznej następującymi metodami:
1. Uwodornienie za pomocą trytu cząsteczkowego.2. Uwodornienie za pomocą wodorku litowo-glinowego.3. Hydroliza za pomocą wody trytowej.4. Hydratacja.
Synteza związków znakowych trytem c.d.
• Atomy wodoru związane z tlenem, azotem, siarką w cząsteczkach organicznych są ruchliwe (labilne).
• Wprowadzenie trytu na miejsce ruchliwego (labilnego) wodoru w cząsteczce jest niepożądane, gdyż podczas badań taki atom trytu zostaje utracony w wyniku wymiany izotopowej z rozpuszczalnikiem.
• Związki takie nie mogą być wykorzystane do badania mechanizmu reakcji i kinetyki.
• Trudno ruchliwy (nielabilny) wodór występuje w węglowodorach i grupach węglowodorowych.
• Dlatego też podstawowym zadaniem przy wprowadzeniu atomu trytu w skład cząsteczek jest otrzymanie węglowodorów i ich pochodnych.
Synteza związków znakowych trytem c.d.
Węglowodory znakowane trytem otrzymuje się:
• Przez uwodornienie węglowodorów nienasyconych gazowym trytem w obecności katalizatora.
• Przez redukcję dwutlenku węgla gazowym trytem.
Z wody trytowej:
• otrzymuje się [3H]-metan w wyniku rozkładu węgliku glinu przez HTO, • [3H]- acetylen w wyniku rozkładu acetylenku wapnia przez HTO.
• Z odczynnika Grignarda w wyniku rozkładu przez HTO otrzymuje się różnego rodzaju węglowodory alifatyczne oraz cykliczne.
Metoda atomów odrzutu tzw. „synteza gorąca”
Metoda polega na reakcji tzw. atomów odrzutu z otaczającymi je cząsteczkami. Atom odrzutu (posiadający dużą energię kinetyczną) powstaje w wyniku rozpadu promieniotwórczego. Wówczas z jądra atomu wylatuje lekka cząsteczka (neutron, elektron, α-cząstka) a jądro powstającego pierwiastka jest “odrzucane” w stronę przeciwną otrzymując równoważną porcje energii kinetycznej. Atomy odrzutu, w wyniku reakcji jądrowej, są też wzbudzone na powłokach elektronowych, a więc bardzo reaktywne. Do znakowania związków trytem wykorzystuje się reakcję:
6Li(n, α)3H
W reaktorze sole litu (Li2CO3, Li2SO4, LiF) w mieszaninie ze związkiem organicznym napromieniowuje się w strumieniu wolnych neutronów. W trakcie syntezy 30-50% atomów trytu stabilizuje się w postaci wodoru cząsteczkowego, H3H, 10-50% podstawia wodór w związku organicznym, a reszta stabilizuje się w postaci innych związków.
Metoda atomów odrzutu tzw. „synteza gorąca” c.d.Znakowanie węglem
Do znakowania 14C stosuje się związki zawierające azot, lub mieszaniny związków organicznych z substancjami zawierającymi azot. Wykorzystuje się reakcję:
14N(n,p)14C
Ze względu na duży ciężar, nie wszystkie atomu 14C opuszczają cząsteczkę.
Przy znakowaniu siarką stosuje się reakcję:
35Cl(n,p)35S
Przy znakowaniu fluorowcami , korzysta się z reakcji:
MX(n, γ)M+1X
Atomy odrzutu fluorowców podstawiają atomy wodoru lub grupy atomów w związkach organicznych. Tak otrzymuje się związki znakowane 38C, 82Br, 128I.
Metoda atomów odrzutu tzw. „synteza gorąca” c.d.Zalety metody
Możliwość otrzymania związku w jednym etapie. Odpada wiele żmudnych, wieloetapowych syntez.
• Uniwersalność metody.• Możliwość otrzymania związków beznośnikowych.• W jednym procesie można otrzymać dużą ilość związku.• Z dobrą wydajnością otrzymuje się związki znakowane izotopami krótkożyciowymi.
Wady
• Nie można otrzymać związków specyficznie znakowanych.• Trudności w wydzieleniu i oczyszczeniu znakowanych związków.• Synteza musi być prowadzona w silnym strumieniu neutronów (kanał reaktora
Synteza związków znakowanych 14C
Substratem do tej syntezy jest Ba14CO3, który otrzymuje się w reaktorze w wyniku napromieniowania azotku berylu. Wykorzystuje się reakcję jądrową:
14N(n, p)14C
Z Ba14CO3 otrzymuje się pięć podstawowych związków będących substratami do dalszej syntezy. Są to: 14CO2; K14CN; NH2
14CN (cyjanoamid); 14C2H2; 14CH3OH
14CO2 otrzymuje się przez rozkład Ba14CO3:
Ba14CO3HClO4
lub H2SO4
14CO2
14C-cyjanoamid otrzymuje się działając amoniakiem na Ba14CO3 w temp. 850oC:
Ba14CO3NH3
850 CoNH2
14CN
Synteza związków znakowanych 14C c. d.
14C-acetylen otrzymuje się przez redukcję Ba14CO3 magnezem i rozkład
wodą powstałego 14C-węglika baru:
Ba14CO3Mg
∆Ba14C2
14C2H2H2O
14C-metanol otrzymuje się przez redukcję 14CO2 przy pomocy LiAlH4:
14CO214CH3OH
LiAlH4
Synteza 14C-alkanówSynteza 14C-metanu
14CO2H2kat.
14CH4
14CO2LiAlH4
14CH4
14CH3OH14CH3I 14CH3MgI
MgHI
H+
Synteza [1,2-14C2]-propanu14C2H2
14C2H414C2H5I 14C2H5MgI
14C2H5COOH14CH314CH2CH2OH
14CH314CH2CH2OTs
14CH314CH2CH3
Cr+2, H+
RT
HI Mg
CO2LiAlH4
p-MeC6H4SO3H NaBH4
[1,2-14C2]-propan
Synteza 14C-alkanówSynteza 14C-metanu
14CO2H2kat.
14CH4
14CO2LiAlH4
14CH4
14CH3OH14CH3I 14CH3MgI
MgHI
H+
Synteza [1,2-14C2]-propanu14C2H2
14C2H414C2H5I 14C2H5MgI
14C2H5COOH14CH314CH2CH2OH
14CH314CH2CH2OTs
14CH314CH2CH3
Cr+2, H+
RT
HI Mg
CO2LiAlH4
p-MeC6H4SO3H NaBH4
[1,2-14C2]-propan
Synteza aminokwasów deuterowanych lub trytowanych w pozycji α
(inkorporacja deuteru lub trytu z rozpuszczalnika)
Do syntezy gdzie A = D lub TCOOHC
A
NH2
R2
korzysta się z dekarboksylacji aminokwas dwukarboksylowego w środowisko HTO i stężonego HCl lub stężonego DCl (D2O).
R C NHCH(COOR1)2
O+ R2X
EtONa
EtOH, absR C NH-CR2(COOR1)2
O
+ HX+ HX
D2O, DCl
HTO, HClC
A
NH2
R2 COOH
1
Powstający carboanion RCONH-C(-)(COOR1)2 w reakcji z R2X daje produkt 1. Deacetylację i dekarboksylację 1 prowadzi się pod chłodnicą zwrotną ogrzewając 1 w ciągu 4 - 5 h w D2O (lub HTO) w obecności DCl lub D2SO4 (albo HCl lub H2SO4)
Dekarboksylacji ⊕NH3CR2(COOH)2 w D2O (lub HTO) do końcowego aminokwasu towarzyszy inkorporacja deuteru (lub trytu) ze środowiska reakcji w pozycję α.
Synteza [2-3H]-L-fenyloalaniny
CH2(COOH)2HTO
CHTCOOT
COOTHO
COOH
COOH
NH2
TPAL, NH4
+
pH 10
T
kwas[2-3H]-cynamonowy
[2-3H]-L-Phe
Enzymatyczna synteza L-tryptofanu i 5’-hydroksy-L-tryptofanu znakowanego izotopami wodoru w pozycji α
COOHNH2
S
R = -H or -OH
NH
RTPase (EC 4.1.99.1)
+NH
COOH
NH2R
D2O (HTO lub DTO)
D/T
(5'-R)-indol S-metyl-L-cysteina (5'-R)[2- D/ T]-L-Trp
Synteza [3R-3H]-L-fenyloalaniny
(PhCO)2HTOKCN
PhCTO CH2(COOH)2
COOH
PAL
COOH
NH2
H
benzil kwas[3-3H]-cynamonowy
[3R-3H]-Phe
T T
Synteza [3S-3H]-L-fenyloalaniny
COOH
NH2H
COOH
pH 10
[2S-3H]-L-Phe
PAL, NH4+, HTO
T
Synteza kwasu [1-14C]-cynamonowego
[1 -14C]cinnamic acid
ClCH2COOH ClCH2COONa
N
NaOH K 14CN
14CCH2COONa
14 OONa NaOHC
COONa
HCl
14C
COOH
OOHCaCl2
14C OO
COOCa
H+14C
COOH
OOH
14COOHO H
Synteza kwasu [2-14C]-cynamonowego
COOH
COOH
14CH2
O H
COOH
- CO2- H2O
14CH
kwas [2-14C]-cynamonowy
Synteza kwasu [3-14C]-cynamonowego
5 3
2
1
pH 8.7
H2CCOOH
COOH
YADH
14
LiAlH4
H3O+14CO2
MgBr14COOH
14COOMgBr
14CH2OH
O
HC
COOH
14C
kwas [3-14C]-cynamonowy
4
Synteza L-fenyloalaniny i L-tyrozyn znakowanych 14C w łańcuchu bocznym
[1-14C]-, [2-14C]- lub [3-14C]-L-Tyr
[1-14C]-, [2-14C]- lub [3-14C]-L-Phe kwas [1-14C]-, [2-14C]- lub [3-14C]-cynamonowy
COOHPAL
pH 10 NH3
COOH
NH3
COOH
HO
pH 6.8
* = 14C label
4'-monooksygenaza-L-fenyloalaninowa
Synteza [1-14C]-L-tryptofanui 5’-hydroksy-[1-14C]-L-tryptofanu
tryptophanase
NH
NH2R
R = H or OH
NH
R
OGPT
D-AAO/catalase
NH2
14COOH 14C
14COOH
OOH
[1-14C]-alanina kwas [1-14C]-pirogronowy
[1-14C]-L-Trp lub5'-OH-[1-14C]-L-Trp
Metody syntezy aldehydu [1- 14C ]-benzoesowego
HCl, SnCl2
HCl
NaCl, AlCl3∆ T
NH3
SOCl2
chinolina
HCN
MeOH
NH2NH2
PhSO2Clpirydyna
H2OH2SO4
Na2CO3
HOCH2CH2OH
H2O
N14C
COOH
OH
O
14CONHNHSO2Ph
N14C
CN
14CHO
14COCl
14CONHNN2
14COOMe
14CH=NH.HCl
14COOH
14CCl=NH
14CN
14CONH2
Syntezy aldehydu benzoesowego selektywnie znakowanego 14C.
14COOH14C 14CSOCl2 CH3OH
NH2NH2
14C14C14CNa2CO3
(CH2OH)2 C5H5NC6H5SO2Cl
OOCH3
ONHNH2ONHNHSO2PhHO
OCl
HCl
SnCl2
HCl
HCl14CH NH.14C 14CCl NHH2O
14COCl 14CONH2 14CNNH3
ogrzewanie. AlCl3NaCl
HO
Syntezy aldehydu benzoesowego selektywnie znakowanego 14C.
COOHN+
14CHO
H2SO4
H2O
NCN
14CHO HC6H5
+14COCl
HCNchinolina
OC6H514C
CN
H
N
Otrzymywanie benzaldehydu znakowanego równomiernie atomami 14C
CH3 CHO
H2SO4
Ce(SO4)2
Rozszczepienie dibenzylu do aldehydu i kwasu benzoesowego
DCN++CO2
-
D2O C
CN
O C
O..-
CO
D
C O C
CN
D O
C C
OO
CN
-
+ CN -C C
O O
Synteza kwasu [1-14C]-malonowego.
3. HCl
1. NaOH, ∆ Τ2. CaCl2
HCl14COOH
COOHN14CCH2COONa
o0 C
ClCH2COONaNa14CN
Synteza kwasu [1-14C]-cynamonowego poprzez reakcję Grignard’a
Et2O
BrMg
14CO2Ba14CO3
HOO14C